Name: Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprenda a gerar xenoenxertos larvais de zebrafish com células tumorais humanas para análise de proliferação, angiogênese e metástase em resolução de célula única. Este protocolo padronizado permite triagem de drogas de alta vazão e aplicações em medicina personalizada.

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Agradecemos à Fundação Champalimaud, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, cofinanciado pela FCT/Lisboa2020) pelo financiamento. Bolsas FCT para VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Todos os membros do Laboratório Fior para discussões críticas; B. Costa e C. Rebelo de Almeida para compartilhamento de dados; e nossos membros do Laboratório C. Rebelo de Almeida, M. Barroso e L. Leite por sua participação no vídeo. Agradecemos a equipe de Comunicação, Eventos e Divulgação da CF (C. Certal, J. Monteiro et al) e Champalimaud, em especial Alexandre Azinheira, pela fantástica produção cinematográfica e Catarina Ramos e Teresa Fernandes pela ajuda.

<ol><li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+Fish%2C+Big+Data%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+of+the+day%3A+zebrafish+as+a+human+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li>
<li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+eyes+on+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li>
<li>Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNovoa%2C+B+%22Current+Topics+in+Innate+Immunity+II%22">Current Topics in Innate Immunity II</a>. Lambris, J. D., Hajishengallis, G. , Springer. 253-275 (2012).</li>
<li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li>
<li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li>
<li>Póvoa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156(2021).</li>
<li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li>
<li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li>
<li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769(2020).</li>
<li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li>
<li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li>
<li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578(2020).</li>
<li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293(2020).</li>
<li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li>
<li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooking+the+big+one%3A+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li>
<li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate%2C+migrate%2C+produce+melanin%2C+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1(2010).</li>
<li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016).</li>
<li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li>
</ol>

