Name: Análise da Composição Lipídica de Mycobacteria por Cromatografia de Camada Fina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a extrair e analisar lipídeos totais e ácidos micólicos de micobactérias usando cromatografia de camada fina. Este método rápido e versátil permite caracterizar perfis lipídicos de diferentes espécies.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência, Inovação e Universidades da Espanha (RTI2018-098777-B-I00), pelos Feder Funds e pela Generalitat da Catalunha (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido é beneficiária de um contrato de doutorado (FI) da Generalitat de Catalunya.

1. Extração do total de lipídios não covalentes da micobactéria (Figura 1)
<ol><li>Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com tampas de parafuso de revestimento politetrafluoroethlene (PTFE). Adicione uma solução composta por 5 mL de clorofórmio e 10 mL de metanol (clorofórmio:metanol, 1:2). NOTA: Quando forem utilizados solventes orgânicos, apenas o recipiente de vidro deve ser utilizado. Não são permitidos recipientes plásticos. Além disso, são necessárias tampas de parafuso de forro PTFE para garrafas. ATENÇÃO: O clorofórmio é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: O metanol é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).</li>
	<li>Deixe o tubo em constante agitação durante a noite para extrair lipídios não ligados ao covalente da superfície celular micobacteriana. NOTA: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível.</li>
	<li>Cubra um funil de vidro com um papel filtro, filtre os solventes orgânicos e colete-os em um tubo de vidro.</li>
	<li>Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encha o tubo com gás nitrogênio, cubra e guarde a 4 °C. NOTA: Conecte uma pipeta pasteur de vidro ao fluxo de gás nitrogênio para evaporar especificamente o tubo desejado. Além disso, mantenha o tubo dentro de um aquecedor de bloco seco para tubos a 37 °C. Quando o solvente evaporar, encha o tubo com gás nitrogênio antes de fechá-lo.</li>
	<li>Adicione 15 mL de uma solução de clorofórmio:metanol (2:1) aos detritos celulares. Deixe o tubo em constante agitação durante a noite para extrair lipídios não ligados ao covalente da superfície celular micobacteriana. NOTA: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível.</li>
	<li>Deixe a mistura descansar por 1h. Com uma pipeta Pasteur, recupere os solventes orgânicos. Cubra um funil de vidro com um papel filtro e filtre os solventes orgânicos e colete-os no mesmo tubo de vidro anteriormente utilizado na etapa 1.3. Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene-o novamente a 4 °C.</li>
</ol>2. Extração de ácido micólico por methanólise ácida (Figura 2A)
<ol><li>Adicione 2-5 mL de solução esterificante em um tubo de vidro hermético com uma tampa de parafuso de forro PTFE. Adicione 0,2 g de biomassa de micobactéria no tubo de vidro. NOTA: A solução esterificante é formada pela mistura de 30 mL de metanol, 15 mL de tolueno e 1 mL de ácido sulfúrico. As células de micobactérias podem ser retiradas de culturas sólidas ou, mesmo de células delipidadas após a realização da extração de lipídios não covalentes totais de micobactérias (células remanescentes após filtragem na etapa 1.6). ATENÇÃO: O tolueno é uma substância inflamável e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: O ácido sulfúrico é uma substância corrosiva e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).</li>
	<li>Misture o conteúdo por vórtice. Deixe a mistura ficar dentro de um banho seco a 80 °C durante a noite.</li>
	<li>Deixe o tubo esfriar até atingir a temperatura ambiente e, em seguida, adicione 2 mL de n-hexano ao tubo. Misture o conteúdo por vórtice por 30 s e deixe o tubo se instalar até que duas fases claras apareçam. ATENÇÃO: o n-hexano é uma substância inflamável, irritante, ambientalmente prejudicial e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).</li>
	<li>Recuperar a fase superior correspondente à fase n-hexano. Transfira para um novo tubo.</li>
