Name: Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a preparar montagens planas de retina em camundongos C57-Black/6 com imunofluorescência para visualizar mudanças vasculares dinâmicas em modelo de retinopatia induzida por oxigênio.

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Agradecemos a todos os membros do nosso laboratório e laboratório de animais oftalmológicos do Centro Oftalmológico Zhongshan por sua assistência técnica. Agradecemos também ao Prof. Chunqiao Liu pelo apoio experimental. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC: 81670872; Pequim, China), a Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (Grant No.2019A1515011347), e projeto de construção hospitalar de alto nível do Laboratório Estadual de Oftalmologia do Centro Oftalmológico Zhongshan (Grant No. 303020103; Guangzhou, Província de Guangdong, China).

Todos os procedimentos envolvendo o uso de camundongos foram aprovados pelo comitê de ética experimental animal do Centro Oftalmológico de Zhongshan, Sun Yat-sen University, China (número autorizado: 2020-082), e de acordo com as diretrizes aprovadas do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro Oftalmológico de Zhongshan e da Declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visão.
1. Indução do modelo OIR do mouse
<ol><li>Use camundongos com uma taxa mais baixa de malformação congênita dos olhos, por exemplo, camundongos C57BL/6J, e acasale-os em uma proporção de macho/fêmea = 1:2. Obter os filhotes nascidos no mesmo dia e começar a induzir o modelo OIR em P7. Grave o peso corporal dos filhotes de rato estritamente antes de modelar. NOTA: Note o dia do nascimento como P0. Regissuor regularmente de cada rato. O peso corporal dos filhotes recém-nascidos é muito importante durante a indução do OIR, pois a sensibilidade dos camundongos em diferentes estados ao oxigênio é diferente. Exclua os filhotes mais de 5 g em P7 para garantir resultados comparáveis.</li>
	<li>Proporcionar um ambiente de vida adequado para as mães de enfermagem e seus filhotes, como fixar a temperatura em 23 °C ± 2 °C, controlar a umidade em 40%-65%, alternar 12h de luz e 12h de escuridão todos os dias, adicionar um pouco de lã de algodão à gaiola para aninhar, garantir alimentos e água esterilizados adequados, e mantê-los em gaiolas individualmente ventiladas (IVC).</li>
	<li>Monitore o nível de umidade e temperatura dentro da câmara. Controle a umidade entre 40% e 65% e mantenha a temperatura em 23 °C ± 2 °C.</li>
	<li>Verifique o suprimento de oxigênio com sensores de oxigênio, mantenha um nível constante de oxigênio em 75% e controle a taxa de fluxo de oxigênio em 0,5-0,75 L/min. Coloque 50 g de limão de soda na parte inferior da câmara para absorver co2 excessivo e manter os valores de CO2 abaixo de 3%22.</li>
	<li>Monitore os comportamentos das mães de enfermagem, como o comportamento de construção de ninhos, mordendo seus filhotes e recusando lactação pelo menos uma vez por dia. Elimine mães amamentando com maternidade pobre.</li>
	<li>Coloquem os filhotes P7 (macho e fêmea) e suas mães de enfermagem em uma câmara de oxigênio na qual o nível de oxigênio é de 75% por 5 dias a P12. Evite a abertura desnecessária da câmara durante o período de indução do modelo. Certifique-se de que há mães substitutas extras para substituição, caso as mães de enfermagem morram devido a lesões pulmonares enquanto estão em hiperoxia. NOTA: Para garantir a comparabilidade do experimento, restrinja o número a 6-8 filhotes para cada mãe. Preste atenção ao potencial problema da toxicidade do oxigênio, que causa a morte de algumas mães amamentando. Os sinais de lesão pulmonar hiperóxica nas mães de enfermagem incluem, mas não se limitam a, taxa respiratória flutuante, diminuição da atividade e diminuição da alimentação. Quando ocorre o fenômeno acima, eutanize a mãe amamentando com 1% de sódio pentobarbital (50 mg/kg) o mais rápido possível. Prepare algumas mães substitutas, por exemplo, 129S1/SvImJ para substituição e use-as somente se necessário. Não é recomendável substituir as mães amamentando como rotina, pois isso levará à abertura frequente de uma câmara de oxigênio, resultando em níveis instáveis de oxigênio e agressão materna.</li>
	<li>Leve os filhotes e suas mães de enfermagem de volta ao ar da sala em P12 e monitore o peso de todos os filhotes continuamente até P17. Agrupar os filhotes com base no peso para garantir que cada grupo experimental tenha uma distribuição de peso semelhante.</li>
