Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

A cristalografia macromolecular de comprimento de onda longa explora o sinal anômo de átomos de luz nativamente presentes em proteínas e ácidos nucleicos. Esta técnica é usada para resolver experimentalmente o problema da face cristalográfica e para determinar a identidade e localização desses elementos. Beamline I23 na Diamond Light Source é um instrumento síncrotron exclusivo otimizado para experimentos em comprimentos de onda longos até cinco angstrom.

Permite o acesso às bordas de absorção de elementos de alta relevância biológica, como cálcio, potássio, cloro, enxofre e fósforo. Devido à significativa absorção de raios-X pelo ar no regime de comprimento de onda longa, esses experimentos são realizados em um ambiente de vácuo. Para manter amostras a temperaturas criogênicas dentro do ambiente de vácuo, os cristais são montados em suportes de amostras dedicados e condutores termicamente.

A transferência de amostra criogênica do nitrogênio líquido para a estação final de vácuo é muito semelhante às técnicas utilizadas na microscopia crio-elétron. Este protocolo apresenta o procedimento de transferência de cristais para o ambiente de vácuo usando as ferramentas e equipamentos desenvolvidos na Diamond Light Source. Comece separando a tampa da base do CombiPuck de tal forma que os suportes de amostra permaneçam presos à base e os frascos sejam retidos na tampa.

Mergulhe a tampa com frascos de nitrogênio líquido, em seguida, conecte um porta-amostras e adaptador a uma varinha magnética e colhe os cristais. Esfrie diretamente cada amostra no CombiPuck, observando a posição da amostra. Para fechar o disco, use uma varinha de disco para prender a base à tampa.

Transfira o CombiPuck de nitrogênio líquido para o carregador seco ou armazenamento. Coloque a base do disco de bloco já povoada com blocos de transferência vazios em sua base de suporte em um recipiente de espuma e, em seguida, encha com nitrogênio líquido. Em seguida, coloque o CombiPuck no recipiente de espuma cheio de nitrogênio líquido, certificando-se de que a base do disco esteja presa ao suporte magnético dentro do recipiente de espuma.

Pré-esfrie todas as ferramentas necessárias em nitrogênio líquido. Em seguida, separe a tampa da base usando a ferramenta separadora do disco no ajuste superior, de tal forma que a base permaneça presa ao suporte magnético, expondo os suportes de amostra dentro do nitrogênio líquido. Coloque a varinha separadadora sobre o suporte de amostra e o adaptador o mais longe possível, certificando-se de que a varinha é vertical.

Mova a pequena alavanca na varinha do separador para baixo com o polegar até que ele clique para fixar o suporte da amostra dentro e puxe o suporte da amostra do adaptador. Abaixe o separador sobre a posição desejada do bloco de transferência, certificando-se de que um dos três pinos se encaixe dentro do orifício central do bloco de transferência. Solte o suporte da amostra movendo a alavanca de volta para cima.

Para carregar amostras no próximo bloco de transferência, use a ferramenta chave do carrossel para girar um bloco de transferência vazio na posição horizontal. Uma vez que todos os suportes de amostra são transferidos, feche o disco do bloco colocando a tampa em nitrogênio líquido. Aguarde o equilíbrio da temperatura e, em seguida, coloque a tampa sobre a base e levante suavemente para soltar do carrossel.

Anexar a nave auxiliar à estação. Abra o gás nitrogênio e as válvulas de ar e certifique-se de que os gases estão fluindo. Em seguida, ligue o CTS.

Esfrie tanto o banho quanto a nave auxiliar com nitrogênio líquido. Coloque o funil fornecido na porta de enchimento na nave auxiliar e despeje lentamente nitrogênio líquido no funil enquanto monitora o nível na tela. Pare quando o indicador passar de vermelho para azul.

Encha o banho com nitrogênio líquido usando o funil. Transfira um disco de bloco de nitrogênio líquido para o banho CTS usando a ferramenta separadora do disco anexado. Retire a tampa do disco do bloco e feche a tampa do banho CTS.

Para introduzir um bloco de transferência no transporte, desbloqueie a alça da nave, girando 90 graus no sentido horário e avance-a em direção ao banho para que a pista guiada na alça imponha o caminho correto da viagem. Uma vez que a tampa do bloco seja resfriada, avance a alça para introduzir o bloco na nave auxiliar. Para travar o bloco de transferência na nave auxiliar, gire a alça 180 graus no sentido horário.