A crescente importância do zebrafish como modelo para o desenvolvimento do câncer e rastreamento de medicamentos resultou em inúmeras publicações3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. No entanto, a injeção de células cancerígenas em embriões de zebrafish é uma técnica que requer um alto nível de destreza que pode ser desafiador para os pesquisadores. Neste protocolo, nosso objetivo é fornecer informações práticas e algumas dicas que podem ajudar a superar os desafios iniciais da criação de xenoenxertos de embrião de zebrafish.
Injeção prévia de manuseio de células Este protocolo otimizado para a geração de xenoenxertos de zebrafish com linhas celulares pode ser adaptado a vários tipos de células (câncer) com diferentes morfologias. Recomendamos que todas as linhas celulares usadas para xenoenxertos de zebrafish sejam livres de mycoplasma. Ao contrário de outras contaminações bacterianas, a presença de micoplasma na cultura celular não gera alterações que podem ser facilmente detectadas sob o microscópio22. A contaminação por mycoplasma pode afetar o potencial de engrafamento das linhas celulares, sua sensibilidade às drogas, bem como a viabilidade dos embriões de zebrafish.
Embora as células possam continuar a proliferar por um longo período, seu fenótipo e genótipo podem ser propensos a alterações. É importante se familiarizar com a morfologia e o comportamento das linhas celulares na cultura. Recomendamos manter o número de passagens celulares após o descongelamento entre 3-12 para obter resultados reprodutíveis. Assim, devem ser realizados testes regulares de mycoplasma.
As células devem estar em sua fase de registro (fase de crescimento exponencial antes de atingir a confluência ~70%) no dia da injeção. Isso permitirá um enxerto adequado e o desenvolvimento adequado das marcas distintas do tumor. Para evitar a variação do fenótipo das células dentro do xenoenxerto, é fundamental manter a confluência de injeção constante entre os experimentos. O número de células injetadas pode ser adaptado às características de cada linha celular, pois algumas podem exigir maiores densidades de injeção para prosperar nos embriões de zebrafish.
Considerações de rotulagem celular Para melhor visualizar as células tumorais humanas para injeção e análise futura, as células tumorais podem ser rotuladas com corantes fluorescentes. Devido a diferenças no tamanho celular, o número total de células/cm2 em culturas aderentes varia entre as linhas celulares. Isso afetará a eficácia do protocolo de coloração, bem como o número de células colhidas para injeção. Grandes células que produzem números baixos por frasco (ou seja, Hs578T) ou crescem em clusters (ou seja, BFTC905) exigirão a junção de vários frascos para um único experimento. Neste caso, a coloração das células não deve ser realizada diretamente no frasco, pois isso causará o uso de quantidades excessivas de corante (alto custo). Por outro lado, as células altamente sensíveis aos ciclos excessivos de centrifugação, bem como aquelas que produzem números elevados por frasco (ou seja, HCT116) podem ser manchadas diretamente no frasco e, em seguida, destacadas com EDTA/raspador de células (Para obter mais informações ver Tabela 1).
Sempre que possível, em vez de usar uma abordagem enzimática, use EDTA para desprender as células no dia da injeção, para que as células recuperem suas junções célula-células mais rapidamente e sejam submetidas a menos passos de centrifugação. No entanto, se as células são sensíveis ao EDTA, muito aderentes ou crescem em clusters - um método enzimático pode ser aplicado. A otimização da concentração ideal para injeção, bem como o meio de injeção, depende das características de cada linha celular, podendo precisar de alguns ajustes(Tabela 1).
Calibração de microinjeção Ao contrário da entrega de oligonucleotídeos ou drogas no embrião de zebrafish, uma ralticula não é usada para calibrar a agulha ao trabalhar com linhas celulares para xenertos. Depois de algum tempo durante a injeção, as células começarão a entupir, e é necessário cortar a ponta da agulha para aumentar seu diâmetro ou mudar completamente a agulha. Este procedimento dificulta a calibração do ralticule.
Para resolver esse problema, o número de células dispensadas é regulado pela pressão ejetar e o tempo necessário para atingir um tamanho semelhante ao olho embrião dentro de 1-3 pulsos. Em seguida, para controlar ainda mais o tamanho do tumor, a 1 dpi, os xenoenxertos são classificados de acordo com o tamanho do tumor, como mostrado na Figura 6 B-B". Como representado no exemplo da Figura 6C, esse método de classificação é eficiente na redução da variação dos tamanhos dos tumores: se juntarmos todos (+,+++ o STEV é ~o dobro da classe ++(~906 células para ~422 células) e a variação do coeficiente é ~31,9% em comparação com 14,5% na classe ++. Como a referência para injeção é o volume, o número total de células varia muito entre os tipos de células - sendo dependentes do tamanho e forma das células. Por exemplo, células grandes com muito citoplasma como o câncer de mama Hs578T, produzem tumores muito menores (~600 células). Além disso, cada linha celular requer um número diferente de células. Por exemplo, as linhas de células cancerígenas urinárias HT29 CRC e RT112 mostraram que quanto maior o número de células injetadas, maior a mortalidade por zebrafish. Portanto, um período de otimização durante o desenvolvimento dos xenoenxertos é necessário para testar se a linha celular tem efeitos tóxicos no embrião ou requer densidades mais/menores de injeção.
Local de injeção Uma das discrepâncias mais comuns na geração de xenoenxertos de embrião de zebrafish é o local da injeção. A gema é geralmente o local de escolha para a injeção devido à sua fácil acessibilidade. No entanto, observamos que as células injetadas na gema têm maior tendência a morrer. Embora tecnicamente mais difícil, recomendamos injetar no PVS e o mais longe possível do coração. Dentro do PVS, as células podem agregar, recrutar vasos e células imunes, e migrar, intravasar, extravasar e formar micrometastase, se apresentarem características metastáticas8,11.
Eficiência de engraftment Diferenças na eficiência do enenerxerto e no tamanho do tumor entre as linhas celulares em 4 dpi são esperadas devido aos seus distintos graus de morte/sobrevivência/proliferação celular basal, mas também devido à imunogenicidade inata que cada linha celular pode exibir9.
metástase A metástase compreende uma cascata de eventos que pode ser dividida em duas etapas arbitrárias. No primeiro estágio, as células tumorais têm que se desprender do local primário, migrar e invadir tecidos adjacentes e, em seguida, intravasar para a corrente sanguínea. No segundo estágio, as células tumorais devem sobreviver em circulação, extravasar-se do sangue ou vasos linfáticos, e finalmente colonizar em locais secundários23. Para distinguir entre esses eventos precoces e tardios e abordar o potencial/proficiência das diferentes células tumorais para realizar essas etapas, projetamos um ensaio simples.