	<li>Repita o passo 2.3. Recupere a fase superior novamente e transfira-a para o mesmo tubo usado na etapa 2.4.</li>
	<li>Evaporar o conteúdo do tubo usando um fluxo de gás nitrogênio. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene-o a 4 °C.</li>
</ol>3. Extração de ácido micolico por saponificação e metilação (Figura 2B)
<ol><li>Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com uma tampa de parafuso PTFE.</li>
	<li>Adicione 2 mL de solução metanol-benzeno (80:20) contendo hidróxido de potássio de 5%. Misture o conteúdo por vórtice. Aqueça a mistura por 3h a 100 °C. ATENÇÃO: O benzeno é uma substância inflamável, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).</li>
	<li>Deixe o tubo esfriar até a temperatura ambiente. Adicione 20% de ácido sulfúrico para acidificar as amostras para alcançar pH = 1.</li>
	<li>Adicione 3 mL de éter de dietil. Misture suavemente o conteúdo com vórtice.</li>
	<li>Que as duas fases se formem se estabelecendo. Recupere a fase do éter de dietil e transfira para um novo tubo. Repita o passo de lavagem por um total de três vezes.</li>
	<li>Lave o extrato de éter de dietil com 2 mL de água destilada e transfira a parte superior correspondente ao éter de dietil para um novo tubo. Repita o passo de lavagem por um total de três vezes.</li>
	<li>Adicione 2 g de sulfato de sódio anidro sobre o extrato de éter de dietil para secá-lo.</li>
	<li>Filtre a suspensão. Evaporar o conteúdo usando um fluxo de gás nitrogênio.</li>
	<li>Para realizar a etapa de metilação, dissolva 3 g de N-nitroso-N-metil ureia em uma solução pré-reformada formada por 45 mL de éter dietilo e 9 mL de 40% KOH em água destilada. ATENÇÃO: N-nitroso-N-metilurea é uma substância tóxica, irritante, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).</li>
	<li>Transfira o supernatante (diazometano) para um novo frasco resfriado em gelo contendo pelotas de hidróxido de potássio (aproximadamente 30 g). NOTA: Se o supernaspe não for usado imediatamente, pode ser armazenado a -20 °C por uma máxima de 1h. ATENÇÃO: As pelotas de hidróxido de potássio são uma substância irritante e corrosiva. Este material deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrílho). ATENÇÃO: O diazometano é altamente tóxico e potencialmente explosivo. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar com vidro de segurança usando equipamentos de proteção individual apropriados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).</li>
	<li>Adicione 2 mL da solução éter contendo diazometano, obtido na etapa 3.10, no extrato de éter dietil seco que contém ácidos micólicos, obtidos na etapa 3.8. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Evaporar a suspensão a 40 °C. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene os lipídios metilados a 4 °C. NOTA: Evaporar o diazometano da solução éter sob a capa de fluxo laminar, até que o éter perca a cor amarela.</li>
</ol>4. Análise de cromatografia de camada fina (TLC)
<ol><li>Saturar a câmara TLC de vidro. Para isso, cubra uma das paredes da câmara TLC com um pedaço de papel filtro e deixe que ela esteja em contato com a fase móvel composta pela mistura de solventes. Coloque o volume restante do solvente na parte inferior da câmara TLC. NOTA: A parte inferior da câmara TLC deve ser coberta por pelo menos 1 cm da fase móvel. Nos experimentos atuais, foram utilizadas diferentes fases móveis para o desenvolvimento dos TLCs. Eles consistiam de 85 mL de n-hexano mais 15 mL de éter dietil; 100 mL de diclorometano; 90 mL de clorofórmio, 10 mL de metanol e 1 mL de água; 30 mL de clorofórmio, mais 8 mL de metanol, e 1 mL de água; 60 mL de clorofórmio, mais 35 mL de metanol, e 8 mL de água; Clorofórmio de 95 mL mais 5 mL de metanol; e 90 mL de éter de petróleo (60-80 °C) mais 10 mL de éter de ditila. NOTA: No TLC bidimensional, use n-hexano:acetona (95:5) na primeira direção três vezes, e use um único desenvolvimento com tolueno:acetona (97:3) na segunda direção para