Um modelo cirúrgico modificado de isquemia de membros traseiros em ApoE-/- Ratos usando uma incisão em miniatura
13 de maio de 2021
Este artigo demonstra uma abordagem cirúrgica eficiente para estabelecer isquemia aguda em camundongos com uma pequena incisão. Essa abordagem pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.
O que introduzimos hoje é um método simplificado modificado e cirurgicamente eficiente, para estabelecer isquemia de membros traseiros em camundongos ApoE. Este método pode ser implementado em qualquer instalação animal. A principal vantagem do método sinovial é uma baixa invasividade, utilizando uma incisão de menos de cinco milímetros.
O método tem um aprendizado. Por isso, aconselhamos a prática em modelos microcirúrgicos antes de trabalhar nos animais, que serão incluídos na análise final. O método será demonstrado por Kaixuan Yan, um médico de medicina e o aluno do meu laboratório.
Comece preparando os equipamentos e ferramentas necessários para a cirurgia. Depois de administrar a anestesia ao camundongo, aplique essa pomada nos olhos para evitar o ressecamento. Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do núcleo a aproximadamente 37 graus Celsius.
Usando um cotonete e creme de depilação, remova cuidadosamente o cabelo da pele do membro traseiro do lado direito. Coloque o mouse na posição supina na almofada de aquecimento sob um microscópio dissecando. Use álcool para desinfetar a pele e limpar com o algodão longe do lado vegetal da incisão.
O uso de fórceps pontiagudas e tesouras cirúrgicas fazem uma incisão de aproximadamente três a quatro milímetros no meio da região inguinal. Remova cuidadosamente o tecido adiposo subcutâneo com a ajuda de fórceps pontiagudas finos para expor o feixe neurovascular femoral proximal. Usando um cotonete umedecido com soro fisiológico, mova cuidadosamente a artéria femoral para longe do nervo femoral e da veia femoral.
Em seguida, usando a ponta de uma sutura 7.0, fure cuidadosamente a membrana da baia femoral. Em seguida, passe para suturas absorvíveis de 7-0 através da artéria femoral proximal e faça nós duplos usando a tesoura de molas. Depois transecte a artéria femoral entre os dois laços.
Passe a sutura absorvível 6-0 através da borda inferior da incisão e arraste suavemente a incisão para a região do lado direito do joelho do membro traseiro para expor a artéria femoral distal. Mova cuidadosamente o tecido subcutâneo para expor o feixe neurovascular. Disseque a artéria femoral da veia femoral e do nervo femoral, e use algodão para proteger o nervo.
Em seguida, usando a ponta de uma sutura 7.0, fure a membrana da baia femoral. Passe duas suturas absorvíveis 7-0 através da artéria femoral distal e faça nós duplos usando a tesoura de mola para transstoar a artéria femoral entre dois laços. Depois, costure a incisão usando as suturas absorvíveis 6-0.
Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa e continue monitorando seus parâmetros vitais até a recuperação. Determine o sucesso da dupla ligadura da artéria femoral ou DLFA no dia seguinte via ressonância magnética. Antes do procedimento de DLFA, os pesos dos camundongos variavam de 29,6 a 38,0 gramas.
Sete dias após a cirurgia de DLFA, os pesos variaram de 26,5 a 34,1 gramas, significativamente inferiores aos pesos pré-DLFA. As regiões proximais e distais da FA direita não apresentaram perfusão. Os resultados da escala tarlov foram significativamente diminuídos um dia após a cirurgia.
Embora tenham aumentado lentamente nos dias seguintes, eles ainda estavam abaixo da linha de base até o sétimo dia. As patas dos membros traseiros isquêmicos em sete camundongos não foram capazes de esticar naturalmente em comparação com o lado contralateral. Além disso, quatro dos camundongos apresentaram leve descoloração das patas em comparação com o lado contralateral.
A coloração de H&E do músculo GM direito revelou miofibers que exibiam necrose isquêmica irregular, onde células satélites proliferantes haviam substituído os miofibers necrosados e foram distribuídos em massa ou com dispersão regular. Myofibers exibindo infiltração inflamatória por macrófagos multinucleados perderam suas características morfológicas normais, com muito poucos miofibers regenerados presentes. Seções transversais desses myofibers regenerados eram redondas.
O citoplasma estava manchado de vermelho e um pequeno núcleo ou múltiplos núcleos estavam localizados no centro. No entanto, esse tipo de padrão inflamatório não foi observado no GM esquerdo. A coloração de anticorpos CD31 realizada para observar a densidade microvascular indicou que os membros traseiros isquêmicos apresentaram significativamente mais densidade microvascular do que o lado não isquêmico. O mais importante é a dissecção da artéria femoral.
