Teste Rápido de Suscetibilidade a Antimicrobianos por Imagem de Dispersão Raman Estimulada da Incorporação de Deutério em uma Única Bactéria

Este protocolo apresenta ensaio rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) em até 2,5 h por imagem de espalhamento Raman estimulado por célula única do metabolismo de D₂O. Este método aplica-se a bactérias no ambiente urinário ou no sangue total, o que é transformador para AST fenotípica de célula única rápida na clínica.

O teste rápido de suscetibilidade antimicrobiana pode ser obtido dentro de 2,5 horas na urina e no sangue, o que é considerado uma tremenda redução no tempo de análise em comparação com o método convencional de microdiluição em caldo. Pode monitorar a atividade metabólica bacteriana em um ambiente complexo, como o sangue total. Para começar, verifique a concentração bacteriana das amostras medindo a densidade óptica com um fotômetro no comprimento de onda de 600 nanômetros.

Para atingir uma concentração celular final de oito vezes 10 para a quinta Unidades Formadoras de Colônia, ou UFC, por mililitro, dilua a solução bacteriana usando o meio MHB normal sem deutério. Depois de misturar as células bacterianas por vórtice, remova as alíquotas de 300 microlitros da solução bacteriana em sete microtubos de 1,5 mililitro e uma alíquota de 600 microlitros da solução bacteriana em um microtubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 4,8 microlitros da solução de estoque de antibióticos no microtubo contendo 600 microlitros da solução bacteriana para atingir a concentração final de antibiótico de oito microgramas por mililitro.

Adicione 300 microlitros da solução bacteriana com antibiótico a uma alíquota de 300 microlitros da solução bacteriana sem antibiótico para obter uma solução diluída duas vezes com a concentração final de antibiótico de quatro microgramas por mililitro. Repetir a dupla diluição em série dos antibióticos de ensaio até atingir a concentração mais baixa de 0,25 microgramas por mililitro. Rejeitar 300 microlitros da solução do último microtubo.

Aloque um tubo sem antibióticos para o controle positivo com tratamento com deutério e o controle negativo sem deutério. Incubar a alíquota bacteriana com o antibiótico contendo MHB por uma hora. Enquanto isso, prepare uma diluição seriada de antibióticos com 100% de deutério contendo MHB em meio com os mesmos gradientes de concentração descritos anteriormente.

Após uma hora de incubação, adicione 700 microlitros de antibiótico diluído em série com 100% de deutério contendo MHB aos 300 microlitros de bactérias pré-tratadas com antibióticos na mesma concentração de antibióticos. Homogeneize a mistura pipetando para cima e para baixo várias vezes. Adicione 700 microlitros de 100% de deutério sem antibióticos contendo MHB médio a 300 microlitros de bactérias livres de antibióticos como controle positivo.

Adicione 700 microlitros de 0% de deutério sem antibióticos contendo MHB a 300 microlitros de bactérias livres de antibióticos como controle negativo. Incubar todos os microtubos a 37 graus Celsius e 200 rotações por minuto durante 30 minutos. Após a incubação, centrifugar um mililitro de antibiótico e deutério tratado com amostra bacteriana a 6, 200 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave o pellet duas vezes com água purificada. Fixar as amostras em solução de formalina volume a volume a 10% e armazená-las a quatro graus Celsius. Verifique a concentração de Escherichia coli a partir da amostra bacteriana recém-preparada medindo a densidade óptica com um fotômetro no comprimento de onda de 600 nanômetros.

Para imitar as amostras clínicas de infecção do trato urinário, aumente a amostra de Escherichia coli em 10 mililitros de amostras de urina não identificadas para atingir uma concentração final de 10 a seis UFC por mililitro. Filtre a urina cravada de Escherichia coli usando um filtro de cinco mícrons e divida a solução bacteriana filtrada em alíquotas de 300 microlitros em sete microtubos de 1,5 mililitro e uma alíquota de 600 microlitros em um microtubo de 1,5 mililitro. Realizar tratamento de incorporação de deutério na presença de antibióticos, conforme descrito anteriormente.

Para imitar as amostras clínicas de infecção da corrente sanguínea, espete Pseudomonas aeruginosa em um mililitro de sangue humano não identificado para atingir uma concentração final de 10 para a sexta UFC por mililitro. Para lisar o sangue, adicione nove mililitros de água purificada estéril. Filtre o sangue cravado de Pseudomonas aeruginosa usando um filtro de cinco mícrons.

Em seguida, colha as bactérias da amostra filtrada para um volume de um mililitro por centrifugação a 6, 200 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, dividir a solução sanguínea cravada de Pseudomonas aeruginosa em alíquotas de 300 microlitros em sete microtubos de 1,5 mililitro e uma alíquota de 600 microlitros da solução bacteriana em um microtubo de 1,5 mililitro e realizar o tratamento de incorporação de deutério na presença de antibióticos, conforme descrito anteriormente. Para a preparação da amostra, lave um mililitro de solução de bactérias fixas com água purificada e centrifugar a solução de bactérias lavada a 6, 200 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Retire o sobrenadante e enriqueça a solução bacteriana para cerca de 20 microlitros com água esterilizada. Deposite a solução bacteriana em um vidro de cobertura revestido de poli-L-lisina, sanduíche com outro vidro de cobertura e sele a amostra. No microscópio SRS, um laser de femtossegundo ajustável com uma taxa de repetição de 80 mega-hertz fornece a bomba e os lasers de excitação de Stokes.

