Name: μTongue: Uma plataforma de imagem funcional baseada em microfluidics para a língua in vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a usar microscopia intravital para imagem funcional de células gustativas in vivo com o sistema µTongue. Este protocolo permite análise de respostas a estímulos doces, umami e salgado em camundongos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Ciência Básica (IBS-R015-D1), a Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (No. 2019M3A9E2061789), e pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) subvenção financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (nº 2019M3E5D2A01058329). Somos gratos a Eunso Kim e Eugene Lee por sua assistência técnica.

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e da Universidade Nacional de Seul.
1. Preparação de soluções: saliva artificial e tastants
<ol><li>Prepare a saliva artificial dissolvendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4e 1,8 mM HCl em água destilada (>1 L), e ajuste o pH da solução para 7 (ver Tabela de Materiais)12.</li>
	<li>Preparar tastants, como azedo: ácido cítrico de 10 mM; salgado: 400 mM NaCl, opcionalmente com 50 μM de amiloride; doce: 40 mM acesulfame K; amargo: uma mistura de 5 mM de quinina, 5 mM de denatonium e cicloheximida de 20 μM, dissolvendo o produto químico degustação na saliva artificial preparada na etapa 1.1.</li>
</ol>2. Preparação do sistema microfluido
NOTA: Os tastants foram entregues na língua do rato usando um sistema de entrega de fluidos multicanais pressurizados (consulte Figura 1 e Tabela de Materiais).
<ol><li>Encha os reservatórios do sistema de perfusão de fluxo pressurizado com saliva artificial e tastants.</li>
	<li>Conecte a linha de ar comprimido à entrada do regulador e coloque a pressão de ar entre 30 e 50 psi no sistema de entrega fluida.</li>
	<li>Defina a pressão de saída do regulador para 0,4 psi e verifique se o líquido sai do tubo sob esta pressão.</li>
	<li>Conecte o coletor dos reservatórios à porta de entrada de μTongue.</li>
	<li>Conecte a porta de saída de μTongue a uma bomba de seringa e retire o líquido com ~300 μL∙min-1 para estabelecer a condição de estado estável. Observe o volume constante de uma gotícula pendurada sob a μTongue. Ajuste o valor do parâmetro de configuração dependendo da altura da amostra.</li>
	<li>Desconecte a linha de ar comprimido e pare a bomba de seringa até que o protocolo 3 seja concluído.</li>
</ol>3. Preparação do mouse para imagens in vivo (Figura 2).
NOTA: Todas as preparações dos animais foram realizadas durante o dia sob condições assépticas em uma bancada de laboratório.
<ol><li>Anestesia do rato<ol>
<li>Prepare um rato de 7 semanas ou mais velho de ambos os sexos. Use uma linha de camundongos geneticamente modificada que expresse proteínas de fluorescência sensoriais de cálcio nas células de sabor.</li>
		<li>O rato é contido para anestesia. Uma mistura de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina é injetada intraperitonealmente no mouse13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TRITC-dextran (500 kDa) em 2,5% W/V tampão de fosfato é administrado por via intravenosa no camundongo através de uma rota retro-orbital para observar a circulação sanguínea durante uma sessão de imagem.</li>
	<li>Coloque um fixador de cabeça no crânio do mouse para minimizar os artefatos de movimento.<ol>
<li>A cabeça do mouse é pulverizada com 70% de ETOH, enquanto o mouse é colocado em uma posição supina. Levante levemente a pele da cabeça com fórceps e corte aproximadamente 7 mm2 com uma tesoura.</li>
		<li>Limpe o cabelo ao redor do couro cabeludo, remova o periosteum sob a pele, aplique um adesivo instantâneo no crânio e anexe um fixador de cabeça personalizado.</li>
		<li>Após o adesivo instantâneo endurecer, aplique cola dentária ao redor do fixador da cabeça e ilumine com uma luz azul para solidificar a cola dentária.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a língua do rato na unidade inferior da μTongue.<ol>
<li>Conecte o lábio inferior do mouse à unidade inferior de μTongue com um adesivo instantâneo.</li>
		<li>Coloque o mouse na placa (placa de preparação do mouse na Figura 1B) e coloque a unidade inferior do μTongue nos postes (μTongue mantenha o poste na Figura 1B). Certifique-se de que os orifícios na borda da unidade inferior estejam alinhados ao poste.</li>