O operador precisa ser experimentado em técnicas microcirúrgicas, bem como estar familiarizado com a anatomia do javal do rato. Em princípio, este método também poderia ser usado para estudar lesão isquemia-reperfusão na perna. Por meio deste, a artéria pode ser ocluída com um grampo de vaso macio antes de permitir a reperfusão.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma técnica cirúrgica simplificada e eficiente para induzir isquemia aguda de membro posterior em camundongos ApoE utilizando uma incisão minimamente invasiva. O método foi desenvolvido para ser acessível à maioria dos grupos de pesquisa, sem necessidade de melhorias especializadas no laboratório.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Cirurgia vascular
- Modelagem de isquemia
- Modelos de camundongos em pesquisa biomédica
Antecedentes
- A isquemia aguda é uma condição crítica para o estudo de problemas vasculares.
- Os métodos anteriores frequentemente envolviam incisões maiores e maior invasividade.
- Essa técnica minimiza o trauma e facilita a recuperação.
Métodos Utilizados
- Dissecação cirúrgica da artéria femoral
- Camundongos ApoE como modelo biológico
- Uso de suturas absorvíveis para ligadura
Resultados Principais
- O modelo apresenta perda significativa de peso após a cirurgia e função alterada dos membros.
- A análise histológica revelou necrose isquêmica e estrutura muscular alterada.
- A densidade microvascular aumentou nos membros isquêmicos, indicando uma resposta à condição induzida.
Conclusões
- Este método induz efetivamente isquemia de membro posterior, fornecendo uma plataforma para investigações adicionais sobre lesão por isquemia-reperfusão.
- A técnica é relevante para pesquisadores que estudam patologias vasculares e musculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo cirúrgico modificado permite a indução eficiente de isquemia de membro posterior em camundongos ApoE-/- por meio de uma incisão minimamente invasiva, reduzindo o trauma cirúrgico e facilitando a avaliação da recuperação funcional. A abordagem sustenta a avaliação pré-clínica de patologia vascular e mecanismos de isquemia-reperfusão em um modelo aterosclerótico relevante para a doença. Oferece uma plataforma escalável e reprodutível para validação de alvos e desvio mecanicista em programas de descoberta de fármacos cardiovasculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em modelos de isquemia aterosclerótica utilizando camundongos ApoE-/-.
- Valor Operacional: Apoia a desconsideração biológica por meio da indução padronizada de oclusão da artéria femoral com mínima invasividade.
- Valor Preditivo: Facilita a avaliação do engajamento do alvo e da modulação da via em modelos de isquemia de membro inferior.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera resultados funcionais quantificáveis por meio da pontuação na escala de Tarlov e oclusão arterial confirmada por ressonância magnética.
- Reprodutibilidade: Tamanho consistente da incisão (<5 mm) e ligadura bem-sucedida em todos os animais apoiam a padronização do ensaio.
- Utilidade para triagem: Permite avaliação confiável de compostos em modelos de isquemia de membro inferior com desfechos histológicos e funcionais mensuráveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela isquemia em camundongos ApoE-/-, um sistema clinicamente relevante para doenças vasculares ateroscleróticas.
- Continuidade Translacional: Permite a progressão da descoberta à validação pré-clínica por meio de métricas de recuperação histológica e funcional.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a avaliação da resposta inflamatória e do remodelamento microvascular como biomarcadores de lesão isquêmica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até os testes de eficácia pré-clínica em modelos de doenças vasculares.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias nos mecanismos de lesão por isquemia-reperfusão.
- Triagem: Fornece modelos isquêmicos prontos para ensaios com saídas funcionais e de imagem quantitativas.
- Análises: Permite a comparação de condições por meio da escala de Tarlov, perfusão por RNM, perda de peso e escores histológicos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da relevância do modelo ApoE-/- e de desfechos alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade cirúrgica reutilizável para estudos de patologias vasculares em diversas equipes de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio de compreensão mecanicista da necrose isquêmica e da infiltração inflamatória.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade possibilitadas por incisão miniaturizada e etapas procedimentais consistentes.
- Valor Estratégico: Decisões de avanço ou interrupção aprimoradas mediante redução da variabilidade biológica e maior fidelidade do modelo em contextos ateroscleróticos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco por meio de desfechos funcionais e histológicos objetivos que sustentam critérios de avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas microcirúrgicas e na anatomia do membro posterior de camundongo.
- Necessita de instrumentos microcirúrgicos, mantas aquecidas, equipamentos de anestesia e microscópios de dissecação.
- Exige padronização entre as equipes quanto ao tamanho da incisão, técnica de ligadura e protocolos de monitoramento pós-operatório.
- As considerações para adaptação incluem a anatomia vascular específica do modelo e a variabilidade fenotípica em ApoE-/-.
- As limitações práticas incluem a dependência da habilidade do operador e a necessidade de validação funcional e por imagem no pós-operatório.
