Um protocolo de extração de DNA de mosquito baseado em contas magnéticas para sequenciamento de próxima geração
15 de abril de 2021
Descrito aqui é um protocolo de extração de DNA usando contas magnéticas para produzir extrações de DNA de alta qualidade de mosquitos. Essas extrações são adequadas para uma abordagem de sequenciamento de próxima geração a jusante.
Este protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas amigável ao orçamento torna o sequenciamento de alto rendimento acessível a laboratórios e estudos limitados de recursos. Este protocolo não requer equipamentos caros para extração de DNA de alta qualidade e pode ser útil em certas situações de diagnóstico ou pesquisa onde a obtenção de uma quantidade suficiente de DNA com uma qualidade para sequenciamento de alto rendimento é um desafio. Este protocolo é fácil de replicar com uma demonstração única.
Ele deve ser experimentado com um pequeno número de amostras primeiro para se familiarizar com o fluxo de trabalho. Para começar, hidrate as amostras de tecido do mosquito armazenadas em mais de 70% de álcool adicionando 100 microliters de água de grau PCR e incubando por uma hora a quatro graus Celsius para suavizar o tecido. Após a incubação, descarte a água e adicione 100 microliters de proteinase K mistura de enzima tampão.
Em seguida, use um pilão de tubo de microcentrifuge para homogeneizar o tecido. Após a homogeneização, centrifugar o tecido lise e incubar por duas a três horas a 56 graus Celsius. Para extrair DNA, pipetas 100 microliters do tecido lysate em um novo tubo de microcentrifuge limpo.
Em seguida, adicione 215 microliters da mistura mestre de contas magnéticas. Com uma pipeta, misture o liseto e a mistura de contas magnéticas por 10 a 20 segundos e deixe-a descansar por 10 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, agite suavemente o tubo ocasionalmente para maximizar a ligação do DNA às contas magnéticas.
Em seguida, coloque o tubo no separador de contas magnéticas até que a solução fique clara. Em seguida, usando uma pipeta, aspire suavemente o líquido do tubo sem perturbar as contas magnéticas que seguram o DNA. Mova o tubo para longe do separador de contas magnéticas e lave as contas adicionando 325 microliters de tampão de lavagem um.
Misture bem por pipetar e incubar por um minuto à temperatura ambiente. Após a incubação, coloque o tubo no separador de contas magnéticas e remova o supernatante como demonstrado anteriormente, em seguida, mova o tubo para longe do separador de contas magnéticas e lave as contas uma vez com tampão de lavagem. Após a segunda lavagem com tampão, lave as contas duas vezes com 250 microliters de tampão de lavagem dois da mesma maneira.
Após a última lavagem, mova o tubo para longe do separador de contas magnéticas e adicione 100 microliters de tampão de elução. Misture bem por pipetar e, em seguida, incubar o tubo por dois minutos à temperatura ambiente antes de colocá-lo de volta no separador magnético. Quando a solução ficar clara, transfira o supernante para um novo tubo de microcentrífugo de 0,5 mililitro e armazene adequadamente.
Mostrado aqui como uma leitura típica do fluorômetro de microvolume do DNA do mosquito em um tampão de elução contendo 0,5 milimólares EDTA. A taxa média de absorção de 260 a 280 nanômetros é de 2,3. Esta tabela mostra os custos e o número de amostras processadas em um dia útil para diferentes métodos de extração.
O custo típico de reagente e consumível para uma extração por este protocolo é de cerca de 9,50 por amostra. Este custo é equivalente a qualquer método típico de extração baseada em contas magnéticas. O maior custo benefício deste protocolo vem da não exigência do instrumento automatizado de extração de DNA.
Certifique-se de alterar as pontas da pipeta entre as amostras para evitar a contaminação cruzada do DNA ao trabalhar com várias amostras. Usamos o DNA de alta qualidade extraído usando este método para sequenciamento de genoma inteiro. Atualmente estamos usando os dados de sequenciamento para identificar novas mutações na resistência a inseticidas ou genes imunológicos de preocupação na saúde pública e no controle de doenças.
Ter soluções acessíveis para sequenciamento de alto rendimento abre portas emocionantes para a genômica populacional e genômica da paisagem destinada a entender a dispersão de mosquitos e o fluxo genético que influencia o sucesso de muitas novas estratégias de controle genético.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo econômico de extração de DNA baseado em microesferas magnéticas para mosquitos individuais de Aedes aegypti. O método elimina a necessidade de instrumentos automatizados caros, tornando a extração de DNA de alta qualidade acessível para laboratórios com recursos limitados e permitindo aplicações posteriores, como o sequenciamento completo do genoma.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia molecular
- Genômica
- Biologia de vetores
Contexto
- A extração de DNA de alta qualidade é essencial para estudos genômicos e diagnósticos.