		<li>Aperte o fixador da cabeça do mouse no suporte do fixador de cabeça na placa. Em seguida, ajuste a distância entre a cabeça do mouse e o dispositivo. Gire a cabeça do mouse suavemente aproximadamente 45° usando o suporte do fixador de cabeça. Este processo impede o contato físico do nariz do mouse com o objetivo do microscópio.</li>
		<li>Desenhe a língua do rato suavemente usando pinças de plástico e conecte o lado ventral da língua ao lado superior da unidade inferior da μTongue. Em seguida, limpe a superfície da língua do rato com um cotonete molhado.</li>
		<li>Mergulhe um pedaço de papel na saliva artificial e coloque-o sobre a superfície exposta da língua do rato para manter uma condição úmida.</li>
		<li>Coloque as arruelas curvas nos postes que seguram as duas extremidades da parte inferior do μTongue.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a preparação do mouse no estágio do microscópio. Posicione a língua do rato exposta sob o centro aproximado da área objetiva do microscópio. Certifique-se de não se desviar do alcance dinâmico do palco. Em seguida, aperte a placa do mouse no palco com parafusos.</li>
	<li>Coloque a almofada de aquecimento sob o corpo do mouse e mantenha a temperatura em 36,5 °C-37,5 °C. Monitore a temperatura do corpo do mouse com um sensor de temperatura e controle a temperatura da almofada de aquecimento usando um sinal de feedback do sensor de temperatura.</li>
	<li>Torça um pedaço fino de papel e coloque-o na boca do mouse para evitar que o líquido entre na traqueia do rato.</li>
	<li>Retire o tecido molhado da língua do rato e coloque o μTongue preparado na língua do rato. Coloque um canal microfluido na língua e ajuste sua posição para observar a superfície da língua através da janela de imagem.</li>
	<li>Fixar o μTongue aparafusando suavemente em ambas as extremidades com pressão compressiva mínima.</li>
</ol>4. Aquisição de imagens
<ol><li>Ligue o laser de 920 nm de dois fótons e o microscópio antes do uso.</li>
	<li>Monte o objetivo de imersão em água (16x, NA 0,80 ou 25x, NA 1.1) no microscópio. Solte a água destilada na janela de imagem do μTongue e mergulhe o objetivo.</li>
	<li>No modo câmera, acenda a luz usando lâmpada de mercúrio e ilumine a superfície da língua.</li>
	<li>Ajustando o eixo Z, procure o sinal autofluorescente a partir das papilas filiformes para encontrar o plano focal aproximado. Em seguida, usando o botão de ajuste X e Y, localize uma papila gustativa.</li>
	<li>Mude para o modo multifotônio. Definir as condições de aquisição de imagem da seguinte forma: comprimento de onda de excitação: 920 nm; conjunto de filtro de emissão: 447/60 nm, 525/50 nm e 607/70 nm; modo de varredura rasteral bidirecional, tamanho do quadro: 512 x 512.</li>
	<li>Ajuste as posições X e Y para colocar a papila gustativa no centro da janela da imagem.</li>
	<li>Procure nos vasos sanguíneos ao redor da papila gustativa a cerca de dois terços da altura da papila gustativa. Visualize a circulação sanguínea pela injeção TRITC-dextran (500 kDa) a partir da etapa 3.2 do protocolo. Se o fluxo sanguíneo obstruír, solte ligeiramente os parafusos de fixação para permitir o fluxo sanguíneo.</li>
	<li>Ajuste o eixo Z e encontre o plano Z da papila gustativa que contém um número adequado de células de sabor.</li>
	<li>Proceda a imagem de cálcio com 2-6 Hz para 80 s. Forneça uma solução de sabor de 20 s ligando o reservatório do sistema fluido após o início da imagem. Depois de 20 s de estimulação de sabor, mude o reservatório de volta para saliva artificial.</li>
	<li>Depois que a imagem sequencial estiver concluída, aguarde cerca de 3-4 minutos de antecedência para a próxima sessão de imagem. Mantenha a saliva artificial fluindo para a língua do rato para lavar o remanente tastant da sessão de imagem anterior. Dependendo do desenho do experimento, repita a sessão conforme necessário.</li>
	<li>Quando a imagem in vivo de cálcio estiver completa, eutanize o mouse de acordo com o procedimento iACUC. O rato sob anestesia é sacrificado na câmara de CO2. NOTA: Verifique a profundidade da anestesia usando um reflexo de dedo do dedo do dedo do sol. Durante uma sessão de imagem, a saliva artificial dos reservatórios deve ser fornecida de forma consistente. Se aparecerem bolhas na janela de imagem do μTongue, remova as bolhas empurrando-as através da entrada ou da saída do μTongue usando forte pressão líquida.</li>
