Name: Dissecção do saco endolinfático de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: Aprenda a dissecção microscópica do saco endolinfático de camundongos usando marcadores fluorescentes e imunohistoquímica. Este método permite isolar o tecido para análise transcriptômica e estudos de desenvolvimento da orelha interna.

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<ol><li>Dror, A. A., Brownstein, Z., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+human+and+mouse+genetics+reveals+pendrin+function+in+hearing+and+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Integration of human and mouse genetics reveals pendrin function in hearing and deafness.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 28 (3), 535-544 (2011).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Crystalgen</td><td>221-057</td><td></td></tr><tr><td>Seringa TUBERCULIN de 1 mL com 27G x 13mm</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>placa de vidro spot de 9 poços</td><td>Pyrex</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-conjugado com faloidina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Artéria&nbsp; Tesoura - Ponta de Bola</td><td>Fine Science Tools</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Câmera para capturar imagens em luz incidente</td><td>Leica</td><td>DFC 495</td><td></td></tr><tr><td>Câmera para capturar imagens fluorescentes</td> Tubos de centrífuga <td>Leica</td><td>DFC 7000 GT</td><td></td></tr><tr><td>15 mL</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td></td><td>Corning 430829</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro</td><td>Corning</td><td>2940-223</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Bonn Extra Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Alternativa: Tesoura Micro Dissecadora Extra Fina; Reto; Pontas afiadas; Comprimento da lâmina de 20mm; 3 1/2" Comprimento total</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 de cabra</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>MicroSlides Superfrost</td><td>VWR</td><td>48311-702</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital, por exemplo Mini Shaker</td><td>Daigger</td><td>980275</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA) 16% Solução Aquosa</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (10X) pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant com DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anti-Pendrina para coelhos</td><td>RRID interno</td><td></td><td>: AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011)</td></tr> <tr><td>Pinça de anel</td><td>Ferramentas de ciências</td> <td>finas11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de balanço, por exemplo GyroMini</td><td>Labnet</td><td>S0500</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio equipado com uma objetiva PlanApo 1.0x</td><td></td> Lâminas de borda única de aço inoxidável Leica<td></td><td></td></tr><tr><td>, .009"</td><td>GEM Personna</td><td>62-0176</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte transparente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Orgânicos</td><td>32737-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção do saco endolinfático de camundongos