Em geral, quando injetadas no PVS, as células tumorais podem entrar diretamente em circulação e, em seguida, ficar fisicamente presas no tecido hematopoiético caudal (CHT) (região da cauda). No entanto, de acordo com as características de cada célula tumoral - vimos que algumas células tumorais permanecem no CHT 4 dpi e são capazes de formar micrometastase enquanto outras células tumorais desaparecem (limpas após serem pegas no CHT).
Portanto, comparando a eficiência da micrometastase (a 4 dpi) quando as células foram colocadas diretamente em circulação - CIRC (as células só têm que passar pelos passos finais da metástase) vs. quando não - NO CIRC (as células precisam passar por etapas precoces e tardias para serem capazes de formar uma micrometastase) podemos avaliar seu potencial metastático precoce ou tardio. Observamos células tumorais que podem formar micrometastase eficientemente no CHT em ambos os grupos (CIRC e NO CIRC), sugerindo que essas células têm a capacidade de se submeter a todas as etapas da cascata metastática (SW480 e MDA-MB-468, por exemplo)8,11. Em contraste, outras células tumorais têm um potencial metastático muito baixo em ambos os grupos, quase nunca fazendo micrometastase, mesmo quando injetadas em circulação (ou seja, visíveis no CHT a 24 hpi, mas a 4 dpi elas não estão mais lá, Hs578T por exemplo)8. No entanto, encontramos claramente outro grupo - um que só é capaz de formar micrometastase quando injetado em circulação (só podemos observar micrometastase no grupo CIRC). Isso sugere que essas células têm baixa eficiência na realização dos primeiros passos da cascata metastática, mas, por outro lado, são capazes de sobreviver em circulação, extravasar e colonizar um local distante.
Imunostaining e imagem Antes da fixação, este protocolo de injeção pode ser usado para outras abordagens de imagem ao vivo, como microscopia de contraste de interferência diferencial ao vivo (DIC), microscopia de disco giratório, imagem confocal ao vivo de alta resolução e microscopia de folha de luz, etc.
Células mortas e detritos celulares aparecem brilhantes quando observados através do estereóscópio fluorescente e podem ser confundidos com células vivas, especialmente se o objetivo do estudo é avaliar o potencial metastático das linhas celulares. Gostaríamos de salientar a importância da realização de imagens confocal com marcadores de viabilidade específicos e DAPI para avaliar o estado de sobrevivência do tumor e da micrometastase. Além disso, é fundamental usar anticorpos humanos específicos para detectar células humanas, como mitocôndrias anti-humanas ou HLA anti-humana. Ao implementar o protocolo, treine os olhos experimentador comparando a coloração no estereóscópio com as imagens confocal. Depois de algum tempo, os experimentadores podem distinguir claramente detritos de células vivas no estereóscópio fluorescente.
Embora outros métodos para quantificar a carga tumoral, como toda a área de fluorescência, sejam amplamente utilizados, recomendamos a realização de imunostaining de montagem inteira e imagem confocal como um método mais preciso. Não só a eficiência da coloração lipofílica de corante é muito variável (ou seja, algumas células são muito bem manchadas, enquanto outras não são - provavelmente devido ao conteúdo lipídico de suas membranas), mas também muitas vezes corantes lipofílicos formam agregados, e células mortas tendem a ser mais brilhantes - criando vários artefatos que podem ser confundidos com células vivas.
As células podem ser transduzidas com proteínas fluorescentes para ajudar no seu rastreamento e para pular a rotulagem celular. No entanto, certifique-se de que as células transduzidas e não transduzidas produzam os mesmos resultados nos xenoenxertos de zebrafish.
Além disso, os macrófagos podem fagociar esses detritos celulares fluorescentes tornando-se fluorescentemente rotulados e migrando, gerando falsas células metastáticas positivas. Assim, recomendamos uma série de ferramentas analíticas, que, naturalmente, podem ser estendidas a muitas outras leituras para uma interpretação mais precisa do comportamento tumoral:
<ul style="list-style-type: square;"><li>
Proliferação - quantificação de figuras mitóticas com anticorpo DAPI ou anti-pHH3Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),</li>
	<li>
Morte celular por apoptose- anticorpo anti-ativado Caspase3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) ou equivalente,</li>
	<li>
Tamanho do tumor - contagem de DAPI- as células tumorais humanas mostram uma organização de cromatina muito distinta, por isso são facilmente distinguidas das células de zebrafish e é sempre possível verificar novamente com o corante (quando você está treinando seu olho),</li>
	<li>
Para estudos metastáticos, para detectar inequivocamente células humanas, - HLA anti-humano (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), mitocôndrias anti-humanas (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).</li>
</ul>Para uma aquisição confocal com intervalo de 5 μm entre as fatias na pilha Z das células cancerígenas de controle HCT116 (tamanho nuclear médio de 10-12 μm de diâmetro) com a contra-magem DAPI, observamos que ~50% das células são compartilhadas entre duas fatias consecutivas. Portanto, se cada fatia for contada, há um alto risco de contar as mesmas células duas vezes. Ir e voltar entre fatias para evitar problemas na quantificação resulta em uma técnica demorada e propensa a erros. Para facilitar a quantificação do número total de células e permitir mais reprodutibilidade entre os pesquisadores, criamos a fórmula de tamanho do tumor descrita anteriormente neste protocolo8.
Incluímos um número de correção (1,5) para explicar as células ~50% compartilhadas entre as fatias. Descobrimos que o erro médio de contagem manual de todo o tumor entre os pesquisadores foi de 20%. Dois pesquisadores que usaram a fórmula tiveram um erro de 2%. O uso desta fórmula tem uma taxa de precisão de 93% e 98% de taxa de reprodutibilidade. Também testamos métodos automatizados, mas eles demonstraram um erro superior a 50% causado por ajustes de limiar.
Devido às características das células apoptóticas, a quantificação das células Caspase 3 ativadas é mais difícil. Para reduzir o número de erros e a variação dos resultados, recomendamos que o controle e as amostras experimentais sejam contados pelo mesmo pesquisador. Além disso, ao aprender essa técnica, um novo pesquisador deve contar imagens que já foram quantificadas por pesquisadores mais experientes para comparar resultados e treinar.
O comprimento do ensaio pode ser estendido se necessário. No entanto, é importante considerar que as larvas de zebrafish requerem alimentação viva a partir de ~7 dias após a fertilização (5 dias após a injeção). Além disso, as diretrizes e regulamentos de bem-estar animal aplicados às larvas com mais de 6 dias após a fertilização podem variar.
Este protocolo fornece ferramentas úteis para permitir que um único pesquisador injete aproximadamente ~200-300 larvas de zebrafish por hora; e resultados para o ensaio completo, incluindo análise e interpretação estatística, obtidos em três semanas. Esperamos que este protocolo possa ajudar os pesquisadores a se tornarem especialistas na geração de xenoenxertos de zebrafish. Não é fácil; você precisa praticar, mas você vai chegar lá. Boa sorte!

