Name: Alcançando a triagem eficiente de fragmentos nas instalações da XChem na Diamond Light Source (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Descubra a triagem eficiente de fragmentos por cristalografia de raios X usando a plataforma XChem na Diamond Light Source. Este método acelera a descoberta de fármacos baseada em fragmentos.

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Este trabalho representa um grande esforço conjunto entre a Fonte de Luz Diamante e o Consórcio Genômico de Estrutura. Os autores gostariam de agradecer aos vários grupos de apoio e ao grupo MX da Diamond por sua contribuição para a automação da linha de luz i04-1 e por fornecer coleta de dados simplificada e pipelines de processamento automático, que são comumente executados em todas as linhas de luz MX. Eles também gostariam de agradecer ao grupo SGC PX por sua resiliência sendo os primeiros usuários a testar a configuração e à Evotec por ser o primeiro usuário industrial sério. Este trabalho foi apoiado pelo iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado pelo programa Horizonte 2020 da Comissão Europeia.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O processo descrito neste artigo foi extensivamente testado pela comunidade de usuários e a adaptabilidade dos protocolos descritos aqui é fundamental para lidar com a ampla variedade de projetos normalmente encontrados na plataforma. No entanto, alguns pré-requisitos do sistema de cristal são necessários.
Para qualquer campanha de triagem de fragmentos realizada usando cristalografia de raios X, um sistema cristalino reprodutível e robusto é fundamental. Como o protocolo XChem padrão envolve a adição do fragmento diretamente à gota de cristal, a otimização deve se concentrar no número de gotas contendo cristais de alta qualidade em vez do número total de cristais. Se as gotas contêm vários cristais, então eles são efetivamente redundantes, embora possam aliviar o processo de colheita. Além disso, transferir o protocolo de cristalização do instituto de origem para as instalações no local pode ser um desafio. Isso geralmente é melhor alcançado usando semeadura de cristais para promover nucleação reprodutível54 e, portanto, uma boa prática é que os usuários forneçam estoques de sementes juntamente com suas soluções de proteína e cristalização.
Para garantir uma boa solubilidade e suporte dos compostos, as altas concentrações de embebição destinadas a conduzir a ligação de fragmentos fracos, bibliotecas de fragmentos são fornecidas em solventes orgânicos, especificamente DMSO e etilenoglicol. O fornecimento de dois solventes diferentes oferece aos utilizadores uma alternativa para cristais que não toleram DMSO, ou onde ocluem a ligação de fragmentos num local de interesse. Os usuários podem fornecer bibliotecas alternativas em tampão aquoso: os compostos serão bem dispensados desde que estejam completamente dissolvidos e formatados em placas compatíveis com o robô de distribuição de líquidos.
Para projetos em que não é possível encontrar um solvente orgânico apropriado que solubilize a biblioteca e seja tolerado pelo sistema cristalino, um procedimento alternativo é usar compostos secos, conforme estabelecido no BESSY55.
Na comunidade, há uma questão de longa data sobre ser capaz de mergulhar compostos em cristais cultivados em condições de cristalização contendo altas concentrações de sal. Na prática, observa-se maior precipitação dos compostos e rápida formação de cristais de sal na fase de colheita, que é reduzida com a aplicação de um ambiente úmido ao redor da área de colheita. Geralmente, campanhas de triagem em sistemas de cristal de condições de alta cristalização de sal dão uma taxa de acerto comparável a condições de baixo teor de sal.
Os estágios iniciais do processo XChem (teste de tolerância a solventes e pré-triagem) são experimentos rápidos e de escala relativamente pequena, mas permitem uma decisão clara de ir/não ir para o projeto. Mais dolorosamente, sistemas de cristal alternativos precisarão ser encontrados se nenhum solvente for tolerado, ou se a pré-tela resultar em uma taxa de acerto muito baixa. Por outro lado, se forem bem-sucedidos, os resultados informam diretamente a condição de embebição a ser utilizada para o experimento de triagem e a melhor estratégia para a coleta de dados. Uma vez que a qualidade dos dados, especialmente a resolução, afetará a qualidade da densidade eletrônica para identificação e análise de acertos, o objetivo é mergulhar na maior concentração possível de compostos que não tenham um efeito deletério na qualidade da difração (com a maioria dos conjuntos de dados (~80%) diferindo para uma resolução de 2,8 Å ou melhor).