analisar a composição do ácido mcólico. Para analisar os PIMs, use clorofórmio:metanol:água (60:30:6) na primeira direção uma vez, e use clorofórmio:ácido acético:metanol:água (40:25:3:6) na segunda direção. Para analisar o PDIM e o AG, utilize o éter de petróleo (60-80 °C): acetato etílico (98:2) na primeira direção três vezes, e utilize um único desenvolvimento com éter de petróleo (60-80 °C): acetona (98:2) na segunda direção. ATENÇÃO: O éter de diethyl é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: O diclorometano é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: O éter de petróleo é uma substância inflamável, ambientalmente prejudicial e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: O ácido acético é uma substância inflamável e corrosiva em potencial. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: O acetato de etila é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: A acetona é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).</li>
	<li>Feche a câmara TLC para saturar por pelo menos 20 minutos. Enquanto isso, dissolva os lipídios presentes no tubo de vidro em 0,2-1 mL de clorofórmio. NOTA: O volume utilizado para dissolver os lipídios pode ser modificado dependendo da concentração desejada ou esperada da amostra.</li>
	<li>Aplique 10 μL de cada suspensão usando um tubo de vidro capilar diretamente na placa TLC e deixe a amostra secar por 5 minutos à temperatura ambiente. NOTA: As amostras devem ser aplicadas na parte inferior da placa, deixando 1 cm de cada lado. As amostras devem ser separadas uma da outra por pelo menos 0,5 cm. Uma vez que a amostra é aplicada na placa, os tubos podem ser evaporados novamente com gás nitrogênio e armazenados a 4 °C para uso posterior.</li>
	<li>Insira a placa na câmara TLC saturada que contém a fase móvel. Permita que a fase móvel passe pelo TLC. NOTA: Qualquer movimento aplicado na câmara TLC afeta o solvente em funcionamento na placa e afeta a mobilidade lipídica. No caso de realizar tlc bidimensionais, duas câmaras TLC são necessárias para conter ambos os sistemas de elução.</li>
	<li>Retire a placa da câmara TLC quando o solvente atingir 1 cm de distância da extremidade superior da placa. Deixe a placa sob fluxo laminar até que a sílica esteja totalmente seca. NOTA: No caso de analisar a composição do ácido mórclico, utilizando n-hexano e diethyl-éter (85:15), repita as etapas 4.4 e 4,5 vezes mais, até executar a fase móvel três vezes sobre a placa TLC.</li>
	<li>Revelar a placa com a mancha necessária; aqueça a placa, se necessário. NOTA: No presente experimento, 15-20 mL das seguintes soluções foram utilizadas para pulverizar as placas TLC: 10% hidratofosfórico de ácido molybdatophosphoric no etanol até que a placa esteja amarela brilhante, seguida pelo aquecimento da placa a 120 °C; 5% no etanol de 20% α-naftol em ácido sulfúrico seguido de aquecimento da placa a 120 °C; Reagente azul de molhênio (1,3% óxido de molbênio em ácido sulfúrico de 4,2 M) até que as bandas de fosfato apareceram ou 1% de anthrone em ácido sulfúrico. ATENÇÃO: O hidratofosfórico de umidade é uma substância inflamável e corrosiva. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: O etanol é uma substância inflamável e perigosa em potencial. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: 1-Naftil é uma substância inflamável, corrosiva e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito). ATENÇÃO: O reagente de spray azul de molhênio é uma substância corrosiva, tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um protocolo simples considerado como o método padrão-ouro para a extração de compostos lipídicos não covalentes ligados da parede celular micobacteriana é apresentado. Uma visualização adicional por TLCs unidimensionais dos lipídios extraídos de quatro micobactérias diferentes é mostrada.
Duas misturas combinadas consecutivas de clorofórmio e metanol para recuperar o teor lipídico das células micobacterianas é a mistura de solvente mais utilizada23,<sup clas...