</ol>2. Preparação de montagens inteiras de retina e coloração de imunofluorescência
<ol><li>Regissão corporal dos filhotes. Sacrifique os filhotes por uma overdose de anestésico (1% de sódio pentobarbital 50 mg/kg) ou inalação de CO2 . Outros métodos de eutanásia, como luxação cervical e toracotomia bilateral, podem ser utilizados se necessário.</li>
	<li>Use uma tesoura curva para liberar a conexão entre os globos oculares e o tecido orbital. Em seguida, coloque fórceps curvos na parte posterior do globo ocular, aperte o nervo óptico, e rapidamente levante o olho para fora da órbita. Lave os globos oculares em um soro fisiológico tampão de fosfato 1x pré-resfriado (PBS) para remover o cabelo e o sangue da superfície dos globos oculares.</li>
	<li>Coloque os globos oculares limpos em um tubo de microcentrifus de 2 mL preenchido com 4% de paraformaldeído (PFA) e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente em um shaker a uma velocidade de 12-15 rotações por minuto (rpm) (fixação inicial). ATENÇÃO: O paraformaldeído é conhecido por ser alergênico, geralmente tóxico e extremamente citotóxico. Siga as instruções de segurança estritamente e evite a inalação e o contato com a pele.</li>
	<li>Use um prato de cultura e coloque uma gota de 1x PBS na parte central e realize os seguintes passos sob um microscópio dissecando e coloque um globo ocular nesta gota. Segure o globo ocular com um par de fórceps e puna cuidadosamente a córnea no limbus da córnea usando uma agulha de seringa de 1 mL. Insira a ponta da tesoura neste orifício e corte cuidadosamente a córnea ao longo do limbus da córnea. Cuidado para não cortar a retina.</li>
	<li>Remova a íris e a lente com um par de fórceps. Em seguida, coloque a ocular restante no PFA de 4% e fixe novamente por mais 45 minutos em temperatura ambiente em um agitador a uma velocidade de 12-15 rpm (fixação secundária).</li>
	<li>Use um prato de cultura e coloque uma gota de 1x PBS na parte central. Coloque o globo ocular fixo nesta gota. Segure o globo ocular com um par de fórceps. Separe suavemente as camadas de retina e esclera usando duas fórceps. Coloque a ponta da tesoura entre as camadas de retina e esclera e corte a esclera em direção ao nervo óptico. Retire a esclera da retina e obtenha o copo de retina. NOTA: Segure o copo posterior pelo nervo óptico com fórceps, em seguida, use a extremidade curva de outro fórceps para pressionar para baixo sobre a esclera na cabeça do nervo óptico e massageie suavemente a retina em um movimento de varredura para a frente como uma alternativa para liberar a retina.</li>
	<li>Use fórceps para liberar a conexão entre os vasos hialoides radiais e a retina periférica, fixar a raiz dos vasos hialoides que está perto da cabeça do nervo óptico, e cortar os vasos hialoides cuidadosamente.</li>
	<li>Use uma pipeta de 2 mL com a ponta cortada para transferir o copo de retina. Coloque a xícara de retina em um poço em uma placa de 48 poços e lave-a por 3 x 5 min com 1x PBS em temperatura ambiente em um shaker a uma velocidade de 12-15 rpm.</li>
	<li>Incubar o copo de retina em uma solução mista de 1% Triton X-100 (em PBS) e 5% de soro de burro normal (em PBS) durante a noite a 4 °C.<ol><li>Alternativamente, bloqueie e permeabilize retinas à temperatura ambiente por 1h como alternativa. Alterar o soro de bloqueio de acordo com a fonte do anticorpo secundário.</li>
	</ol></li>
	<li>Se rotular a vasculatura de retina usando Isolectina B4, incubar a retina em um poço de placa de 48 poços com soro de burro 0,1% normal (400 μL) e IsolectinaB4-594 (1:400) durante a noite a 4 °C em um shaker a uma velocidade de 12-15 rpm. NOTA: Se rotular os vasos sanguíneos com outros marcadores, como CD31, ou rotular outras células, use anticorpos primários específicos para rotulá-los.</li>
	<li>Incubar a retina com 1:100-1:500 anticorpos primários específicos (em 400 μL 0,1% soro normal de burro) a 4 °C em um shaker a uma velocidade de 12-15 rpm por 48 h. (opcional)</li>
	<li>Depois de voltar à temperatura ambiente, lave a retina com 0,1% de PBST (0,1% TritonX-100 na PBS) por 3 x 20 min em um shaker a uma velocidade de 12-15 rpm.</li>