O feixe de Stokes é modulado por um modulador acousto-óptico a 2,4 mega-hertz. Os dois feixes são coliquase combinados através de um espelho dicroico. Em seguida, a bomba e os feixes de Stokes são direcionados para um microscópio de varredura a laser construído em laboratório com um espelho Galvo 2D para digitalização a laser.

Um objetivo de água de 60x foca os lasers na amostra e um condensador de óleo coleta o sinal da amostra. Dois filtros são usados para filtrar o feixe de Stokes, enquanto o feixe da bomba é detectado por um fotodiodo, após o qual o sinal Raman estimulado é extraído por um amplificador de bloqueio. Usando o software de controle, insira e ajuste o comprimento de onda da bomba para 852 nanômetros.

Ajuste a frequência vibracional C a D para 2, número de onda 168 para obter imagens de bactérias usando um microscópio SRS. Meça a potência do laser usando um medidor de energia. Defina a potência do laser da bomba na amostra para oito miliwatts e a potência do laser de Stokes na amostra para 50 miliwatts, ajustando a placa de meia onda na frente da saída do laser.

Coloque a amostra padrão DMSO d6 no estágio da amostra e use uma objetiva de imersão em água de 60x para focar a bomba e os lasers Stokes na amostra. Ao ajustar os parafusos dos espelhos de reflexão, alinhe espacialmente a bomba e os feixes de Stokes e direcione os dois feixes para um microscópio vertical equipado com sistema de espelho 2D Galvo para digitalização a laser. No painel de controle do software, defina cada imagem SRS para conter 200 por 200 pixels e o tempo de permanência do pixel para 30 microssegundos.

O tempo total de aquisição para uma imagem é de cerca de 1,2 segundos. Defina o tamanho do degrau para 150 nanômetros, de modo que o tamanho da imagem seja de cerca de 30 por 30 micrômetros quadrados. Depois de otimizar o sistema, retire a amostra padrão e coloque a amostra bacteriana no estágio da amostra sob o objetivo de imersão em água de 60x.

Inicie a imagem SRS de amostras bacterianas. Mostre pelo menos três campos de exibição para cada amostra. O efeito do tempo de incubação na incorporação de deutério é medido por microespectroscopia Raman espontânea nas regiões CD e CH.

O gráfico da razão de intensidade CD sobre CH sobre o tempo de incubação do deutério para uma única bactéria mostrou aumento da DC sobre a intensidade de CH ao longo do tempo de incubação de zero a 180 minutos. A imagem SRS de Pseudomonas aeruginosa foi realizada na incubação com gentamicina e 70% de deutério. A análise estatística quantitativa adicional mostrou que os sinais de DC de bactérias foram significativamente menores em dois microgramas por mililitro, ou maior concentração de gentamicina do que sem tratamento com gentamicina.

O limiar de intensidade de corte em 0,60 concluiu que Pseudomonas aeruginosa foi inibida metabolicamente a dois microgramas por mililitro e concentrações mais elevadas de gentamicina. O SC-MIC para Pseudomonas aeruginosa contra gentamicina em meio MHB normal foi determinado como sendo de dois microgramas por mililitro, o que estava dentro da faixa de diferença de uma dobra com CIM de quatro microgramas por mililitro determinado pelo método de microdiluição em caldo. O Teste Rápido de Suscetibilidade Antimicrobiana, ou AST, de amostras de urina com espinhos de Escherichia coli foi realizado por meio de imagens SRS.

O SC-MIC para a amostra de urina com espinhos de Escherichia coli contra amoxicilina foi determinado como sendo de quatro microgramas por mililitro, que tem a mesma leitura de suscetibilidade que o CIM de oito microgramas por mililitro pelo método convencional de diluição de caldo para Escherichia coli pura em meio MHB normal. A aplicabilidade da AST rápida de Pseudomonas aeruginosa cravada no sangue humano foi investigada por meio de imagens SRS. A intensidade da DC da imagem SRS a 2.168 por centímetro foi dominada por sinais bacterianos provenientes da incorporação metabólica de deutério de bactérias vivas.

A SC-MIC para Pseudomonas aeruginosa no sangue foi determinada como sendo de dois microgramas por mililitro, o que concordou bem com o resultado padrão convencional da CIM para Pseudomonas aeruginosa no meio de crescimento normal. O número de células bacterianas usadas para testes de suscetibilidade antimicrobiana é mantido em cerca de cinco vezes 10 para a quinta unidade formadora de colônias por mililitro, conforme recomendado pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais. Maior concentração de bactérias pode levar a um aumento na concentração inibitória mínima.

A combinação da identificação in situ de patógenos e do diagnóstico rápido de testes de suscetibilidade antimicrobiana pode ser de grande potencial para a tradução em uma clínica que permita a identificação pontual de agentes antimicrobianos apropriados para um tratamento preciso.