</ol>5. Análise de imagem(Figura 3)
<ol><li>Conversão de imagem<ol>
<li>Abra os arquivos de imagem bruta usando Fiji14 ou um software de análise de imagem semelhante.</li>
		<li>Converta o arquivo de imagem em um arquivo de pilha RGB para usar o código NPL Bud Analyzer.<ol>
<li>Imagem > cores > canais divididos</li>
			<li>
Imagem > Color > Mesclar canais e selecione a imagem a partir da etapa 5.2.1.</li>
			<li>Imagem > Color > Stack para RGB</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registro de imagem NOTA: Use o código personalizado para análise de dados. Por favor, consulte https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.<ol>
<li>Execute o código chamado Taste_GUI.m; uma janela GUI chamada NPL Bud Analyzer aparecerá. Clique no botão Nova Análise no canto superior direito e, em seguida, carregue a imagem convertida a partir da etapa 5.1. Defina a taxa de quadros acima da imagem carregada.</li>
		<li>Desenhe a região de interesse (ROI) sobre a imagem carregada para registro. Clique duas vezes no ROI selecionado e um registro calculado automaticamente será inicial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obtenha as alterações relativas da intensidade da fluorescência (ΔF/F)<ol>
<li>Volte para a janela NPL Bud Analyzer para mostrar a imagem registrada da etapa 5.2 automaticamente. Se o usuário já tiver um arquivo reg, clique no botão Dados de carga e selecione o arquivo _reg.tif.</li>
		<li>Clique no botão CIRCLE ou POLYGON e posicione o ROI da célula de paladar sobre a imagem da papila gustativa.</li>
		<li>Isso apresenta a intensidade da fluorescência bruta e o traço de cálcio (ΔF/F) da célula de paladar selecionada automaticamente sob a imagem da papila gustativa.</li>
		<li>Clique em Salvar traço para apresentar o traço de cálcio (ΔF/F) no lado direito da GUI, enquanto o ROI é mostrado sobre a imagem da papila gustativa. Repetição de passos 5.3.2-5.3.4 até que a seleção do ROI seja concluída. NOTA: Clique no botão Excluir traço se o ROI for selecionado erroneamente para eliminar o último traço de ROI e cálcio selecionados.</li>
		<li>Após a seleção do ROI terminar, escreva o nome do arquivo no canto inferior direito e clique no botão Terminar para exportar o traço de cálcio ΔF/Fcomo um formato de .xls e a imagem do botão tase com ROIs em um formato .bmp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise do traço de cálcio<ol>
<li>Analise o traço de cálcio obtido a partir da etapa 5.3. Considere que as células de paladar reagiram ao sabor quando a intensidade da fluorescência aumenta mais de dois desvios padrão da linha de base após a entrega do tastant4, e p-valores são inferiores a 0,01, usando testes t-10emparelhados ou não não pagos .</li>
		<li>Considere a célula de paladar como uma célula de resposta, se ela responder a um certo tastant mais de duas vezes em três ensaios (~60%)15.</li>
		<li>Obtenha os traços representativos de cálcio, obtendo traços de cálcio individuais adquiridos a partir da etapa 5.4.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+microscopy%3A+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li>
<li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Ca2%2B+imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li>
<li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li>
<li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li>
<li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li>
<li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+salt+recruits+aversive+taste+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li>
<li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li>
<li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+anion+in+salt+%28NaCl%29+detection+by+mouse+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li>
<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram interesses financeiros concorrentes: J. Han e M. Choi são inventores da tecnologia patenteada μTongue descrita neste artigo, e o sistema μTongue está comercialmente disponível via SciTech Korea.