	<li>Incubar a retina com anticorpos secundários de 1:100 (em 400 μL 0,1% soro normal de burro) durante a noite a 4 °C em um agitador a uma velocidade de 12-15 rpm. (opcional)<ol><li>Alternativamente, incubar a retina com anticorpos secundários de alta afinidade à temperatura ambiente por 1h.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar a retina com DAPI (1:1.000) em temperatura ambiente por 20-25 min para rotular o núcleo. NOTA: Teste as razões de diluição ideais para todos os anticorpos utilizados nas etapas 10-11 e 13-14 no pré-experimento.</li>
	<li>Lave a retina por 3 x 30 min com 0,1% de PBST em um shaker a uma velocidade de 12-15 rpm em temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira o copo de retina para um slide limpo com a abertura voltada para cima. Corte a retina radialmente nas posições 3, 6, 9 e 12 horas de periférica para central, cortando aproximadamente 1-1,5 mm de distância da cabeça do nervo óptico.</li>
	<li>Adicione algumas gotas de 1x PBS para enxaguar a retina três vezes. Use papel colocado no ar para secar e achatar a retina. Adicione uma gota de meio de montagem (ver Tabela de Materiais) ao centro do deslizamento de tampas e pare de adicioná-lo até que o diâmetro da gota aumente para metade do deslizamento de tampa. Vire rapidamente a tampa e coloque-a em cima da retina generalizada. Evite formar bolhas.</li>
	<li>Tire imagens das montagens planas da retina ou armazene e proteja os slides da luz a 4 °C.</li>
</ol>3. Análise e quantificação de montagens planas de retina
NOTA: Para o modelo de camundongo OIR, os pesquisadores frequentemente registram a área de oclusão vascular da retina central e neovascularização patológica da retina periférica durante P12-P25. Estudos anteriores mostraram que a área avascular central da retina atinge o máximo em P12 e gradualmente encolhe de P13 para P17; ao mesmo tempo, a retina dos camundongos OIR atinge o pico da área de neovascularização em torno de P1722,29. A partir de P17, os neovessels gradualmente regredim e os vasos funcionais recrescem na área avascular. A vasculatura da retina basicamente volta ao normal em P2533.
<ol><li>Faça imagens de montagens planas de retina por um microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais) com lente objetiva de 10x. Primeiro, escolha o canal DAPI e coloque a cabeça do nervo óptico no centro do campo visual. Em seguida, ajuste outros canais e foque na vasculatura superficial da retina. Verifique as telhas em um software de foto (ver Tabela de Materiais) e defina o número de fotos que precisam ser costuradas. Clique em Iniciar experimento para capturar toda a retina.</li>
	<li>Use um programa de processamento de imagens (ver Tabela de Materiais) para quantificar a área de vaso-obliteração (VO) e neovascularização (NV) após a coloração da imunofluorescência.<ol><li>Primeiro, clique na Ferramenta varinha mágica e defina uma tolerância apropriada de acordo com a diferença de brilho e mova o cursor para o fundo e clique no mouse. Em seguida, escolha o Select Inverse para obter um contorno básico da retina. Use a Ferramenta Laço para delinear ainda mais os detalhes da retina. Usando a função Histograma , registo o valor do pixel de toda a retina e anote ou gere uma tabela em um programa de banco de dados.</li>
		<li>Divida a imagem da retina em quatro quadrantes. Em cada quadrante, use a Ferramenta Laço para desenhar a área de VO (Figura 2A-C) e use a Ferramenta varinha mágica para selecionar a área NV (Figura 2D-F). Através das informações de pixels no histograma, calcule a razão de pixels de VO e NV para toda a retina, ou seja, a porcentagem de área de VO ou NV em relação a toda a retina. NOTA: Há também um pipeline de código aberto e totalmente automatizado para a quantificação de áreas de VO e NV em imagens OIR usando redes neurais de aprendizagem profunda (http://oirseg.org/), que fornece uma maneira confiável e de economia de tempo para os pesquisadores, bem como unifica o padrão da quantificação34.</li>
	</ol></li>
	<li>Registo informações sobre pixels em uma tabela de planilhas, o que é conveniente para análises subsequentes.</li>
</ol>4. Imagem in vivo com angiografia de fluoresceína fundus (FFA)
NOTA: Para camundongos OIR, tanto a perfusão FITC quanto a coloração de imunofluorescência só podem ser usadas por uma vez devido à morte de animais experimentais. Em comparação com isso, uma das vantagens da FFA é a observação das mudanças dinâmicas dos vasos de retina do camundongo durante o desenvolvimento e estado patológico in vivo35,36.