- Instrumentos automatizados para extração de DNA são caros e podem não estar acessíveis a todos os laboratórios.
- Protocolos baseados em microesferas magnéticas oferecem uma alternativa aos métodos tradicionais de extração.
- Protocolos acessíveis podem ampliar o uso do sequenciamento de alto rendimento na pesquisa com mosquitos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo acessível de extração de DNA utilizando esferas magnéticas.
- Fornecer um método adequado para baixo a médio rendimento, sem necessidade de equipamentos caros.
- Validar o protocolo utilizando amostras individuais de mosquitos Aedes aegypti.
Métodos Utilizados
- Hidratação do tecido de mosquito em água livre de nucleases para PCR.
- Homogeneização com tampão de Proteinase K e mistura enzimática.
- Incubação e lise do tecido a 56°C.
- Associação do DNA a esferas magnéticas, seguida por lavagens sequenciais e eluição.
- Quantificação de DNA utilizando fluorometria de microvolume e razões de absorvância.
Resultados Principais
- O protocolo produz DNA de alta qualidade adequado para sequenciamento completo do genoma.
- A razão média de absorvância em 260/280 nm é 2,3, indicando boa pureza.
- O custo de reagentes e consumíveis é de aproximadamente $9,50 por amostra.
- O método é comparável em custo a outros protocolos baseados em microesferas magnéticas, mas dispensa a necessidade de instrumentos automatizados.
Conclusões
- Este protocolo permite a extração de DNA de alta qualidade e baixo custo a partir de mosquitos individuais.
- Ele possibilita o sequenciamento de alto rendimento em ambientes com recursos limitados.
- A abordagem facilita estudos de genômica populacional e de paisagem relevantes para o controle de vetores e a saúde pública.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A extração de DNA econômica e escalonável é essencial para viabilizar o sequenciamento de alto rendimento em biologia de vetores e genômica, especialmente em ambientes com recursos limitados. Este protocolo baseado em microesferas magnéticas elimina a necessidade de automação cara, favorecendo um acesso mais amplo a dados genômicos para genômica populacional e de paisagem. Ao reduzir as barreiras para a extração de DNA de alta qualidade, o protocolo potencializa a descoberta e as capacidades de vigilância em toda a carteira de pesquisa e desenvolvimento em biofármacos e saúde pública.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite interrogatório genômico robusto de populações de vetores para validação de alvos em pesquisas de controle de doenças.
- Auxilia na identificação de mutações genéticas relevantes para resistência e vias imunológicas.
- Facilita a desmistificação biológica ao fornecer DNA de alta qualidade para análises downstream.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara amostras de DNA validadas para fluxos de trabalho de triagem baseados em sequenciamento.
- Garante rendimentos quantitativos e reprodutíveis de DNA adequados à padronização de ensaios.
- Permite o processamento escalonável de amostras para estudos em nível populacional.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Permite a genômica translacional ao apoiar estudos sobre fluxo gênico e dispersão relevantes para estratégias de controle de vetores.
- Garante continuidade desde a coleta de amostras de campo até a análise genética pré-clínica.
- Reduz as barreiras operacionais para a implementação da genômica em fluxos de pesquisa translacional.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo é adequado desde a fase inicial de descoberta até a pesquisa pré-clínica, apoiando fluxos de trabalho que vão da coleta de amostras de campo até a análise baseada em sequenciamento.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a análise de vias ao permitir o acesso a DNA de alta qualidade de vetores individuais.
- Triagem: Fornece extração reprodutível de DNA pronta para sequenciamento e desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Oferece métricas quantitativas de qualidade do DNA (por exemplo, razão 260/280) para comparações confiáveis em etapas subsequentes.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se a estudos de biomarcadores e fluxo gênico na pesquisa de doenças transmitidas por vetores.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e economicamente eficiente de extração, adaptável a diferentes projetos e equipes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em análises genômicas e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Reduz os custos com equipamentos e permite a extração de DNA reprodutível e escalonável.
- Valor Estratégico: Amplia o acesso ao sequenciamento de alto rendimento para portfólios diversos de pesquisa.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de iniciativas de controle de vetores e genômica.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimentos básicos em biologia molecular e equipamentos laboratoriais padrão.
- Exige acesso a separadores de microesferas magnéticas e fluorímetros de microvolume para quantificação de DNA.
- Exige técnica rigorosa de pipetagem para prevenir contaminação cruzada entre amostras.
- Adaptável a fluxos de trabalho de baixo e médio rendimento sem automação.
- Recomenda-se a familiarização inicial com um conjunto pequeno de amostras para otimização do fluxo de trabalho.