Descrito aqui é um protocolo detalhado para aplicar μTongue à investigação de atividades funcionais de células de paladar in vivo. Neste protocolo, é realizada a imagem funcional nas células gusticuladas utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificados. Além do uso de camundongos transgênicos, o carregamento eletroforético de corantes de cálcio (ou corantes de sensoriamento de tensão) nas células gustativas pode ser uma opção alternativa.
Todas as soluções de sabor inferiore...

O microscópio de fluorescência intravital é amplamente utilizado para estudar a dinâmica espostetemporal em tecidos vivos. Pesquisadores estão desenvolvendo rapidamente sensores geneticamente codificados que fornecem transformações específicas e sensíveis dos processos biológicos em sinais de fluorescência - que podem ser registrados prontamente usando microscópios de fluorescência que estão amplamente disponíveis1,2. Embora a maioria dos órgãos internos em roedores tenham sido investigados usando o microscópio, sua aplicação bem sucedida na língua ainda não foi bem sucedida3.
Estudos anteriores sobre a imagem de cálcio das células gustativas foram realizados ex vivo por secção fina de um tecido da língua para obter papilas gustativas circunvaloladas4,5,6 ou descascando o epitélio de sabor para obter papilas gustativas fungiformas7,8. A preparação dessas amostras foi inevitavelmente invasiva, assim, os microambientes naturais, como a inervação dos nervos, as barreiras de permeabilidade e a circulação sanguínea, foram em grande parte perturbados. A primeira janela intravital de imagem da língua foi relatada em 2015 por Choi et al., mas a gravação funcional confiável não foi alcançável devido ao movimento e artefatos ópticos causados pelo estímulo tastante fluido9.
Recentemente, microfluidos-em-uma-língua (μTongue) foi introduzido10. Este dispositivo integra um sistema microfluido com uma janela de imagem na língua do rato. Ao atingir um fluxo de estado quase estável de estímulos tastantes durante todo o período de imagem, artefatos do movimento fluido poderiam ser minimizados(Figura 1). A porta de entrada é alimentada por uma série de controladores de pressão multicanal, enquanto a porta de saída está conectada a uma bomba de seringa, que mantém 0,3 mL/min. Além disso, artefatos ópticos causados pela diferença nos índices de refração das soluções tastant foram minimizados pela análise ratiométrica introduzindo um indicador insensível de cálcio (tdTomato) bem como o indicador de cálcio (GCaMP6)11. Este design proporcionou estabilidade microscópica das células de paladar in vivo mesmo com a troca abrupta entre canais fluidos. Consequentemente, o μTongue implementa uma triagem funcional confiável de vários tastants para as papilas gustativas do mouse in vivo.
Neste protocolo, os procedimentos experimentais são explicados em detalhes para a imagem de cálcio das papilas gustativas fungiformas do camundongo in vivo usando μTongue. Em primeiro lugar, descreve-se a preparação de saliva artificial e soluções saborosas. Em segundo lugar, a configuração do sistema microfluido para alcançar o fluxo de estado quase estável é introduzida. Em terceiro lugar, os procedimentos utilizados para montar a língua do rato no μTongue para permitir a aquisição de imagens são delineados. Por fim, cada passo para análise de imagem, incluindo correção de artefatos de movimento lateral e razãometria, é especificado. Este protocolo pode ser adaptado prontamente para qualquer laboratório de pesquisa com uma instalação de mouse e um microscópio de dois fótons ou equipamento equivalente.

<table><tbody><tr><td>acessulfame K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04054-25G</td><td>Saliva artificial / solução de</td></tr><tr><td>cloreto de cálcio</td> saboroso <td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>Saliva artificial /</td></tr><tr><td>ácido cítrico</td> saboroso <td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-100G</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>cicloheximida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01810-5G</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>denatônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5765-5G</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>Cola dental</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>Preparação de animais</td></tr><tr><td>Imagem J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>Análise de dados</td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>Adesivo instantâneo</td><td>Loctite</td><td>Loctite 4161, Henkel</td><td>Preparação de animais</td></tr><tr><td>Saliva artificial de K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>/tastant</td></tr><tr><td>Saliva artificial de KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>/</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Yuhan</td> do tastant <td>Ketamine 50</td><td>Preparação animal</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P0662-25G</td><td>Saliva artificial/saboroso</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>artificial saliva / saborizante</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>Análise de dados</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>MPG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>Mutiphoton microscópio</td><td>Thorlab</td><td>&nbsp; Microscópio Bergamo II</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>Saliva artificial / sabortante</td></tr><tr><td>Objetiva</td><td>Nikon</td><td>N16XLWD-PF</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Octaflow</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>OCTAFLOW II</td><td>Controle fluídico</td></tr><tr><td>PC</td><td>LG</td><td>Lg15N54</td><td>Medidor de pH de controle fluídico</td></tr><tr><td></td><td>Thermoscientific</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806562</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>quinino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Q1125-5G</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Havard Apparatus</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>Controle fluídico</td></tr><tr><td>TRITC-dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>Preparação animal</td></tr><tr><td>Laser de fibra ultrarrápida</td><td>Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Coréia</td><td>Rompun</td><td>Preparação animal</td></tr></tbody></table>