O zebrafish (Danio rerio) está emergindo como um poderoso organismo modelo vertebrado para estudar o desenvolvimento e a doença. O zebrafish compartilha características genéticas altamente conservadas (~70% de homologia genética e ~84% de genes relacionados à doença) e características morfológicas básicas de órgãos com humanos1,2. Essa conservação permite o uso de zebrafish para modelar várias doenças humanas, incluindo o câncer3,4.
O manuseio e manutenção de zebrafish é muito mais fácil e econômico do que os camundongos devido ao seu pequeno tamanho, alta fecundidade durante todo o ano e fertilização externa3,5. Os embriões de zebrafish não necessitam de alimentação viva durante seus primeiros 5-7 dias de vida e têm sido usados como um modelo eficaz para o desenvolvimento, infecção e câncer1,4,6,7. Os embriões de zebrafish chocam a 48 horas após a fertilização (hpf) e são animais de natação livre com todos os órgãos formados, um sistema circulatório pulsante e funcional, fígado, cérebro, medula renal, etc.1,3. Além disso, nesta fase de desenvolvimento apenas a imunidade inata está em jogo, a imunidade adaptativa ainda está em desenvolvimento, permitindo um enxerto eficiente geral de células humanas sem necessidade de uso de mutantes imunocomprometidos7,8. No entanto, é importante notar que nem todas as células humanas engrafam igualmente9 e que, por exemplo, para as células de leucemia foi demonstrado que os fagocitos (neutrófilos e macrófagos) precisam ser esgotados para um enxerto eficiente10.
A trato genética dos zebrafish e a transparência óptica de seus estágios embrionários iniciais permitem imagens intravitais de célula única em alta resolução e, portanto, para o estabelecimento de técnicas de imagem de última geração em diversos campos da biologia. Além disso, no contexto do câncer, essas características são úteis para estudos em tempo real dos estágios iniciais das interações hospedeira-tumor, como o estudo do potencial angiogênico e metastático, bem como interações com o sistema imunológico inato8,9,11,12,13.
Embora no curto ensaio xenoenxerto não haja tempo para "evolução" metastática- é possível analisar a capacidade metastática das células tumorais (ou seja, sua eficiência para passar por etapas metastáticas como invasão, intravasão, sobrevivência em circulação, extravasão e colonização, e, portanto, estudar esses processos in vivo e em tempo real8,11,13,14).
As características de seu ciclo de vida colocam o zebrafish como um modelo único para a medicina personalizada no câncer. Os ensaios podem ser realizados em um período de tempo mais curto e os resultados obtidos em poucas semanas7,8,9,11,12,15,16. A celeridade e a viabilidade desses ensaios proporcionam aos médicos e pesquisadores a possibilidade de obter resultados translacionais que possam ser úteis para pacientes com câncer, para os quais o tempo é uma necessidade essencial.
Apesar das tentativas crescentes de gerar xenoenxertos de embrião de zebrafish bem sucedidos, ainda há necessidade da padronização do procedimento de injeção, bem como da avaliação da viabilidade celular e do comportamento tumoral após a injeção.
Neste protocolo, fornecemos aos pesquisadores um guia passo a passo claro e detalhado para a injeção de linhas de células cancerígenas humanas em embriões de zebrafish e posterior fixação, imunostaining, imagem e quantificação do comportamento das células tumorais.