Mycobacterium é um gênero que compreende espécies patogênicas e não patogênicas, caracterizada por ter uma parede celular altamente hidrofóbica e impermeável formada por seus lipídios peculiares. Especificamente, a parede celular micobacteriana contém ácidos micólicos, que são α-alquila e β-hidroxis, nos quais o α-ramo é constante em todos os ácidos micólicos (exceto pelo comprimento) e a cadeia de β, chamada cadeia meromycolate, é uma longa cadeia alifática que pode conter diferentes grupos químicos funcionais descritos junto com a literatura (α-, α'-, metoxical Κ-, epóxi-, carboxy-, e ω-1-metoxi-mycolates), produzindo assim sete tipos de ácidos míclicos (I-VII)1. Além disso, outros lipídios com importância inquestionável também estão presentes na parede celular das espécies de micobactérias. Espécies patogênicas como Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose2 produzir fatores específicos de virulência à base de lipídios, como dimicocerosates de fleuorol (PDIMs), glicolipídio fenólico (PGL), di-, tri-, e penta-acyltrehaloses (DAT, TAT e PAT), ou sulfolipídios, entre outros3. Sua presença na superfície micobacteriana tem sido associada com a capacidade de modificar a resposta imune do hospedeiro e, portanto, a evolução e persistência do micobacterium dentro do hospedeiro4. Por exemplo, a presença de triacylglycerols (TAG) tem sido associada ao fenótipo hipervirulento da subadequação lineage 2-Pequim de M. tuberculosis, possivelmente devido à sua capacidade de atenuar a resposta imune hospedeiro5,6. Outros lipídios relevantes são lipooligosaccarídeos (LOSs) presentes em micobactérias tuberculosas e não intuberréuas. No caso de Mycobacterium marinum, a presença de LOSs em sua parede celular está relacionada à motilidade deslizante e à capacidade de formar biofilmes e interfere no reconhecimento por receptores de reconhecimento de padrões de macrófago, afetando a absorção e eliminação das bactérias por fagocitos hospedeiros7,8. Além disso, a ausência ou presença de alguns lipídios permite que membros da mesma espécie sejam classificados em diferentes morótipos com perfis virulentos ou atenuados ao interagir com células hospedeiras. Por exemplo, a ausência de glycopeptidolipids (GPL) no morfótipo áspero de Mycobacterium abscessus tem sido associado com a capacidade de induzir acidificação intrafarosômica e, consequentemente, apoptose celular9, ao contrário do morótipo liso que possui GPLs em sua superfície. Além disso, o conteúdo lipídico da parede celular micobacteriana está relacionado com a capacidade de modificar a resposta imune no hospedeiro. Isso é relevante no contexto do uso de algumas micobactérias para desencadear um perfil imunológico protetor contra diferentes patologias10,11,12,13. Foi demonstrado, por exemplo, que Mycolicibacterium vaccae, um micobacterium saprofítico, que atualmente está em ensaios clínicos de fase III como vacina imunoterapêutica para tuberculose, apresentam dois morfotipos coloniais. Enquanto o fenótipo liso, que contém um poliéster em sua superfície, desencadeia uma resposta Th2, o fenótipo áspero desprovido do poliéster pode induzir um perfil Th1 quando interage com células imunes hospedeiras14. O repertório de lipídios presentes na célula micobacteriana não depende apenas das espécies de micobactérias, mas também das condições das culturas micobacterianas: tempo de incubação15,16 ou composição do meio de cultura17,18. De fato, mudanças na composição média da cultura afetam a atividade antitumoral e imunoestimulatória de M. bovis BCG e Mycolicibacterium brumae in vitro17. Além disso, o perfil imunológico protetor desencadeado por M. bovis BCG contra M. tuberculosis desafio em modelos de camundongos também depende da mídia cultural em que M. bovis BCG cresce17. Estes poderiam então estar relacionados com a composição lipídica das micobactérias em cada condição cultural. Por todas essas razões, o estudo do conteúdo lipídico das micobactérias é relevante. Um procedimento visual para extrair e analisar a composição lipídica da parede celular micobacteriana é apresentado.