μtongue: uma plataforma de imagem funcional baseada em microfluidics para a língua in vivo

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

A microscopia de fluorescência intravital é uma ferramenta amplamente utilizada para estudar a dinâmica multicelular em um animal vivo. No entanto, não foi usado com sucesso no órgão sensorial de sabor. Ao integrar microfluidos na janela de imagem intravital da língua, o μTongue fornece imagens funcionais confiáveis de células de paladar in vivo sob exposição controlada a vários tastants. Neste artigo, é apresentado um procedimento passo a passo detalhado para utilizar o sistema μTongue. São cinco subseções: preparação de soluções tastant, criação de um módulo microfluido, montagem de amostras, aquisição de dados de imagem funcionais e análise de dados. Algumas dicas e técnicas para resolver as questões práticas que podem surgir ao usar o μTongue também são apresentadas.

O mouse Pirt-GCaMP6f-tdTomato foi usado para obter uma imagem de paladar. A superfície da língua do rato estava coberta com papilas filiformes filiformes autofluorescentes. As papilas gustativas são espalhadas esparsamente sobre a superfície da língua(Figura 4A). As imagens da papila gustativa e sua estrutura foram adquiridas utilizando três detectores de filtros diferentes. Utilizando o conjunto de filtros de 607/70 nm, o sinal tdTomato das células gustares foi obtido para análise ratiométr...

O artigo introduz o dispositivo μTongue (microfluidos-em-uma-língua) para imagens de células de paladar funcional in vivo, integrando microfluidos em uma janela de imagem intravital na língua.