<table><tbody><tr><td>Ágar para bacteriologia</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td>Placa de ágar</td></tr><tr><td>anti-Caspase3Asp175 (Coelho monoclonal)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>9661</td><td>Anticorpo primário para imunocoloração de montagem total (Diluição 1:100)</td></tr><tr><td>HLA anti-humano (Coelho monoclonal)</td><td>Abcam EP1395Y</td><td>ab52922</td><td>Anticorpo primário para imunocoloração de montagem total (Diluição 1:100)</td></tr><tr><td>anti- 488 (Coelho monoclonal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35552</td><td>Anticorpo secundário para imunocoloração de montagem inteira (Diluição 1:200)</td></tr><tr><td>anti- 594 (Coelho monoclonal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35560</td><td>Anticorpo secundário para imunocoloração de montagem inteira (Diluição 1:200)</td></tr><tr><td>CellTracker Corante vermelho escuro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34565</td><td>Corante lipofílico (Diluição 1:1000)</td></tr><tr><td>CellTracker Corante verde CMFDA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Corante lipofílico (diluição 1:1000)</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico 50mL</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico 15mL</td><td>VWR</td><td>525-0604</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>Contracoloração nuclear e cromossômica</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta baseado em laser P-2000</td><td>Micropipeta de instrumento</td><td></td> Sutter <td> Extrator</td></tr><tr><td>de tubo de microcentrífuga 1.5mL</td><td>Abdos</td><td>P10202</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio, borda cortada</td><td>RS França</td><td>BPB016</td><td>Lâminas para montagem</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Meio de montagem</td></tr><tr><td>Pneumático Picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>Microinjetor</td></tr><tr><td>Óculos de cobertura retangulares, Menzel Gl&auml; ser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>631-9430</td><td>Lamínulas para montagem</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Placa de ágar</td></tr><tr><td>Capilares de vidro de parede fina</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Capilares de borossilicato</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605036</td><td>Solução de desprendimento enzimático</td></tr><tr><td>Vaselina</td><td></td><td></td><td>Vaselina para slide selagem</td></tr><tr><td>Corante Vybrant CM-DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22888</td><td>Corante lipofílico (Diluição 1:1000)</td></tr><tr><td>Solução de Marcação de Células Vybrant DiO</td> Corante Lipofílico <td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td>(Diluição 1:1000)</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Zoom.V16 para Biologia</td><td>ZEISS</td><td></td><td>&nbsp; Microscópio confocal de fluorescência Microscópio de zoom estéreo</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de xenoenxertos larval de zebrafish e análise do comportamento do tumor