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

Cada etapa desta microdissecção de um saco endolinfático do tipo selvagem de um camundongo pós-natal dia 5 (P5) é detalhada no vídeo associado e instantâneos das principais etapas desta dissecção e abertura do saco endolinfático são apresentados na Figura 1 e Figura 2. 
Os resultados representativos das dissecções do saco endolinfático com fluorescência tdTomato no dia embrionário 16,5 (E16.5), P5 e P30, seguindo este protocolo, são apresentados na Figura 3 e na Figura Suplementar 1 e na Figura Suplementar 2. Usando um microscópio de dissecção com fluorescência, o saco endolinfático pode ser facilmente visualizado no crânio após a remoção do cérebro em camundongos portadores do transgene Tg (ATP6V1B1-Cre) na presença do repórter da expressão de Cre: Ai9 (LSL-RCL-tdT) (ver Figura 3A-B e Figura Suplementar 1 para imagens capturadas em luz incidente e fluorescência tdTomato do saco endolinfático em diferentes estágios da dissecção). Nesses camundongos, Cre é expresso como um mosaico em células ao longo do saco e ducto endolinfático (Figura 3, ver também Figura Suplementar 2 para visualização do saco endolinfático com versus sem repórter fluorescente). Embora a expressão deste repórter não seja específica para a expressão endógena de Atp6v1b1, que é restrita às células ricas em mitocôndrias do saco endolinfático16, um dos dois tipos celulares desse epitélio (Figura 5E), é um auxílio útil para identificar e dissecar o saco endolinfático.
As orelhas internas dissecadas de um modelo de camundongo para ampliação do aqueduto vestibular são apresentadas na Figura 4. Em comparação com os irmãos de ninhada de controle, os sacos endolinfáticos e ductos de camundongos deficientes para SLC26A4 (pendrina) estão aumentados.
Imagens representativas da imuno-histoquímica do saco endolinfático íntegro com e sem tecido conjuntivo são mostradas na Figura 5. Resultados de imuno-histoquímica do saco endolinfático aberto de um camundongo P5 selvagem também são apresentados (Figura 5F-G). O saco endolinfático é composto por uma única camada de epitélio dobrada em uma estrutura em forma de bolsa, contendo em seu lúmen endolinfa. Este epitélio consiste em dois tipos de células, células ricas em mitocôndrias e células ricas em ribossomos (Figura 5E). Um saco endolinfático de montagem total será achatado porque a endolinfa não está mais presente. O saco aparecerá como duas camadas entrelaçadas de epitélio, dificultando a determinação da localização subcelular das proteínas expressas neste epitélio. Ao abrir o saco endolinfático, o epitélio de camada única pode ser facilmente visualizado e a distribuição relativa das proteínas de interesse, em relação ao lúmen do saco endolinfático, pode ser determinada de forma mais definitiva. Um potencial enriquecimento apical (luminal, onde estaria a endolinfa) versus basal dessas proteínas pode ser determinado com mais precisão. Por exemplo, SLC26A4 é enriquecido no lado apical das células ricas em mitocôndrias (Figura 5F).
<img alt="Diagramas de dissecção do ouvido interno, mapeamento detalhado da cóclea e do nervo, configuração do estudo anatômico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1. Dissecção total do saco endolinfático de um camundongo selvagem no dia 5 pós-natal (P5). (A) Esquema do labirinto membranoso de um ouvido interno de camundongo desenvolvido (direita). A localização do saco endolinfático e as estruturas da cóclea e vestibular são indicadas. Essa figura foi modificada de Honda et al.16. (B) Corte sagital médio mostrando o hemicrânio esquerdo. A localização do saco endolinfático é indicada (seta). (O, occipital; F, frontal) (C) Cápsula ótica junto com a parte escamosa do osso temporal. (D) Marcos importantes sobrepostos à caixa pontilhada no painel C. (ES, saco endolinfático; DE, ducto endolinfático; VA, aqueduto vestibular; ASC, canal semicircular anterior; CEP, canal semicircular posterior; CC, crus comuns; SS, seio sigmóide) (E) Ilustração esquemática da seção transversal junto com a linha branca contínua no painel D através do saco endolinfático. O lado proximal do saco endolinfático é coberto por um canal ósseo chamado aqueduto vestibular, juntamente com o ducto endolinfático. No lado distal, o saco endolinfático, circundado por tecido conjuntivo (TC), estende-se e projeta-se para fora do labirinto ósseo e é imprensado entre a dura-máter (DM) e o seio sigmóide com a parte escamosa do osso temporal (TB). (F) Uma agulha fina é usada para cortar ao redor do saco endolinfático (seguindo as linhas amarelas pontilhadas no painel D). (G) A preparação é cuidadosamente removida do osso temporal, mantendo o tecido na posição mostrada pelo asterisco (*, também mostrado no painel E) e descascando-o. (H) Um saco endolinfático inteiro isolado com tecidos circundantes. (I) Versão esquemática deste saco endolinfático isolado com tecidos circundantes. (J) Saco endolinfático isolado sem tecidos circundantes. Barras de escala: 2 mm (B), 1 mm (J). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Séries de dissecação, exposição do esôfago, diagramas anatômicos, amostras de tecido, ferramentas cirúrgicas utilizadas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2. Dissecção do saco endolinfático aberto de um camundongo P5 selvagem. (A) Na etapa 2.4, a linha de incisão no aqueduto vestibular é posicionada ligeiramente anterior (linha pontilhada vermelha) para fazer uma incisão no lúmen do saco endolinfático. (B) Segure a parte da haste da preparação, insira uma agulha de calibre 27 no lúmen e mova-a para cortar o saco endolinfático em duas folhas. (C) Ilustração esquemática do painel B. (D) Segure a borda de cada folha com uma pinça e separe-as umas das outras. (E) Ilustração esquemática do painel D. (F) O saco endolinfático é separado em duas folhas, incluindo o epitélio e os tecidos circundantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Desenvolvimento do cérebro de camundongos, microscopia de fluorescência, estágios E16.5 a P30, imagens de tecido neural." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3. Dissecção de R26LSL-RCL-tdT/+; Saco endolinfático de camundongo Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn em E16.5, P5 e P30. Todas as imagens apresentadas mostram a fluorescência do tdTomato obtida usando um estereomicroscópio com uma objetiva de 1 x equipada para detecção de fluorescência do tdTomato. (A, B) Corte sagital médio do crânio de um E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg (ATP6V1B1-Cre) 1Rnel / Mn camundongo antes (A) e depois (B) da remoção do meio encéfalo. tdA fluorescência do tomate descreve a posição do ouvido interno. O saco endolinfático é facilmente visível mesmo sem dissecção (cabeça de seta). (C, E, G) Orelhas internas isoladas de camundongos E16.5, P5 e P30, respectivamente. (D, F e H) Imagens de maior ampliação dos sacos e ductos endolinfáticos microdissecados correspondentes. Em P30, o ducto endolinfático é encapsulado em osso, tornando-o particularmente difícil de isolar. Barras de escala: 2 mm (A, B, C, E, G), 500 μm (D, F, H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Duas seções do ouvido interno, Slc26a4+/− e Slc26a4−/−, mostradas na imagem do microscópio para estudo genético." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4. Anatomia macroscópica da cápsula ótica com saco endolinfático aumentado. Orelhas internas de irmãos de ninhada de camundongos Slc26a4+/- (esquerda) e Slc26a4-/- (direita) em P105. O aqueduto vestibular e o saco e ducto endolinfático (linhas pontilhadas pretas) são aumentados no camundongo Slc26a4-/- em comparação com os de um camundongo Slc26a4+/- . Barra de escala: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Ensaio de imunofluorescência, proteínas SLC26A4 e ACTB, diagrama de células epiteliais, resultados de microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5. SLC26A4 expressão de células ricas em mitocôndrias no epitélio do saco endolinfático em E16.5 e P5. (A, B) Saco endolinfático isolado de camundongo E16.5 marcado com anticorpo anti-SLC26A4 (verde) e faloidina que marca β-actina (ACTB, vermelho). (C) Uma imagem de baixa ampliação do saco endolinfático aberto do camundongo P5 marcado com um anticorpo anti-SLC26A4 (verde). A faloidina (ACTB, vermelho) pode ser usada para destacar a presença do saco endolinfático, bem como do tecido conjuntivo ao seu redor. (D) Saco endolinfático isolado marcado com um anticorpo anti-SLC26A4 (verde). (E) Ilustração esquemática do epitélio do saco endolinfático destacando a presença de dois tipos de células: as células ricas em mitocôndrias, cuja superfície apical é coberta por microvilosidades, e as células ricas em ribossomos. (F-G) Imagens de alta ampliação do epitélio do saco endolinfático em P5, após a abertura do saco endolinfático e marcada com um anticorpo anti-SLC26A4 (verde) e faloidina (ACTB, vermelho). Uma imagem representativa no nível da membrana apical é mostrada em G, e uma seção transversal reconstruída da pilha z no nível da linha branca pontilhada é mostrada em F. O núcleo das células é marcado com DAPI (azul). Barras de escala: 100 μm (A, B); 200 μm (C, D) ; 20 μm (F, G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1. Imagens de fluorescência de luz incidente e tdTomato correspondente de um P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Orelha interna de camundongo Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn em três etapas da dissecção. O saco e o ducto endolinfáticos podem ser facilmente visualizados usando a fluorescência tdTomato. (AB) Região do ouvido interno na parte posterior de um meio crânio intacto de um P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Camundongo Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn. (CD) A retirada da pele e parte do crânio permite uma melhor visualização da região do saco endolinfático. (E, F) Orelha interna isolada com o saco endolinfático ainda associado ao tecido conjuntivo. (A, C, E) Imagens capturadas na luz incidente. (B, D, F) tdFluorescência do tomate do tecido correspondente. Barras de escala: 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2. Comparação da fluorescência de sacos endolinfáticos isolados de R26LSL-RCL-tdT/+; Camundongos Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn e R26LSL-RCL-tdT/+ irmãos de ninhada em E16.5 e P5. A fluorescência do tomate facilita muito o reconhecimento do saco e ducto endolinfático. (AC) Sacos endolinfáticos microdissecados de E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) e R26LSL-RCL-tdT/+ camundongos irmãos de ninhada (B, C). (D-F) Sacos endolinfáticos microdissecados de P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) e R26LSL-RCL-tdT/+ camundongos irmãos de ninhada (E, F). (A, B, D, E) tdFluorescência do tomate. (C, F) Imagens de luz incidente correspondentes a B e E. Barras de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure2.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Dissecção do saco endolinfático de camundongos