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td>100063</td><td>CUIDADO. Anidro para análise EMSURE&reg; ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Carlo Erba</td><td>400971N</td><td>CUIDADO. ACETONA RPE-ACS-ISO PARA ANÁLISE ml 1000</td></tr><tr><td>Anthrone</td><td>Merck</td><td>8014610010</td><td>Anthrone para síntese.</td></tr><tr><td>Benzeno</td><td>Carlo Erba</td><td>426113</td><td>CUIDADO. Benzeno RPE - Para análise - ACS 2,5 l</td></tr><tr><td>Tubo de vidro capilar</td><td>Merck</td><td>BR708709</td><td>BRAND&reg; &nbsp; descartável BLAUBRAND&reg; &nbsp; micropipetas, intraMark</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Carlo Erba</td><td>412653</td><td>CUIDADO. Clorofórmio RS - Para HPLC - Grau isocrático - Estabilizado com etanol 2,5 L</td></tr><tr><td>Aquecedor de bloco seco</td><td>J.P. Selecta</td><td>7471200</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Carlo Erba</td><td>412622</td><td>CUIDADO. Diclorometano RS - Para HPLC - Grau isocrático - Estabilizado com amileno 2,5 L</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Carlo Erba</td><td>412672</td><td>CUIDADO. Éter dietílico RS - Para HPLC - Grau isocrático - Não estabilizado 2,5 L</td></tr><tr><td>Acetato de etila</td><td>Panreac</td><td>1313181211</td><td>CUIDADO. O acetato de etilo (Reag. USP, Ph. Eur.) para análise, ACS, ISO</td></tr><tr><td>Álcool Etílico Absoluto</td><td>Carlo Erba</td><td>4146072</td><td>CUIDADO. Etanol EPR anidro absoluto - Para análise - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td></tr><tr><td>Funil de vidro</td><td>VidraFOC</td><td>DURA.2133148 1217/1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidro</td><td>VidraFOC</td><td>VFOC.45066A-16125</td><td>Tubo de vidro com tampa recuperada de PTFE</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carlo Erba</td><td>412722</td><td>CUIDADO. Metanol RS - Para HPLC - OURO - Grau ultragradiente 2,5 L</td></tr><tr><td>Hidrato de ácido molibdatofosfórico</td><td>Merck</td><td>51429-74-4</td><td>CUIDADO.</td></tr><tr><td>Reagente azul do pulverizador do molibdênio, 1.3%</td><td>Sigma</td><td>M1942-100ML</td><td>CUIDADO.</td></tr><tr><td>n-hexano</td><td>Carlo Erba</td><td>446903</td><td>CUIDADO. n-Hexano 99% RS - ATRASOL - Para análise de traços 2,5 L</td></tr><tr><td>n-nitroso-n-metilureia</td><td>Sigma</td><td>N4766</td><td>CUIDADO</td></tr><tr><td>Plataforma de agitação orbital</td><td>DDBiolab</td><td>995018</td><td>NB-205L incubadora de agitação de bancada</td></tr><tr><td>Éter de petróleo (60-80&ordm; C)</td> <td>Carlo Erba</td><td>427003</td><td>CUIDADO. Éter de petróleo 60 - 80&deg; C RPE - Para análise 2,5 L</td></tr><tr><td>Pulverizador</td><td>VidraFOC</td><td>712/1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sódio anidro</td><td>Merck</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico 95-97%</td><td>Merck</td><td>1007311000</td><td>CUIDADO. Câmara de ácido sulfúrico 95-97%</td></tr> <tr><td>TLC</td><td>Merck</td><td>Z204226-1EA</td><td>Tanques de desenvolvimento retangulares TLC, L completo &vezes; H &vezes; L 22 cm &vezes; 22 cm &vezes; Placa TLC de 10 cm</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>1057210001</td><td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td></tr><tr><td>TLC Aquecedor de placas</td><td>CAMAG</td><td>223306</td><td>CAMAG TLC Aquecedor de placas III</td></tr><tr><td></td><td>Tolueno Carlo Erba</td><td>488551</td><td>CUIDADO. Tolueno RPE - Para análise - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>10132562</td><td>IKA&nbsp; Agitador IKA v&oacute; rtex 3</td></tr><tr><td>1-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102269427</td><td>CUIDADO.</td></tr></tbody></table>