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Xenoenxertos larval de zebrafish estão sendo amplamente utilizados para pesquisas sobre câncer para realizar estudos in vivo e em tempo real do câncer humano. A possibilidade de visualizar rapidamente a resposta às terapias anticâncgenas (quimioterapia, radioterapia e biológica), angiogênese e metástase com resolução celular única, coloca o modelo de xenoenxerto de zebrafish como uma das principais escolhas para desenvolver estudos pré-clínicos.

O ensaio larval de xenoenxerto de zebrafish apresenta várias vantagens experimentais em comparação com outros modelos, mas provavelmente o mais marcante é a redução da escala de tamanho e, consequentemente, do tempo. Essa redução de escala permite imagens de células únicas, o uso de um número relativamente baixo de células humanas (compatível com biópsias), triagens de medicamentos de alto rendimento, mas o mais importante permite uma redução significativa do tempo do ensaio. Todas essas vantagens tornam o ensaio de xenoenxerto de zebrafish extremamente atraente para futuras aplicações de medicamentos personalizados.

Muitos protocolos de xenoenxerto de zebrafish foram desenvolvidos com uma ampla diversidade de tumores humanos; no entanto, ainda falta um protocolo geral e padronizado para gerar xenoenxertos larval de zebrafish. Aqui fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.

Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Xenoenxertos de zebrafish estão sendo amplamente utilizados para pesquisas sobre câncer. Você pode pegar células tumorais humanas e injetá-la em pequenos zebrafish larvas, ou mesmo em adultos. Aqui, o que estamos apresentando é um protocolo passo a passo do modelo larva, onde podemos estudar várias marcas de câncer humano em um animal vivo.Você pode estudar a proliferação, você pode estudar angiogênese, você pode estudar metástase, e também interações dentro do microambiente tumoral. E uma grande vantagem é que você pode estudar isso em um período de tempo muito curto. Apenas quatro dias, por exemplo.Outra grande vantagem é que você pode estudar isso ao vivo com resolução de célula única, usando um microscópio confocal ou uma folha de luz. Você pode estudar como as células migram, como as células interagem entre si, ou até mesmo como elas conversam entre si. Então é um modelo muito poderoso para estudar biologia do câncer.Xenoenxertos de zebrafish podem ser usados para estudar a resposta a terapias anticâncgenas, como quimioterapia, radioterapia ou até mesmo terapias-alvo com anticorpos. E, finalmente, também, este protocolo também pode ser adaptado para usar células derivadas do paciente a partir de uma amostra cirúrgica, ou mesmo de biópsias, e, em seguida, gerar os avatares de zebrafish. Preparando-se para injeção.Duas semanas antes da injeção, expanda as células na cultura. Comece com o excesso de células e o excesso de peixes até se tornar proficiente com a técnica, já que muitas células e peixes serão perdidos durante o treinamento. A tabela um do PDF que acompanha tem um guia detalhado das porcentagens ideais de confluência in vitro para injeção de várias linhas celulares.Três dias antes da injeção, cruze o zebrafish do fundo desejado. 24 horas antes da injeção. Limpe as placas de embrião de zebrafish.Descarte todos os embriões mortos e não desenvolvidos e atualize o meio E3. Na sala de cultura celular, descarte o meio de cultura celular. Lave uma vez com PBS 1X para remover as células mortas e adicione meio fresco.Prepare as ferramentas para o procedimento de injeção, como agulhas de microinjeção, placas de ágarose e grampos de cabelo para alinhar os embriões para injeção. Para a preparação da placa, despeje uma camada de 2% de agarose dissolvida na tampa de uma placa de Petri limpa. Deixe polimerizar e com a ajuda de uma régua, faça de três a quatro linhas retas de agarose para o alinhamento dos embriões.Dia da injeção. Separe os embriões eclodidos de ovos não-descomparáveis. Adicionar Pronase ao meio do embrião nesta fase pode impulsionar a eclosão.Coloque os embriões na incubadora a 28 graus Celsius até a injeção. Rotulagem celular para injeção. Para ajudar no estabelecimento de uma técnica de rotulagem celular reprodutível, verifique as tabelas um e dois do protocolo escrito para uma compilação de uma lista de linhas celulares e várias soluções de rotulagem.Remova o meio de cultura celular e lave o frasco duas vezes com PBS 1X. Rotule as células com um corante lipofílico, evitando a exposição à luz, e incubar o frasco a 37 graus. Você também pode optar por rotular as células em um tubo de microcentrifuge de 1,5 ml após o descolamento.Remova a solução de rotulagem celular e lave as células com PBS 1X para retirar o excesso de corante. Adicione o agente de desprendimento correspondente e incuba as células a 37 graus Celsius. Facilite o processo de desprendimento escovando o frasco com um raspador de células estéril e coletar as células com uma pipeta sorológica.Transfira as células para tubos de microcentrifuuagem de 1,5 ml e centrífuga. Descarte o supernasce e suspenda a pelota com meio de cultura celular. Quantifique a viabilidade celular usando uma câmara de Neubauer com exclusão azul trypan ou outro método de escolha.Centrifugar e suspender as células no meio de injeção. As concentrações recomendadas de células em médio podem ser encontradas na tabela um do manuscrito. A partir deste ponto, as células devem ser mantidas no gelo.Procedimentos de injeção. Anestesiar os embriões em tricaine 1X por 5 minutos. Em seguida, transfira uma pequena quantidade de embriões anestesiados para uma placa de agarose e alinhe-os com a ajuda de um laço de grampo.Certifique-se de manter distância entre os embriões. Especialmente entre a gema de um e a cabeça da próxima. Para evitar a mortalidade, certifique-se de que os embriões alinhados não sequem na placa de agarose, adicionando cuidadosamente uma a três gotas de solução tricaine 1X à placa.Toque levemente no tubo de microcentrifuge para suspender as células. Encarregar a agulha de injeção com uma suspensão celular usando uma ponta microcarregadora, evitando bolhas de ar, pois podem comprometer a integridade dos embriões. Abra a válvula de pressão de ar, configure o microinjetor e coloque cuidadosamente a agulha de microinjeção no suporte.Corte a agulha de microinjeção perto da ponta. Fure cuidadosamente a gema do embrião, baixando o ângulo da agulha e empurrando cautelosamente até que a ponta da agulha atinja o espaço perivitelline. Uma vez que a ponta esteja no espaço perivitelline, injete as células.Tente injetar um volume de células semelhante ao tamanho do olho do embrião, e o mais longe possível do coração para evitar edema cardíaco. Ajuste a pressão do microinjetor, se necessário. Transfira os embriões injetados para uma placa de Petri limpa com solução tricaine 1X e deixe descansar por cinco a 10 minutos.Isso dará tempo para a ferida fechar. Remova a solução tricaine 1X e adicione um novo meio E3. Em seguida, incubar os embriões a 34 graus Celsius.Esta temperatura permitirá a sobrevivência tanto dos embriões de zebrafish quanto das células tumorais humanas. Ensaio metastático. Se você quiser estudar o potencial metastático de suas linhas celulares, em cerca de uma hora após a injeção, trie os embriões injetados em um estereóscópio de fluorescência, e classifique-os em dois grupos de acordo com a ausência ou presença de células cancerígenas em circulação.Um dia após a injeção. Em um estereóscópio de fluorescência, analise cuidadosamente cada embrião e selecione aqueles com tumores devidamente injetados. Classifique os xenoenxertos selecionados de acordo com o tamanho do tumor.Use o tamanho do olho para comparação. Descarte quaisquer embriões com morfologia anormal, edema cardíaco ou gema, xenoenxertos com pouquíssimas células cancerígenas, ou aqueles com células cancerosas apenas dentro da gema. Distribua os xenoenxertos de acordo com o layout experimental desejado e inicie o ensaio da droga.Substitua as drogas e o meio E3 diariamente. Incubar os xenoenxertos, mantendo a temperatura de 34 graus Celsius até o final do ensaio. Quatro dias após a injeção.No último dia do ensaio, anestesia os xenoenxertos com solução tricaine 1X, e alinhe-os cuidadosamente na placa de ágar. Descarte xenógrafos mortos ou inchados. Estes xenoenxertos não são considerados para quantificação de engrafamento.Em um estereóscópio de fluorescência, analise cuidadosamente cada xenoenxerto e avalie a ausência ou presença de tumores no espaço perivitelline. De acordo com a configuração experimental, selecione os xenoenxertos de interesse e eutanize-os com tricaine 25X. Fixá-los em 4% de formaldeído por pelo menos 4 horas em temperatura ambiente para prosseguir com a imunossuagem.Caso contrário, armazene durante a noite a quatro graus Celsius e no dia seguinte, substitua o formaldeído por 100%de metanol. Xenoenxertos fixados em 100% de metanol podem ser armazenados a 20 graus indefinidamente. Imunostaining de montagem inteira para imagens confocal.Toda a técnica de imunofluorescência do monte leva três dias, dividida da seguinte forma. O primeiro dia é para permeabilização dos xenoenxertos e incubação de anticorpos primários. No segundo dia, para lavagem e incubação de anticorpos secundários.E o terceiro dia, para lavagem, fixação de xenoenxertos e armazenamento no meio de montagem. Mais detalhes deste procedimento podem ser encontrados no PDF que acompanha. Montagem de xenoenxertos.Sele as bordas de um deslizamento de cobertura com geleia de petróleo ou graxa de silicone, para que o meio de montagem não vaze. Usando uma pipeta Pasteur, transfira os xenoenxertos para o deslizamento da tampa. Alinhe-os cuidadosamente com um grampo de cabelo.Adicione o meio de montagem a outro deslizamento de cobertura. Junte cuidadosamente ambos os deslizamentos de cobertura e coloque-os em cima de um slide de microscópio para permitir uma manipulação mais fácil. Imagem confocal.Uma lente objetiva de imersão apochromatic 25X com correção de água é ideal para tumores de imagem com resolução de uma única célula. Adquira as amostras usando a função Z-Stack com um intervalo de cinco mícrons entre cada fatia. Abra os dados brutos no software Fiji.Selecione três fatias representativas do tumor de cima, médio e inferior, por pilha z, por xenoenxerto. Abra o plugin Cell Counter do software Fiji. Na ferramenta Contador de células, clique em Inicializar, selecione um tipo de contador e clique na imagem para iniciar o modo de contagem manualmente.Para cada clique, o contador pergunta quantas células são contadas. Para obter o número total de células no tumor, use a seguinte fórmula. Avaliar números totais ou percentual de marcadores, como células imunes, figuras mitóticas, caspase ativada, entre outros, quantificar manualmente as células positivas à rotulagem específica, marcador ou transgene de interesse ao longo de todas as fatias da pilha z com o plugin Cell Counter.Esteja ciente de que algumas células estarão localizadas entre duas fatias. Vá e volte na pilha z para ter certeza de que nenhuma célula está sendo contada duas vezes. Resultados representativos.Os xenoenxertos da linha de células cancerígenas colorretal HCT 116 foram gerados conforme descrito no protocolo. Os xenoenxertos foram distribuídos aleatoriamente em controles não tratados e quimioterapia FOLFIRI. A imunofluorescência foi realizada para detectar células apoptóticas, utilizando anticorpos caspase-3 anti-fenda e DAPI para contra-retenção nucleica.A quantificação do índice mitótico, apoptose e tamanho do tumor, revelou que o FOLFIRI induz uma diminuição significativa da mitose e uma indução significativa da apoptose, acompanhada de uma redução de 54% do tamanho do tumor. Essas características são úteis em telas de medicamentos fenotípicos de alto rendimento, bem como para testar os efeitos intrínsecos e fisiológicos de várias tratamentos de câncer em um curto espaço de tempo. Outra grande vantagem do modelo de xenoenxerto de zebrafish é que é possível estudar as interações de diferentes células tumorais e analisar como cada tipo de célula pode influenciar o comportamento do outro.Diferentes células cancerígenas humanas, clones diferentes do mesmo tumor, ou de tumores diferentes, podem ser co-injetados. Neste exemplo, duas linhas de células cancerígenas colorretais derivadas do mesmo paciente foram rotuladas com diferentes corantes lipofílicos e misturadas em uma proporção de um para um para injeção. Esperamos que este protocolo possa ajudar os pesquisadores a se tornarem verdadeiros especialistas na geração de xenoenxertos de zebrafish.Não é fácil. Você precisa praticar, praticar. Não desista.Tenho certeza que você vai chegar lá. Boa sorte.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve a técnica para criar um modelo de xenoenxerto derivado de paciente peixe-zebra. No protocolo da amostra, avaliamos a eficiência dos fármacos Gemcitabina e Navitoclax no modelo de xenoenxerto de tumor pancreático.