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Discutimos as características clínicas e radiológicas dos tumores do saco endolinfático e relatamos a metodologia e os resultados de uma remoção cirúrgica em um caso atendido em nosso centro de referência otológica.

Tratamento cirúrgico de um tumor do saco endolinfático

A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.

Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

Aqui, descrevemos uma técnica para a coleta de órgãos-alvo vestibulares humanos sob condições fisiológicas durante a labirintectomia e sua análise usando imunocoloração.

Colheita de órgãos-alvo vestibulares sob condições fisiológicas durante a labirintectomia

Aqui, é apresentado um protocolo para avaliar os vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de camundongos, que desempenham um papel importante em múltiplas doenças neurológicas. O objetivo desse protocolo é fornecer um método integrado que permita tanto a avaliação funcional da drenagem dos traçadores quanto a caracterização morfológica detalhada da rede de MLVs dorsais.

Protocolo Integrado para Avaliação de Linfáticos Meníngeos: Injeção de Cisterna Magna, Imagem de Linfonodos, Dissecção Meníngea e Coloração em Montagem Inteira

Aprenda a dissecção microscópica do saco endolinfático de camundongos usando marcadores fluorescentes e imunohistoquímica. Este método permite isolar o tecido para análise transcriptômica e estudos de desenvolvimento da orelha interna.

Dissecção do saco endolinfático de camundongos

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