<ol><li>Pesar os filhotes antes da anestesia.</li>
	<li>Anesthetize filhotes por injeção intraperitoneal de 0,3% de sódio pentobarbital a uma dose de 30-50 mg/kg. NOTA: Para camundongos dentro de 1 mês, preste atenção às doses anestésicos. Use concentrações e doses mais baixas de anestésico para reduzir a morte de camundongos causados por anestesia. Depois que os filhotes forem anestesiados, use uma pequena almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. A hipotermia não afeta apenas a função fisiológica dos filhotes, mas também leva a mudanças na cristalina e acelera o desenvolvimento de cataratas.</li>
	<li>Use 20 μL colírios mydritic (0,5% de tropicamida + 0,5% cloridrato de fenilefrina) para cada filhote e espere 5 minutos para alcançar a dilatação pupilar de longa duração (Figura 3A,B).</li>
	<li>Traga os filhotes anestesiados na frente do dispositivo de imagem (ver Tabela de Materiais). Mantenha os filhotes em uma pequena almofada de aquecimento, coloque os filhotes em uma posição estável e use lágrimas artificiais regularmente para manter a umidade na córnea. Clique no modo de Imagem fundus infravermelha (IR) para ajustar a cabeça do nervo óptico para o centro da tela. NOTA: Ao observar um olho dos filhotes, não se esqueça de proteger o outro olho. Use colírios de hypromellose para evitar que a córnea claree devido ao ressecamento.</li>
	<li>Após injeção intraperitoneal de 0,15 mL 0,5% de solução de sal de sódio fluoresceína, clique no botão FA e no botão Injection imediatamente no painel de toque do dispositivo de imagem para iniciar o tempo. Registo as imagens após 3 minutos quando a circulação sanguínea da retina entra na fase venosa e observe a retina não menos que 6-8 min. NOTA: Após injeção intraperitoneal de solução de sal de sódio fluoresceína, a pele, a mucosa e a urina dos filhotes mostram verde amarelo óbvio. A maior parte do fluoresceína é excretada pelos filhotes dentro de um dia. Injetar o sódio fluoresceína intraperitonealmente a cada dois dias por seis vezes não causa efeitos colaterais significativos37.</li>
	<li>Mova a cabeça do nervo óptico para o centro da área de aquisição de imagens e tire a primeira imagem da retina central. Em seguida, mova a lente do dispositivo de imagem horizontalmente para o lado nasal do olho até que a cabeça do nervo óptico esteja localizada no ponto médio de um lado da área de aquisição de imagens e tire a segunda imagem. Continue a tirar imagens da retina temporal, superior e inferior, respectivamente utilizando este método (Figura 3C). NOTA: Leve as imagens de "cinco orientações" dentro de 12 minutos à medida que a fase de regressão ocorrer. A posição da cabeça do nervo óptico na imagem inferior é permitida a não cair na linha lateral devido ao ajuste de ângulo limitado da lente.</li>
	<li>Salve as imagens e use um programa de processamento de imagens para costurar.</li>
</ol>5. Processamento de imagem da angiografia de fundus fluoresceína (FFA)
<ol><li>Abra o programa de processamento de imagens e clique em Novo em Arquivo para criar uma nova tela com fundo preto (Figura 4A).</li>
	<li>Abra uma imagem da retina central primeiro na camada de fundo. Clique em Arquivo e adicione a segunda imagem. Ajuste a opacidade da segunda imagem para 60%, mova-se e redimensione a segunda imagem até que as mesmas partes das duas imagens se sobreponham muito. Clique no botão Alternar Entre os modos Transformar Livre e Warp e faça ajustes sutis nas embarcações, se necessário. Em seguida, volte a opacidade da segunda imagem para 100% (Figura 4A,B).</li>
	<li>Selecione duas imagens ao mesmo tempo e clique em Auto-Blend Layers. Verifique panorama como o método de mistura, bem como selecione as duas frases a seguir. Clique em OK e finalize a costura de imagem das duas primeiras imagens (Figura 4C,D).</li>
	<li>Pegue as duas primeiras imagens costuradas como um todo, adicione a terceira imagem e continue a se misturar. Repita os métodos acima para completar a costura de cinco imagens (Figura 4E).</li>
	<li>Use a Ferramenta de Cultura para cortar imagens de FFA em diferentes pontos de tempo para um tamanho uniforme e observar mudanças dinâmicas da vasculatura da retina de P15 para P25 em filhotes normais e OIR.</li>
</ol>6. Análise estatística
<ol><li>Valores atuais como média ± desvio padrão (s.d.).</li>
	<li>Use o teste t do Aluno para comparar duas amostras independentes. Use ANOVA one-way para comparar vários conjuntos de dados e combinar com o teste de Dunnett ou Tukey, que é um teste de comparação múltipla comumente usado.</li>
	<li>Para dados não normalmente distribuídos, use teste Mann-Whitney U ou teste Kruskal Wallis. Considere diferenças estatísticas significativas quando P < 0,05.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A suscetibilidade dos camundongos ao OIR é afetada por muitos fatores. Os filhotes de diferentes origens genéticas e cepas não podem ser comparados. Em camundongos albinos BALB/c, os vasos recrescem rapidamente na área de VO com tufos neovasculares reduzidos significativos38, que trazem algumas dificuldades para a pesquisa. Em camundongos C57BL/6, há aumento do dano do fotoreceptor quando comparado com a cepa de rato BALB/cJ39,40. O mesmo ...

A neovascularização da retina (RNV), que é definida como um estado onde novos vasos patológicos se originam das veias retinárias existentes, geralmente se estende ao longo da superfície interna da retina e cresce no espaço vítreo (ou subretral sob algumas condições)1. É uma característica marcante e comum de muitas retinopatias isquêmicas, incluindo retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão da veia da retina (RVO) e retinopatia diabética proliferativa (PDR)2.