Xenoenxerto derivado de paciente de peixe-zebra (zPDX): um modelo de câncer

Este vídeo descreve um método de microinjeção para entrega de células de câncer de mama no espaço perivitelino de embriões transgênicos de peixe-zebra. Após a incubação, visualizamos o embrião sob um microscópio fluorescente para observar a invasão, disseminação e metástase das células cancerígenas.

zPDX-Análise de Invasividade: Investigando o Comportamento Invasivo de Células Cancerígenas Metastáticas em Xenoenxertos de Embrião de Peixe-Zebra

Este vídeo descreve o ensaio de xenoenxerto de peixe-zebra para avaliar a formação de tumores in vivo e estudar o efeito de agentes terapêuticos.

Ensaio de Xenoenxerto de Peixe-Zebra: Um Método para Avaliar a Eficácia Anticancerígena da Terapêutica na Tumorigenicidade em Peixe-Zebra In Vivo

O transplante de células cancerosas é uma ferramenta importante para a identificação de mecanismos de câncer e respostas terapêuticas. As técnicas atuais dependem de animais imune-incompetentes. Descrevemos aqui um método para transplantar células tumorais de zebrafish em embriões imunocompetentes para a análise a longo prazo do comportamento de células tumorais e respostas de fármacos in vivo .

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

Este protocolo descreve procedimentos da optimização em um modelo fluorescência-etiquetado duplo baseado em vírus do xenograft do tumor usando o zebrafish larval como anfitriões. Este modelo heterogêneo do xenograft imita a composição do tecido do microambiente pancreatic do cancro in vivo e sere como uma ferramenta mais precisa para avaliar respostas da droga em modelos personalizados de zPDX (xenograft paciente-derivado de zebrafish).

Modelo de Xenoenxerto heterogêneo derivado do paciente do câncer pancreático usando larvas de zebrafish como hospedeiros para avaliação comparativa de fármacos

O objetivo deste método é gerar um modelo in vivo de angiogênese tumoral por xenoenxertos de células tumorais de mamíferos em um embrião de zebrafish que tem vasos sanguíneos com rótulo fluorescentamente. Por imagem do Xenoenxerto e vasos associados, uma medida quantitativa da resposta angiogênica pode ser obtida.

In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Os modelos pré-clínicos visam avançar no conhecimento da biologia do câncer e predizer a eficácia do tratamento. Este trabalho descreve a geração de xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) à base de peixe-zebra com fragmentos de tecido tumoral. Os zPDXs foram tratados com quimioterapia, cujo efeito terapêutico foi avaliado em termos de apoptose celular do tecido transplantado.

Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Descrevemos um protocolo de xenotransplante na gema de embriões transparentes de peixe-zebra que é otimizado por um método de estadiamento simples e rápido. As análises pós-injeção incluem sobrevida e avaliação da carga da doença de células xenotransplantadas por citometria de fluxo.

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para implantação automatizada de xenoenxerto tumoral em larvas de peixe-zebra usando um sistema de injeção robótica de última geração. Além disso, apresentamos vídeos de injeção e dados de validação que demonstram o desempenho bem-sucedido do sistema.

Automatizando a implantação de tumores em larvas de peixe-zebra para pesquisa e medicina do câncer

Aprenda a gerar xenoenxertos larvais de zebrafish com células tumorais humanas para análise de proliferação, angiogênese e metástase em resolução de célula única. Este protocolo padronizado permite triagem de drogas de alta vazão e aplicações em medicina personalizada.

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

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