Retire a pega para a posição traseira original e bloqueie-a no lugar girando 90 graus no sentido anti-horário. Pressione a bomba da válvula de transporte de perto na tela de exibição para iniciar a evacuação da nave auxiliar. Uma vez que as mensagens Navegem prontas para mover e não mova a haste, a válvula fechada é exibida na tela de toque, pressione a alavanca por baixo da nave auxiliar e levante-a cuidadosamente usando a alça na parte superior.

Leve a nave auxiliar até a câmara de ar na estação de extremidade de vácuo em posição vertical e anexe-a. Selecione uma posição de bloco vazia dentro da nave pressionando o botão correspondente na tela de toque e movendo o hotel de amostra para a posição de carregamento correta. Uma vez que um hotel de amostra esteja em posição, pressione o botão Abrir para iniciar a sequência de entrelaçamento de vácuo.

Depois que a sequência estiver completa e o status mudar para Airlock aberto, bloqueie a nave auxiliar, gire a alça 90 graus no sentido horário para desbloquear a haste. Empurre suavemente a haste para dentro da embarcação para que a trilha guiada imponha o caminho correto da viagem em direção ao hotel de amostra. Insira lentamente o bloco de transferência no hotel usando o feed de vídeo exibido na tela para orientação, garantindo que o ícone de posição do bloco no visor de toque seja ativado.

Uma vez ativado, gire a alça 180 graus no sentido anti-horário para liberar o bloco de transferência e retirar a haste da nave. Uma vez totalmente retraído, gire a alça 90 graus no sentido anti-horário para travar a haste. Pressione o botão Close para fechar a válvula de vácuo da estação final e ventilar o espaço entre o ônibus e a nave à pressão atmosférica.

Remova a nave auxiliar quando a tela da câmara de ar mostrar o status OK para se desprender. Devolva a nave auxiliar ao banho cts e pressione a Válvula de Transporte Aberto para evacuar a nave antes de carregar o próximo bloco de amostra. Uma vez que o semáforo esteja verde e a mensagem OK para mover a haste apareça, o próximo bloco de transferência pode ser introduzido na nave auxiliar.

Para preparar o próximo bloco de transferência, gire o disco de bloco dentro do banho. Empurre a tecla de rotação incorporada na parte superior da tampa acrílica para baixo na trava no centro do disco de bloco. Enquanto segurá-lo para baixo, vire a chave para posicionar o bloco de transferência desejado na posição de captação.

Uma vez que todos os blocos tenham sido transferidos, certifique-se de que a válvula de transporte está aberta, pressione o botão Bake na tela de toque, selecione bath e shuttle e pressione Start Bake. A linha de cristalografia cristalina de comprimento de onda longa I23 da Diamond Light Source pode acessar as bordas de absorção de elementos de alta importância biológica, como cálcio, potássio, cloro, enxofre e fósforo, dando um sinal anômola aprimorado que pode ser usado para esfingar ou localizar esses elementos dentro de macromoléculas. Os dados de difração foram coletados de um único cristal de talumatina no comprimento de onda 2,75 angstrom, escolhido como um compromisso entre o aumento do sinal anômo e os efeitos de absorção de amostras em comprimentos de onda mais longos.

A configuração do vácuo garante que apenas os raios-X espalhados pela amostra cheguem ao detector, fornecendo baixo fundo em torno dos reflexos de Bragg. O conjunto de dados rendeu um sinal anômroo muito forte, facilitando a solução da estrutura pelo duto automático DE eliminação CRANK2. A alta qualidade do mapa de densidade eletrônica resultante permitiu a construção de modelos automáticos bem sucedidos, com colocação correta para 100% da sequência de aminoácidos de thaumatina.

Os 16 resíduos de cisteína dentro da talumatina formam oito pontes de dissulfeto, todas claramente visíveis no mapa de densidade de elétrons. Uma vez que a cristalografia proteica de comprimento de onda longa no vácuo é um novo campo, desenvolvemos novas ferramentas e equipamentos de manuseio de amostras. Este protocolo orienta os usuários a transferir amostras com segurança para a estação final de vácuo na linha de luz I23 na Diamond Light Source.

O ambiente de vácuo abre oportunidades únicas para realizar experimentos de difração em uma faixa de comprimento de onda não acessível em outras linhas de luz. A cristalografia de raios-X de comprimento de onda longa permite a eliminação experimental de macromoléculas diretamente de cristais nativos. Também permite a identificação inequívoca de íons ligados às moléculas.