Inúmeras observações clínicas e experimentais indicaram que a isquemia é a principal causa da neovascularizaçãoda retina 3,4. No ROP, os recém-nascidos são expostos ao oxigênio de alto nível em incubadoras fechadas para aumentar as taxas de sobrevivência, o que também é um importante motor para a prisão do crescimento vascular. Após o tratamento, as retinas dos recém-nascidos experimentam um período relativamente hipóxico5. Outras situações são observadas na oclusão das veias de retina central ou ramificada no RVO e também é observado dano de capilares de retina que é causado por microangiopatia na PDR2. A hipóxia aumenta ainda mais a expressão de fatores angiogênicos, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) através do fator induzido por hipóxia-1α (HIF-1α) caminho de sinalização que, por sua vez, guia as células endoteliais vasculares para crescer na área hipóxica e formar novos vasos 6,7.
O ROP é uma espécie de retinopatia proliferativa vascular em bebês prematuros e uma das principais causas de cegueira infantil 8,9, caracterizada por hipóxia retiniana, neovascularização da retina e hiperplasia fibrosa 10,11,12. Na década de 1950, pesquisadores descobriram que a alta concentração de oxigênio pode melhorar significativamente os sintomas respiratórios de bebês prematuros13,14. Como resultado, a oxigenoterapia foi cada vez mais utilizada em bebês prematuros na época15. No entanto, concomitantemente com o uso generalizado de oxigenoterapia em bebês prematuros, a incidência de ROP aumentou ano a ano. Desde então, pesquisadores associaram oxigênio ao ROP, explorando vários modelos animais para entender a patogênese do ROP e RNV16.
No ser humano, a maioria do desenvolvimento da vasculatura da retina é concluída antes do nascimento, enquanto nos roedores a vasculatura da retina se desenvolve após o nascimento, fornecendo um sistema modelo acessível para estudar angiogênese na vasculatura da retina2. Com o progresso contínuo da pesquisa, os modelos de retinopatia induzida por oxigênio (OIR) tornaram-se grandes modelos para imitar a angiogênese patológica resultante da isquemia. Não há espécies animais específicas no estudo do modelo OIR e o modelo foi desenvolvido em várias espécies animais, incluindo gatinho17, rato18, rato19, filhote de beagle20 e zebrafish21. Todos os modelos compartilham o mesmo mecanismo pelo qual são expostos à hiperoxia durante o desenvolvimento precoce da retina e depois retornados ao ambiente normóxico. Smith et al. observaram que expor filhotes de camundongos à hiperoxia de P7 por 5 dias induziu uma forma extrema de regressão do vaso na retina central e trazê-los de volta ao ar da sala em P12 gradualmente desencadeou tufos neovasculares, que cresceram em direção ao corpo vítreo19. Este foi um modelo de mouse OIR padronizado também chamado de modelo Smith. Connor et al. otimizaram ainda mais o protocolo e forneceram um método universalmente aplicável para quantificar a área de VO (vaso-obliteração) e NV (neovascularização) em 2009, o que aumentou a aceitação e utilização do modelo22. O modelo de mouse OIR ainda é o modelo mais utilizado agora por causa de seu pequeno tamanho, reprodução rápida, fundo genético claro, boa repetibilidade e alta taxa de sucesso.
Em camundongos, a vascularização da retina começa após o nascimento com o crescimento dos vasos da cabeça do nervo óptico para a retina interna em direção à ora serrata. Durante o desenvolvimento normal da retina, os primeiros vasos da retina brotam da cabeça do nervo óptico ao redor do nascimento, formando uma rede em expansão (o plexo primário) que atinge a periferia em torno do dia pós-natal 7(P7)23. Em seguida, os vasos começam a crescer na retina para formar uma camada profunda, penetrar na retina, e estabelecer uma rede laminar em torno da camada nuclear interna (INL) como no humano24. Ao final da terceira semana pós-natal (P21), o desenvolvimento mais profundo do plexo está quase concluído. Para o modelo de camundongo OIR, a oclusão vascular sempre aparece na retina central devido à rápida degeneração de um grande número de redes vasculares imaturas na região central durante a exposição à hiperoxia. Assim, o crescimento da neovascularização patológica também ocorre na retina periférica média, que é o limite da área de não perfusão e da área vascular. No entanto, os vasos de retina humana quase se formaram antes do nascimento. Quanto aos prematuros, a retina periférica não é completamente vascularizada quando exposta à hiperoxia 25,26. Assim, a oclusão vascular e a neovascularização aparecem principalmente na retina periférica27,28. Apesar dessas diferenças, o modelo OIR do camundongo recapitula de perto os eventos patológicos que ocorrem durante a neovascularização induzida pela isquemia.