análise da composição lipídica de mycobacteria por cromatografia de camada fina

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

As espécies de micobactérias podem diferir umas das outras na taxa de crescimento, presença de pigmentação, morfologia da colônia exibida em mídia sólida, bem como outras características fenotípicas. No entanto, todos eles têm em comum o caráter mais relevante das micobactérias: sua parede celular única e altamente hidrofóbica. As espécies de micobactérias contêm um complexo ligado à membrana-covalente que inclui arabinogalactan, peptidoglycan e longas cadeias de ácidos micólicos com tipos que diferem entre espécies de micobactérias. Além disso, as micobactérias também podem produzir lipídios localizados, não covalentemente ligados, em suas superfícies celulares, como dimicocerosates de fleiocerol (PDIM), glicólipídios fenólicos (PGL), glicopeptidolipids (GPL), acitretros (AT) ou mannoídeos fosfatidil-inositol (PIM), entre outros. Alguns deles são considerados fatores de virulência em micobactérias patogênicas, ou lipídios antigênicos críticos na interação hospedeira-micobactéria. Por essas razões, há um interesse significativo no estudo dos lipídios micobacterianos devido à sua aplicação em diversas áreas, desde a compreensão de seu papel na patogenicidade das infecções por micobactérias, até uma possível implicação como agentes imunomodulatórios para o tratamento de doenças infecciosas e outras patologias como o câncer. Aqui, é apresentada uma abordagem simples para extrair e analisar o teor total lipídico e a composição de ácido mcólico das células de micobactéria cultivadas em meio sólido usando misturas de solventes orgânicos. Uma vez que os extratos lipíduos são obtidos, a cromatografia de camada fina (TLC) é realizada para monitorar os compostos extraídos. O experimento de exemplo é realizado com quatro micobactérias diferentes: o mycolicibacterium brumae e Mycolicibacterium fortuitum, o atenuado Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), e o patógeno oportunista de rápido crescimento Mycobacterium abscessus, demonstrando que métodos mostrados no presente protocolo podem ser usados para uma ampla gama de mycobacteria.

Com o objetivo de mostrar uma ampla gama de lipídios presentes em diferentes espécies de micobactérias, M. bovis BCG foi selecionado por ser micobactérias ásperas e de crescimento lento. O áspero e rápido crescimento M. fortuitum e M. brumae foram adicionados no procedimento e, finalmente, o morfotipo liso de M. abscesso também foi incluído. Essas quatro espécies nos permitem visualizar um amplo espectro de lipídios derivados de micobactérias, como acitrehaloses (AT), GPLs, PDIM, PGL, ...

Um protocolo é apresentado para extrair o conteúdo lipídico total da parede celular de uma ampla gama de micobactérias. Além disso, são mostrados protocolos de extração e analíticas dos diferentes tipos de ácidos micólicos. Um protocolo cromatográfico de camada fina para monitorar esses compostos micobacterianos também é fornecido.