μTongue: Uma plataforma de imagem funcional baseada em microfluidics para a língua in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Este protocolo permite observar as funções das células de paladar em um microambiente natural com conexões neurais e circulação sanguínea permanecendo intacta. Usando essa técnica, a comunicação célula-celular pode ser investigada in vivo. Para começar, encha os reservatórios do sistema de perfusão de fluxo pressurizado com saliva artificial e tastants.Conecte a linha de ar comprimido à entrada do regulador e coloque a pressão de ar no sistema de entrega fluidica para 30 a 50 libras por polegada quadrada. Defina a pressão de saída do regulador para 0,4 libras por polegada quadrada e verifique se o líquido começa a fluir para fora do tubo. Conecte o coletor dos reservatórios à porta de entrada da micro-língua, depois conecte a porta de saída da micro língua a uma bomba de seringa e retire o líquido a aproximadamente 300 microliters por minuto para estabelecer uma condição de estado estável.Confirme que o volume da gotícula pendurada sob a micro língua permanece constante e ajuste a pressão de ar e a taxa de fluxo para obter a altura amostral desejada. Uma vez configurado o sistema microfluido, desconecte a linha de ar comprimido e desligue a bomba de seringa até que o mouse esteja preparado para imagens in vivo. Depois de administrar anestesia ao camundongo, injete intravenosamente tritc-dextran através de uma rota retro-orbital para observar a circulação sanguínea durante a imagem.Com o mouse colocado em uma posição supina, borrife 70% de etanol na cabeça. Use fórceps para levantar a pele da cabeça levemente, em seguida, use a tesoura para cortar aproximadamente sete milímetros quadrados de pele. Depois de limpar o cabelo ao redor do couro cabeludo, remova o periósteo debaixo da pele e aplique um adesivo instantâneo no crânio.Em seguida, anexe o fixador de cabeça personalizado. Uma vez que o adesivo instantâneo é endurecido, aplique cola dentária ao redor do fixador da cabeça e solidifice-o por iluminação com uma luz azul. Usando adesivo instantâneo para colar o lábio inferior do mouse à unidade inferior da micro língua, em seguida, colocou o mouse na placa de preparação do mouse e segurou a unidade inferior na micro língua para os postes de redo pé, alinhando os orifícios na borda da micro língua com os postes.Aperte o fixador da cabeça do mouse no suporte do fixador da cabeça na placa e ajuste a distância entre a cabeça do mouse e o dispositivo. Em seguida, usando o suporte do fixador de cabeça, gire a cabeça do mouse suavemente em aproximadamente 45 graus. Depois de fixar o mouse na placa, use pinças de plástico para desenhar sua língua suavemente.Em seguida, usando adesivo instantâneo, conecte o lado ventral da língua ao lado superior da unidade inferior da micro-língua. Para manter a língua úmida, limpe a superfície com um cotonete molhado e coloque um pedaço de tecido encharcado em saliva artificial na superfície exposta da língua. Coloque as arruelas curvas nos postes, segurando a parte inferior da micro-língua, em seguida, mova a preparação do mouse para o estágio do microscópio.Posicione a língua exposta do mouse sob o centro aproximado da área objetiva do microscópio, certificando-se de não desviar da faixa dinâmica do palco e, em seguida, aperte os parafusos para fixar firmemente a placa do mouse no palco. Coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse para manter sua temperatura corporal entre 36,5 e 37,5 graus Celsius. Para evitar que o líquido entre na traqueia do rato, coloque um fino pedaço de papel torcido dentro da boca do rato, em seguida, remova o tecido molhado colocado na superfície da língua e coloque a micro língua preparada na língua do rato, de tal forma que a superfície da língua seja visível através da janela de imagem.Fixar a micro-língua paraparando suavemente ambas as extremidades com pressão compressiva mínima. Para começar a adquirir imagens, abra o software do microscópio e ligue o laser de 920 nanômetros de dois fótons. Monte o objetivo de imersão de água no microscópio, depois baixe o objetivo na janela de imagem da micro língua e mergulhe o objetivo.No modo câmera, ilumine a superfície da língua ligando a luz azul de uma lâmpada de mercúrio. Para encontrar o plano focal aproximado, ajuste o eixo Z e procure um sinal de autofluorescência a partir da papila filiforme. Em seguida, usando o botão de ajuste X e Y, localize uma papila gustativa.Mude para o modo multifótons e, em seguida, defina o comprimento de onda de excitação, o conjunto de filtros de emissão, o modo de varredura e o tamanho do quadro para aquisição de imagens. Com a papila gustativa no centro da janela de imagem, localize os vasos sanguíneos ao redor da papila gustativa em cerca de dois terços da altura da papila gustativa e visualize a circulação sanguínea. Se o fluxo sanguíneo estiver entupido, solte ligeiramente os parafusos de fixação para retomar o fluxo sanguíneo.Ajuste o eixo Z para encontrar o plano Z de uma papila gustativa contendo um número adequado de células gustativas, em seguida, proceda com imagens de cálcio em dois a seis Hertz por 80 segundos. Após o início da imagem, ligue o reservatório do sistema fluido para fornecer uma solução de sabor por 20 segundos. Após 20 segundos de estimulação do sabor, mude o reservatório de volta para saliva artificial.Durante a imagem, espere cerca de três a quatro minutos entre as sessões fornecendo consistentemente saliva artificial para manter a língua úmida e lavar o tastant restante da sessão anterior. A superfície da língua do mouse Pirt-GCaMP6f-tdTomato é coberta com papilas filiformes filiformes autofluorescentes e papilas gustativas pouco espalhadas. As papilas filiformas em amarelo são capturadas usando um detector de fotos a 500 a 550 nanômetros e podem ser observadas desde a própria superfície da língua até aproximadamente 25 micrômetros de profundidade.Os sinais GCaMP em verde detectados pelo filtro de 500 a 550 nanômetros e os sinais tdTomato em vermelho, detectados pelo filtro de 607 a 670 nanômetros, representam as células gustiáveis. O sinal tdTomato é obtido para análise métrica de razão. Os vasos sanguíneos que circundam a papila gustativa são adquiridos usando o filtro de 500 a 550 nanômetros fixado no tecido conjuntivo de colágeno, que sustenta estruturalmente a papila gustativa, é adquirido usando o conjunto de filtros de 447 a 460 nanômetros.Neste exemplo representativo de rastreamento de sabor in vivo usando imagem de cálcio, cada célula de sabor é demarcada por linhas tracejadas. Neste ensaio, a célula 2 respondeu aos tastants doces e umami. E a célula 3 respondeu aos tastantes de sal baixo e alto.Nenhuma das células deste paladar respondeu aos gostos azedos. Uma vez que o objetivo deste experimento é observar a função celular do paladar no ambiente natural, é importante entregar os fluorescentes nos vasos sanguíneos na etapa de preparação e confirmar sua circulação durante o experimento.