A indução do modelo OIR pode ser dividida em duas fases29: na fase 1 (fase da hiperoxia), o desenvolvimento vascular da retina é preso ou retardado com oclusão e regressão dos vasos sanguíneos como resultado do declínio do VEGF e da apoptose das células endoteliais 24,30; na fase 2 (fase da hipóxia), o suprimento de oxigênio da retina se tornará insuficiente sob as condições de ar29, essencial para o desenvolvimento neural e homeostase19,31. Esta situação isquêmica geralmente resulta em neovascularização anormal não regulamentada.
Atualmente, o método de modelagem comumente utilizado é alternar alta/baixa exposição ao oxigênio: Mães e seus filhotes são expostos a 75% de oxigênio por 5 dias em P7 seguido por 5 dias no ar do quarto até p17 demonstrar resultadoscomparáveis 22, que é o ponto final da indução do modelo de camundongo OIR. (Figura 1). Além de simular ROP, essa neovascularização patológica mediada por isquemia também pode ser usada para estudar outras doenças isquêmicas da retina. As principais medidas deste modelo incluem quantificar a área de VO e NV, que são analisadas a partir de montagens planas de retina por coloração de imunofluorescência ou perfusão FITC-dextran. Cada rato só pode ser estudado uma vez por causa da operação letal. Atualmente, existem poucos métodos para observar mudanças dinâmicas da vasculatura da retina continuamente durante o processo de regressão vascular e angiogênese patológica32. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado da indução do modelo OIR, análise de montagens planas de retina, bem como um fluxo de trabalho de angiografia de fluoresceína fundus (FFA) em camundongos que seria útil para obter uma compreensão mais abrangente das mudanças dinâmicas vasculares durante duas fases do modelo de mouse OIR.

<table><tbody><tr><td>Seringa estéril de 1 mL</td><td>Solarbio</td><td>YA0550</td><td>Para preparação de montagens planas de retina e injeção intraperitoneal</td></tr><tr><td>1&times; Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>&nbsp; FG701-01</td><td>Para preparação de montagens planas de</td></tr><tr><td>retina Tubo de microcentrífuga de 2 ml</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td>Para preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>48 Placas de poços múltiplos tratadas com TC transparente de poço Corning</td><td></td><td>3548</td><td>Para preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio adesivas</td><td>Vários</td><td></td><td>Para preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CC 2019</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Para análise de imagem</td></tr><tr><td>Gás dióxido de carbono</td><td>Vários</td><td></td><td>Para sacrifício</td></tr><tr><td>Lâmina de cobertura</td><td>Vários</td><td></td><td>Para preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Fórceps curvas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td>Para preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Solução de coloração DAPI</td><td>Abcam ab228549</td><td></td><td>Para rotular o núcleo em montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td>Para preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Fluoresceína sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Para imagens in vivo</td></tr><tr><td>Microscópio Fluorescente</td><td>&nbsp; Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td>Para aquisição de imagens de fluorescência de suportes planos de retina</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Mídia de montagem</td><td>SouthernBiotech</td><td>&nbsp; 0100-01</td><td>Para a preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Hidroxipropilmetilcelulose</td><td>Maya</td><td>89161</td><td>Para imagens in vivo</td></tr><tr><td>Isolectina B4 594 anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Para rotular a vasculatura retiniana em montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Camundongos C57/BL6J</td><td>GemPharmatech da província</td><td></td> de Jiangsu <td>Para indução do modelo OIR</td></tr><tr><td>Micro dissecação lâmina reta de tesoura</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td>Para preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Pinça reta nº 4 World</td><td>Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501978-6</td><td>Para a preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td>Para preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Sensor O2</td><td>Vários</td><td></td><td>Para monitorar o nível de O2</td></tr><tr><td>OxyCycler</td><td>Biospherix</td><td>A84XOV</td><td>Para indução de modelo OIR</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Para fixação tecidual</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Vários</td><td></td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Cal sodótica</td><td>Vários</td><td></td><td>Para absorver o excesso de CO2 na câmara de oxigénio</td></tr><tr><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td>Heidelberg</td><td>HC00500002</td><td>Para in vivo imagiologia</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22.0</td><td>IBM</td><td></td><td>Para análise estatística</td></tr><tr><td>Agitador de declor Tansference</td><td>Kylin-Bell</td><td>ZD-2008</td><td>Para preparação de montagens planas de retina Placa de cultura de</td></tr><tr><td>tecidos (Fixação baixa)</td><td>Corning</td><td>3261-20EA</td><td>Para preparação de montagens planas de retina Pipetas</td></tr><tr><td>de transferência</td><td>Vários</td><td></td><td>Para preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; SLBW6818</td><td>Para a preparação de montagens planas de retina</td></tr><tr><td>Tropicamida</td><td>Vários</td><td></td><td>Para imagens in vivo</td></tr><tr><td>ZEN Imaging Software</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Para aquisição e exportação de imagens</td></tr></tbody></table>

monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

A retinopatia induzida por oxigênio (OIR) é amplamente utilizada para estudar o crescimento anormal de vasos em doenças isquêmicas da retina, incluindo retinopatia da prematuridade (ROP), retinopatia diabética proliferativa (RDR) e oclusão da veia retinista (RVO). A maioria dos estudos de OIR observa a neovascularização da retina em pontos de tempo específicos; no entanto, o crescimento dinâmico de embarcações em camundongos vivos ao longo de um curso de tempo, essencial para a compreensão das doenças de vasos relacionadas ao OIR, tem sido subestudado. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para a indução do modelo de mouse OIR, destacando as potenciais armadilhas, e fornecendo um método aprimorado para quantificar rapidamente áreas de vaso-obliteração (VO) e neovascularização (NV) usando coloração de imunofluorescência. Mais importante, monitoramos o recrescimento de embarcações em camundongos vivos de P15 a P25 realizando angiografia de fundus fluoresceína (FFA) no modelo de mouse OIR. A aplicação da FFA ao modelo de mouse OIR nos permite observar o processo de remodelação durante o recrescimento da embarcação.