Análise da Composição Lipídica de Mycobacteria por Cromatografia de Camada Fina

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Mycobacteria Lipids são uma característica importante do gênero e são críticos nas interações mycobacteria hospedada. Velocidade e versatilidade são as principais vantagens deste procedimento. Este método pode ser usado para entender o papel dos lipídios e a patogenicidade das micobactérias e seu efeito imunoestimulatório.Para a extração de lipídios não covalentes ligados, adicione 15 mililitros de um a dois clorofórmio à solução de metanol a um tubo de vidro com uma tampa de parafuso de forro PTFE sob um capô de fluxo laminar. Em seguida, arranhe 200 miligramas de micobactérias de um meio sólido, e adicione as micobactérias ao tubo de vidro. Incubar o tubo durante a noite com agitação constante.No dia seguinte, filtre os solventes orgânicos através de um funil de vidro forrado com papel filtro em um tubo de vidro. Depois de usar o fluxo de gás nitrogênio, para evaporar a fase líquida no tubo, encha o tubo com gás nitrogênio, para armazenar o tubo a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 15 mililitros de um clorofórmio de dois a um à solução de metanol aos detritos celulares e incubar o tubo durante a noite com agitação constante.Na manhã seguinte, deixe a mistura descansar por uma hora, antes de usar uma pipeta Pasteur para transferir os solventes orgânicos para um funil de vidro forrado de papel filtro para o mesmo tubo de coleta de vidro. Em seguida, evaporar a fase líquida como demonstrado, antes de reabastecer o tubo com gás nitrogênio por quatro graus Celsius de armazenamento. Para extração de ácido mecólico, adicione dois a cinco mililitros de uma solução de agitação e 200 miligramas de biomassa de micobactéria a um tubo de vidro hermético com uma tampa de parafuso de liner PTFE, e misture o conteúdo por vórtice.Incubar a mistura dentro de um banho seco a 80 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, quando o tubo tiver resfriado a temperatura ambiente, adicione dois mililitros de hexano N, e misture o conteúdo por 30 segundos por vórtice. Deixe o tubo se instalar até que duas fases claras apareçam e transfira a fase superior de hexano N para um novo tubo.Misture dois mililitros adicionais de hexano N com o conteúdo do tubo e colete novamente a camada superior. Em seguida, evaporar o conteúdo do tubo por fluxo de nitrogênio e armazenar a amostra coberta de nitrogênio a quatro graus Celsius, como demonstrado. Para analisar as amostras por TLC cubra uma parede da câmara TLC com um pedaço de papel filtro, adicione vaselina nos cantos da câmara para selar a câmara, para que a mistura de solvente sobre o papel filtro e adicione o volume restante do solvente ao fundo da câmara TLC.Feche a câmara TLC por pelo menos 20 minutos para saturar. Enquanto isso, dissolva os lipídios no tubo de vidro em 200 a 1000 microliters de clorofórmio e use um tubo de vidro capilar para aplicar 10 microlitadores da suspensão do clorofórmio lipídemo diretamente na placa TLC. Depois de permitir que a amostra seque por cinco minutos, insira a placa na câmara TLC saturada e permita que a fase móvel passe pelo TLC.Quando o solvente atingir um centímetro da extremidade superior da placa, coloque a placa sob fluxo laminar até que a sílica esteja completamente seca. Em seguida, borrife a placa seca com 15 a 20 mililitros de 10% molar dados ácido fosfórico hidratar no etanol até que a placa esteja amarela brilhante, e aqueça a placa por dois a cinco minutos a 120 graus Celsius. Nesta análise representativa, o ácido micocólico extraído de várias espécies de micobactérias, foram analisados através de TLC unidimensional utilizando dois sistemas de elução diferentes e TLC bidimensional.Também foram realizados dois tipos de procedimentos de metilação para confirmar a presença de ácido micoclic tipo cinco. Em ambos os sistemas de elução, os ácidos mecólicos foram localizados aproximadamente no meio da placa, embora, a mancha correspondente ao ácido micocólico tipo cinco, só tenha sido observada após a saponificação. TLC bidimensional também permite a identificação de tipos individuais de ácidos míclicos.Por exemplo, mycobacterium brumae expressa apenas ácidos myclic tipo um, mycobacterium bovis BCG expressa tipo um e quatro, mycobacterium fortuitum expressa tipo um e cinco, e mycobacterium abcessus expressa perfis de ácidos mcólicos tipo um e dois. Os extratos lipídes totais de várias espécies de micobactérias foram analisados em função de sua polaridade e tamanho. Ele revela que a maioria dos lipídios polares, como os PDIMs, estão presentes na mycobacterium bovis BCG, mas não no mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae e no morfotipo liso de M abcessus.GlycoLipids fenólicos estão presentes apenas na mycobacterium bovis BCG, enquanto os GlycoPeptidoLipids são observados apenas em amostras de mycobacterium abcessus. Semelhante aos ácidos micólicos, Acilglicerols e PDIMs, PIMs, também podem ser facilmente visualizados através de uma análise TLC unidimensional ou TLC 2D. Dois tipos de manchas foram utilizadas para revelar PIMs em TLC unidimensional.A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este protocolo é não usar nenhum instrumento plástico durante todo o procedimento.