tongue-microfluidics-based-functional-imaging-platform-for-tongue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Uma visão abrangente das técnicas envolvidas na geração de um modelo do rato de câncer oral e monitorização quantitativa de invasão tumoral dentro da língua por meio de microscopia multi-fotão de células marcadas é apresentado. Este sistema pode servir como uma plataforma útil para a avaliação molecular e eficácia de drogas anti-invasivos compostos.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Lensfree óptico tomografia é uma técnica de microscopia tridimensional que oferece uma resolução espacial de menos de 1 uM × menos de 1 uM × menos de 3 M em X, Y e dimensões Z, respectivamente, ao longo de um grande volume de imagiologia de 15-100...

Lensfree On-chip microscopia tomográfica Empregando Multi-ângulo de iluminação e Pixel Super-resolução

Fornecemos aqui uma descrição detalhada do protocolo experimental para imagens com um sistema optoacústico (fotoacústico) portátil recém-desenvolvido para imagens tridimensionais funcionais e moleculares em tempo real. O poderoso desempenho e versatilidade demonstrados podem definir novas áreas de aplicação da tecnologia optoacústica na pesquisa pré-clínica e na prática clínica.

Universal de mão tridimensional Optoacoustic imagem Sonda para Deep Tissue Angiografia Humano e Estudos pré-clínicos funcionais em Tempo Real

Este estudo adaptado com sucesso deglutição estudo (VFSS) métodos humanos para uso com modelos de doenças murino com a finalidade de facilitar a investigação translacional disfagia.

Adaptação Humanos videofluoroscópicos Andorinha Métodos de Estudo de detectar e caracterizar Disfagia em modelos de doenças Murino

A imagem de ultrassom pode ser usada para exibir a forma e os movimentos da língua em tempo real durante a fala. As imagens podem ser usadas para determinar a natureza dos erros de som da fala. O feedback visual da língua pode ser usado para facilitar melhorias na produção do som da fala em populações clínicas.

Ultra-som Imagens da língua: um tutorial para avaliação e remediação de erros de fala de som

Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.

Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados

Descrevemos um procedimento cirúrgico em um modelo de rato anestesiado para determinar o tônus ​​muscular e as propriedades viscoelásticas da língua. O procedimento envolve estimulação específica dos nervos hipoglosos e aplicação de curvas de força / deformação Lissajous passivas ao músculo.

Avaliação In Vivo das Propriedades Mecanicas e Viscoelásticas da Língua do Rato

Desenvolvemos um protocolo generalizado para dissociar uma grande quantidade de células únicas de alta qualidade a partir do epitélio e mesenquime/tecido conjuntivo de línguas de camundongos embrionários e adultos.

Dissociação celular do Epitélio da Língua e Mesenquime/Tecido Conjuntivo de Ratos Embrionários 12,5 e 8 Semanas

O protocolo apresenta um método para cultivo e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de sabor isoladas da papila de sabor posterior de camundongos adultos.

Geração e Cultura de Organoides Linguais Derivados de Células-Tronco do Gosto de Rato Adulto

Um balanço de filme de superfície de gota pendente implementado com uma troca multi-subfase, apelidada de OCTOPUS, permite imitar condições digestivas pela troca subfásica sequencial da solução a granel original com fluidos gastrointestinais simulados. A digestão in vitro simulada é monitorada registrando in situ a tensão interfacial da camada interfacial digerida.

In vitro Digestão de emulsões em uma única gotícula via troca multifásica de fluidos gastrointestinais simulados

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem padronizada para avaliar quantitativamente a integridade da barreira epitelial gengival murina, aplicando topicamente dextranos marcados com fluorescência de diferentes tamanhos moleculares na superfície gengival in vivo, seguido por imagens ex vivo usando um sistema de microscopia de fóton único.

Avaliação funcional da barreira epitelial gengival de camundongos usando traçadores fluorescentes

Aprenda a usar microscopia intravital para imagem funcional de células gustativas in vivo com o sistema µTongue. Este protocolo permite análise de respostas a estímulos doces, umami e salgado em camundongos.

μTongue: Uma plataforma de imagem funcional baseada em microfluidics para a língua in vivo

Explorar mais vídeos