No modelo de mouse OIR, o resultado mais importante e básico é a quantificação da área de VO e NV. Depois de viver no ambiente de hiperoxia por 5 dias a partir de P7, a retina central dos filhotes apresentou a maior área de não perfusão. Sob a estimulação da hipóxia em mais 5 dias, a neovascularização da retina foi gradualmente produzida, que fluoresced mais intensamente do que vasos normais circundantes. Após P17, o sinal de fluorescência da neovascularização patológica regrediu rapidamente como a remodelagem da retina ...

Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação e a coloração da imunofluorescência de montagem e análise plana de retina de camundongos. O uso de fluoresceína fundus angiography (FFA) para filhotes de camundongos e processamento de imagem também são descritos em detalhes.

Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

Este protocolo pode ajudar os pesquisadores a separar facilmente as retinas dos camundongos e observar as mudanças dinâmicas na vasculatura da retina do modelo de rato OIR. As principais vantagens deste método são a preservação da integridade das retinas separadas e permitir que cada rato sirva como seu próprio controle, o que torna os resultados mais comparáveis. Pesquisadores que tentam esse método pela primeira vez podem ter dificuldade ao tirar as cinco imagens de orientação porque é um pouco difícil colocar filhotes na posição correta.Para coletar o tecido para montagem inteira da retina, use uma tesoura curva para desconectar os globos oculares do tecido orbital de um filhote de C57-Black/6 eutanizado. Em seguida, insira fórceps curvos na parte posterior do globo ocular, apertando o nervo óptico e rapidamente levantando o olho para fora da órbita. Coloque os globos oculares em PBS pré-resfriado para remover qualquer cabelo e sangue da superfície.Quando todos os globos oculares tiverem sido coletados, transfira os globos oculares limpos para um tubo de microcentrífugo de dois mililitros contendo 4% de paraformaldeído, e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente e 12 a 15 revoluções por minuto. No final da incubação, adicione uma gota de PBS ao centro de um prato de cultura sob um microscópio dissecando, e coloque um globo ocular na queda. Segurando o globo ocular com um par de fórceps, use uma agulha de seringa de um mililitro para perfurar cuidadosamente a córnea no limbus da córnea.Insira a ponta de uma tesoura na punção e corte a córnea ao longo do limbus da córnea, tomando cuidado para não cortar a retina. Use fórceps para remover a íris e a lente, e coloque a xícara ocular restante em 4% de paraformaldeído para uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente no agitador. No final da incubação, coloque a ocular fixa em uma nova gota de PBS no centro de um novo prato de cultura.Segurando a xícara ocular com um par de fórceps, use um segundo par de fórceps para separar suavemente as camadas de retina e esclera. Coloque a ponta da tesoura entre as camadas de retina e esclera e corte a esclera em direção ao nervo óptico. Retire a esclera da retina para obter o copo de retina.Usando fórceps, solte a conexão entre os vasos hialoides radiais e a retina periférica. Use uma pipeta de dois mililitros com a ponta cortada para transferir o copo de retina em um poço de uma placa de 48 poços para três lavagens de cinco minutos em temperatura ambiente PBS no shaker. Após a última lavagem, incubar o copo em 1%Triton X-100 e 5% soro de burro normal na PBS durante a noite a quatro graus Celsius.Para rotular a vasculatura de retina com isolectina B4, incubar a retina em um poço de uma placa de 48 poços em 400 microliters 0,1% soro de burro normal complementado com isolectina B4-594 durante a noite a 4 graus Celsius em um shaker. Se necessário, outro anticorpo primário pode ser adicionado ao mesmo tempo. No dia seguinte, lave a retina com três lavagens de 20 minutos em 0,1%PBST no shaker.Após a última lavagem, incubar a retina com um anticorpo secundário de alta afinidade apropriado por uma hora à temperatura ambiente antes de rotular a amostra com DAPI por 20 a 25 minutos. No final da incubação, lave a retina com três lavagens de 30 minutos em 0,1%PBST em temperatura ambiente com agitação. Após a última lavagem, transfira o copo de retina para um slide limpo com a abertura voltada para cima, e use o microscópio para cortar a retina radialmente nas posições de três, seis, nove e 12 horas