analysis-lipid-composition-mycobacteria-thin-layer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Composição de extratos de lipídios polares e da composição de ácidos graxos de glycerolipids individuais são determinados em um experimento simples e robusto perfil lipídico. Para este fim, glycerolipids são isolados por cromatografia em camada delgada e submetido a transmetilação de seus grupos acil. Graxos methylesters acila são quantificados por cromatografia gás-líquido.

Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar por cromatografia em camada delgada (TLC) Juntamente com Cromatografia gás-líquido (GLC)

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Este vídeo demonstra a separação de ácidos micólicos baseada em cromatografia em camada fina. Essa técnica separa os diferentes ácidos micólicos - lipídios de cadeia longa presentes na parede celular das micobactérias - com base em sua polaridade.

Separação baseada em cromatografia em camada fina de variantes de ácido micólico: um método para separar lipídios da parede celular micobacteriana com base na polaridade

Isolamento e caracterização do domínio de lípido A do lipopolissacárido (LPS) da bactéria gram-negativa proporciona uma visão sobre os mecanismos da superfície celular com base de resistência ao antibiótico, a sobrevivência das bactérias e forma, e como quimicamente lípido A diversidade de espécies moleculares diferencialmente hospedeiras modular respostas imunitárias inatas.

Isolamento e Caracterização química do lípido A de bactérias Gram-negativas

Tegumento dos mamíferos contém lipídios solventes extraível que podem fornecer composições química característica de espécies individuais. Este trabalho apresenta um método de rotina para separar classes de lipídios amplas isoladas de tecidos tegumentar utilizando cromatografia em camada delgada e determinar o perfil triacilglicerídeos pelo laser de dessorção / espectrometria de massa por ionização assistida por matriz de tempo de vôo.

Perfil dos Conteúdos triacilglicerídeos em Bat Tegumentar Lipídeos por cromatografia em camada delgada preparativa e MALDI-TOF Espectrometria de Massa

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Aqui, é apresentado um protocolo para a rotulagem metabólica da levedura com ácido acético de 14C, que é acoplado à cromatografia de camada fina para a separação de lipídios neutros.

Análise da Síntese Lipídica Neutra em Saccharomyces cerevisiae por Rotulagem Metabólica e Cromatografia de Camada Fina

As vesículas bacterianas desempenham papéis importantes na patogênese e têm aplicações biotecnológicas promissoras. A heterogeneidade das vesículas complica a análise e o uso; portanto, é necessário um método simples e reprodutível para separar diferentes tamanhos de vesículas. Aqui, demonstramos o uso da cromatografia de exclusão de tamanho para separar vesículas heterogêneas produzidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografia de exclusão de tamanho para analisar heterogeneidade vesícula de membrana externa bacteriana

Este protocolo descreve a cultura, colheita e concentração de proteínas secretadas de Mycobacterium tuberculosis. As proteínas filtradas de cultura (CFPs) são quantificadas, separadas em 20 frações por focalização isoelétrica e posteriormente resolvidas em 30 frações usando um SDS-PAGE preparativo e um sistema de eletroeluição.

Separação e Fracionamento de Proteínas de Filtrado de Cultura (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis

Este protocolo separa proteínas insolúveis da parede celular e da membrana em frações simples (1-5 proteínas) usando focalização isoelétrica preparativa (IEF) com base no ponto isoelétrico, seguido de separação por peso molecular. As frações resultantes podem ser usadas diretamente para análises imunológicas e proteômicas sem purificação adicional.

Separação e Fracionamento de Proteínas da Parede Celular e da Membrana Celular de Mycobacterium tuberculosis para Análise de Proteínas a Jusante

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