Análise da Composição Lipídica de Mycobacteria por Cromatografia de Camada Fina

Mycobacteria Lipids são uma característica importante do gênero e são críticos nas interações mycobacteria hospedada. Velocidade e versatilidade são as principais vantagens deste procedimento. Este método pode ser usado para entender o papel dos lipídios e a patogenicidade das micobactérias e seu efeito imunoestimulatório.

Para a extração de lipídios não covalentes ligados, adicione 15 mililitros de um a dois clorofórmio à solução de metanol a um tubo de vidro com uma tampa de parafuso de forro PTFE sob um capô de fluxo laminar. Em seguida, arranhe 200 miligramas de micobactérias de um meio sólido, e adicione as micobactérias ao tubo de vidro. Incubar o tubo durante a noite com agitação constante.

No dia seguinte, filtre os solventes orgânicos através de um funil de vidro forrado com papel filtro em um tubo de vidro. Depois de usar o fluxo de gás nitrogênio, para evaporar a fase líquida no tubo, encha o tubo com gás nitrogênio, para armazenar o tubo a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 15 mililitros de um clorofórmio de dois a um à solução de metanol aos detritos celulares e incubar o tubo durante a noite com agitação constante.

Na manhã seguinte, deixe a mistura descansar por uma hora, antes de usar uma pipeta Pasteur para transferir os solventes orgânicos para um funil de vidro forrado de papel filtro para o mesmo tubo de coleta de vidro. Em seguida, evaporar a fase líquida como demonstrado, antes de reabastecer o tubo com gás nitrogênio por quatro graus Celsius de armazenamento. Para extração de ácido mecólico, adicione dois a cinco mililitros de uma solução de agitação e 200 miligramas de biomassa de micobactéria a um tubo de vidro hermético com uma tampa de parafuso de liner PTFE, e misture o conteúdo por vórtice.

Incubar a mistura dentro de um banho seco a 80 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, quando o tubo tiver resfriado a temperatura ambiente, adicione dois mililitros de hexano N, e misture o conteúdo por 30 segundos por vórtice. Deixe o tubo se instalar até que duas fases claras apareçam e transfira a fase superior de hexano N para um novo tubo.

Misture dois mililitros adicionais de hexano N com o conteúdo do tubo e colete novamente a camada superior. Em seguida, evaporar o conteúdo do tubo por fluxo de nitrogênio e armazenar a amostra coberta de nitrogênio a quatro graus Celsius, como demonstrado. Para analisar as amostras por TLC cubra uma parede da câmara TLC com um pedaço de papel filtro, adicione vaselina nos cantos da câmara para selar a câmara, para que a mistura de solvente sobre o papel filtro e adicione o volume restante do solvente ao fundo da câmara TLC.

Feche a câmara TLC por pelo menos 20 minutos para saturar. Enquanto isso, dissolva os lipídios no tubo de vidro em 200 a 1000 microliters de clorofórmio e use um tubo de vidro capilar para aplicar 10 microlitadores da suspensão do clorofórmio lipídemo diretamente na placa TLC. Depois de permitir que a amostra seque por cinco minutos, insira a placa na câmara TLC saturada e permita que a fase móvel passe pelo TLC.

Quando o solvente atingir um centímetro da extremidade superior da placa, coloque a placa sob fluxo laminar até que a sílica esteja completamente seca. Em seguida, borrife a placa seca com 15 a 20 mililitros de 10% molar dados ácido fosfórico hidratar no etanol até que a placa esteja amarela brilhante, e aqueça a placa por dois a cinco minutos a 120 graus Celsius. Nesta análise representativa, o ácido micocólico extraído de várias espécies de micobactérias, foram analisados através de TLC unidimensional utilizando dois sistemas de elução diferentes e TLC bidimensional.

Também foram realizados dois tipos de procedimentos de metilação para confirmar a presença de ácido micoclic tipo cinco. Em ambos os sistemas de elução, os ácidos mecólicos foram localizados aproximadamente no meio da placa, embora, a mancha correspondente ao ácido micocólico tipo cinco, só tenha sido observada após a saponificação. TLC bidimensional também permite a identificação de tipos individuais de ácidos míclicos.

Por exemplo, mycobacterium brumae expressa apenas ácidos myclic tipo um, mycobacterium bovis BCG expressa tipo um e quatro, mycobacterium fortuitum expressa tipo um e cinco, e mycobacterium abcessus expressa perfis de ácidos mcólicos tipo um e dois. Os extratos lipídes totais de várias espécies de micobactérias foram analisados em função de sua polaridade e tamanho. Ele revela que a maioria dos lipídios polares, como os PDIMs, estão presentes na mycobacterium bovis BCG, mas não no mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae e no morfotipo liso de M abcessus.

GlycoLipids fenólicos estão presentes apenas na mycobacterium bovis BCG, enquanto os GlycoPeptidoLipids são observados apenas em amostras de mycobacterium abcessus. Semelhante aos ácidos micólicos, Acilglicerols e PDIMs, PIMs, também podem ser facilmente visualizados através de uma análise TLC unidimensional ou TLC 2D. Dois tipos de manchas foram utilizadas para revelar PIMs em TLC unidimensional.

A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este protocolo é não usar nenhum instrumento plástico durante todo o procedimento.