da periferia em direção ao centro, até um a 1,5 milímetros da cabeça do nervo óptico.Enxágüe a retina três vezes com algumas gotas de PBS por lavagem antes de usar papel colocado a ar para secar e achatar a retina. Adicione uma gota de meio de montagem ao centro da mancha de cobertura até que o diâmetro da gota cubra metade do deslizamento de cobertura. Em seguida, coloque rapidamente o deslizamento de cobertura montando lado médio para baixo na retina outspread.Uma vez que todas as montagens planas da retina tenham sido preparadas, as amostras podem ser imagens por microscopia de fluorescência confocal. Para imagens in vivo, adicione 20 microliters de colírios micráticos para alcançar a dilatação da pupila de longa duração. Após cinco minutos, coloque os filhotes em posição estável em uma pequena almofada de aquecimento na frente do dispositivo de imagem.Para manter a umidade nas córneas, adicione regularmente lágrimas artificiais durante todo o procedimento de imagem. Em seguida, clique em Infrared Fundus Imaging no dispositivo para ajustar a cabeça do nervo óptico para o centro da tela. Injete intraperitoneally 150 microliters de solução de sal de sódio fluoresceína de 0,5%, e clique imediatamente nos botões FA e Injection no painel de toque do dispositivo de imagem para iniciar o temporizador.Após três minutos, quando a circulação sanguínea da retina entrou na fase venosa, adquire a primeira imagem da retina central. Mova a lente do dispositivo de imagem horizontalmente para o lado nasal do olho até que a cabeça do nervo óptico esteja localizada no ponto médio de um lado da área de aquisição de imagens, e tire a segunda imagem. Continue movendo a lente e adquirindo imagens da retina temporal, superior e inferior da mesma forma.Para processar as imagens da retina em um programa de processamento de imagens apropriado, abra o menu Arquivo e clique em Novo para criar uma nova tela com fundo preto. Abra a imagem da retina central. Em seguida, clique em Arquivar para adicionar uma segunda imagem.Ajuste a opacidade da segunda imagem para 60% e mova-se e redimensione a imagem até que as duas imagens se sobreponham. Clique em Alternar entre modos de transformação livre e dobra e faça ajustes sutis nas embarcações, se necessário. Em seguida, defina a opacidade da segunda imagem de volta para 100% Selecione ambas as imagens e clique em Auto-Blend Layers.Verifique o Panorama como o método de mistura e também verifique as caixas para obter tons e cores e cores e áreas transparentes de preenchimento conscientes de conteúdo. Clique em OK para completar a costura das duas primeiras imagens. Em seguida, adicione a terceira imagem, e costure esta imagem para as duas primeiras imagens como demonstrado até que todas as cinco imagens de uma única retina tenham sido costuradas.Quando todas as imagens da análise tiverem sido processadas, use a Ferramenta crop para cortar as imagens ffa em um tamanho uniforme para facilitar a observação das mudanças na dinâmica da vasculatura da retina em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento. Após cinco dias de exposição à hiperoxia, as retinas centrais do pós-natal 12 filhotes demonstram uma grande área de não perfusão. Ao transferir para cinco dias de condições hipóxiis, as retinas gradualmente se neovascularizam, apresentando um aumento no sinal de fluorescência mais forte do que o observado nos vasos normais circundantes.Após o pós-natal 17, a neovascularização patológica regrede rapidamente e a retina demonstra uma aparência completamente normal até o pós-natal 25. Uma boa repetibilidade e estabilidade do modelo de retinopatia induzido pelo oxigênio podem ser alcançados controlando o tamanho da ninhada e o ganho de peso pós-natal dos filhotes. Como observado, a vaso-obliteração normalmente atinge o pico no pós-natal 12 e desaparece no pós-natal dia 25, enquanto a neovascularização atinge o pico no pós-natal 17 e regrede até o pós-natal dia 25.No pós-natal de 15 a 25 camundongos de retinopatia induzidos pelo oxigênio, o diâmetro do vaso sanguíneo da retina aumenta e se torna altamente torturante em comparação com o observado para as retinas de camundongos normais. Os fórceps na mão esquerda desempenham principalmente um papel coadjuvante. Tome cuidado para não apertar o globo ocular, que pode deformá-lo ou rompê-lo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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