O processo de análise de dados é simplificado dentro do XChemExplorer, que conta com o software PanDDA para a detecção de ligantes fracos e permite que os usuários visualizem e revisem rapidamente os resultados da campanha de triagem. O XChemExplorer importa resultados de processamento de dados dos pacotes disponíveis no Diamond (DIALS16, autoPROC 30, STARANISO31 e Xia214) com limites de resolução determinados pelo método padrão para cada pacote (ou seja,CC1/2 = 0,3). Por padrão, a seleção do conjunto de dados é baseada em uma pontuação calculada a partir de I/sigI, completude e um número de reflexões exclusivas, mas resultados de processamento específicos podem ser selecionados para uso global ou para amostras individuais25. Os dados também são excluídos da análise pelo PanDDA com base em critérios que incluem resolução, Rlivre e diferença no volume de célula unitária entre dados de referência e de destino (os padrões são 3,5 Å, 0,4 e 12%, respectivamente), de modo que cristais mal difratados, descentralizados ou indexados incorretamente não afetam a análise.
O algoritmo PanDDA aproveita o número substancial de conjuntos de dados coletados durante uma campanha de fragmentos para detectar ligantes de ocupação parcial que não são visíveis em mapas cristalográficos padrão. Inicialmente, o PanDDA usa dados coletados durante o teste de tolerância a solventes e etapas de pré-triagem para preparar um mapa de densidade média que é usado para criar um modelo de estado fundamental. Como este modelo será usado para todas as etapas subsequentes de análise, é vital que ele represente com precisão a proteína não ligada nas condições usadas para a tela de fragmento. O PanDDA então usa uma análise estatística para identificar ligantes ligados, gerando um mapa de eventos para o estado ligado do cristal. Um mapa de eventos é gerado subtraindo-se a fração não ligada do cristal do conjunto de dados de ocupação parcial e apresenta o que seria observado se o ligante estivesse ligado em plena ocupação. Mesmo fragmentos que aparecem claros em mapas convencionais de 2mFo-DF c podem ser mal modelados se os mapas de eventos não forem consultados32. Enquanto o PanDDA é um método poderoso para identificar conjuntos de dados que diferem dos mapas médios (o que geralmente é indicativo de ligação de fragmentos) e métricas como RSCC, RSZD, razão do fator B e RMSD durante o refinamento são fornecidas para o benefício do usuário, o usuário é responsável por decidir se a densidade observada representa com precisão o ligante esperado e a conformação mais adequada.
Após a análise e refinamento dos dados, é possível que todos os usuários depositem simultaneamente várias estruturas no Protein Data Bank (PDB) usando o XChemExplorer. Para cada fragmento-tela, são feitos dois depoimentos grupais. A primeira deposição contém todos os modelos vinculados a fragmentos, com coeficientes para calcular mapas de eventos PanDDA incluídos em arquivos MMCIF. A segunda deposição fornece o modelo de estado fundamental que acompanha, ao longo dos fatores de estrutura medidos de todos os conjuntos de dados do experimento: esses dados podem ser usados para reproduzir a análise do PanDDA e para desenvolver algoritmos futuros. Quanto às estruturas dos hits, quando a ocupação dos fragmentos é baixa, o refinamento é melhor comportado se os modelos forem um composto das estruturas ligantes e confundidoras do estado fundamental32; No entanto, a prática é depositar apenas as frações de estado-limite, uma vez que os modelos compostos completos são, em geral, complexos e difíceis de interpretar. Como resultado, alguns indicadores de qualidade recalculados pelo APO (em particular, R/Rfree) são por vezes ligeiramente elevados. Também é possível fornecer todos os dados brutos usando plataformas como o Zenodo56, embora isso não seja suportado atualmente pelo pipeline do XChem.
No geral, desde sua operação em 2016, os ligantes fragmentados puderam ser identificados em mais de 95% dos alvos usando esse procedimento. A experiência dos muitos projetos que o XChem apoiou foi destilada nas melhores práticas para a preparação de cristais33, enquanto uma biblioteca de fragmentos foi desenvolvida que implementou o conceito de equilíbrio para auxiliar a progressão de fragmentos29, ajudando também a estabelecer a prática de tornar pública a composição da biblioteca. A plataforma demonstrou a importância de uma infraestrutura bem mantida e de processos documentados, detalhados aqui, e tornou possível avaliar outras bibliotecas de fragmentos57,58, comparar bibliotecas48 e informar o projeto da biblioteca colaborativa EUOpenscreen-DRIVE 59,60.

O Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) é uma estratégia amplamente utilizada para a descoberta de chumbo e, desde seu surgimento, há 25 anos, já entregou quatro fármacos para uso clínico e mais de 40 moléculas foram avançadas para ensaios clínicos 1,2,3. Fragmentos são pequenas entidades químicas geralmente com peso molecular de 300 Da ou menos. São selecionados por sua baixa complexidade química, que fornecem bons pontos de partida para o desenvolvimento de inibidores altamente eficientes em ligantes e com excelentes propriedades físico-químicas. Seu tamanho significa que eles amostram a paisagem de ligação de proteínas mais completamente do que bibliotecas de compostos maiores semelhantes a drogas ou chumbo e, portanto, também revelam pontos quentes e supostos sítios alostéricos. Combinados com informações estruturais, fragmentos fornecem um mapa detalhado das potenciais interações moleculares entre proteína e ligante. No entanto, detectar e validar de forma confiável essas entidades, que tendem a se ligar fracamente à proteína-alvo, requer uma série de métodos de triagem biofísica robustos e sensíveis, como a Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR), a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ou a Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)4,5.
A cristalografia de raios X é uma parte essencial do kit de ferramentas FBDD: é sensível o suficiente para identificar ligantes fracos e produz diretamente informações estruturais sobre as interações em nível molecular. É complementar a outras telas biofísicas e geralmente essencial para o progresso de fragmentos atingidos por compostos de chumbo; requer sistemas de cristal de alta qualidade, o que significa que a cristalização é altamente reprodutível, e os cristais idealmente difratam para uma resolução melhor do que 2,8 Å.
Historicamente, tem sido muito difícil utilizar a cristalografia como tela de fragmentos primários6,7,8, seja na academia ou na indústria. Em contraste, os síncrotrons alcançaram melhorias de ordem de magnitude em robótica, automação 9,10,11 e tecnologia de detectores 12,13, e combinados com poder computacional igualmente acelerado e algoritmos de processamento de dados14,15,16, conjuntos de dados completos de difração podem ser medidos em segundos e grande número deles totalmente autônomos, como pioneiro no LillyCAT7 e posteriormente MASSIF17,18 (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)). Isso levou os síncrotrons a desenvolver plataformas altamente simplificadas para tornar a triagem de fragmentos baseada em cristais como tela primária acessível a uma ampla comunidade de usuários (XChem at Diamond; CrystalDirect na EMBL/ESRF19; BESSY em Helmholtz-Zentrum Berlin20; FragMax no MaxIV21).
Este trabalho documenta os protocolos que constituem a plataforma XChem para triagem de fragmentos por cristalografia de raios X, desde a preparação da amostra até os resultados estruturais finais de golpes modelados em 3D. O pipeline (Figura 1) exigiu o desenvolvimento de novas abordagens para identificação de cristais 22, embebição 23 e colheita 24, bem como software de gerenciamento de dados25 e uma abordagem algorítmica para identificar fragmentos 26 que agora é amplamente utilizada na comunidade. A tecnologia de colheita de cristais agora é vendida por um fornecedor (ver Tabela de Materiais), e a disponibilidade aberta das ferramentas permitiu que outros síncrotrons as adaptassem para montar plataformas equivalentes21. Os projetos em andamento abordam a análise de dados, a conclusão do modelo e a disseminação de dados por meio da plataforma Fragalysis27. O laboratório de preparação de amostras é adjacente à linha de luz I04-1, simplificando a logística de transferência de centenas de amostras congeladas para a linha de luz e o tempo de luz dedicado em I04-1 permite um rápido feedback de raios-X para guiar a campanha.
O XChem é parte integrante do programa de usuários do Diamond, com duas chamadas por ano (início de abril e outubro). O processo de revisão por pares foi aperfeiçoado em consulta com especialistas em descoberta de medicamentos da Academia e da Indústria. Juntamente com um forte caso científico, o processo de proposta28 exige que os candidatos autoavaliem não apenas a prontidão do sistema cristalino, mas também sua experiência em métodos bioquímicos e ortogonais biofísicos e capacidade de progredir acertos de triagem por meio de química de acompanhamento. Os modos de acesso também evoluíram para acomodar a comunidade multidisciplinar de usuários:
O nível 1 (projeto único ) é para projetos na fase exploratória e ferramentas de validação de sucesso (ferramentas biofísicas ou bioquímicas) e estratégias de acompanhamento não precisam estar em vigor. Se aceito, o projeto recebe um número reduzido de turnos de tempo de feixe, o suficiente para prova de conceito.
O nível 2 (projeto único) é para projetos bem validados e requer ferramentas downstream e estratégias de acompanhamento para estar em vigor. Se aceito, o projeto recebe tempo de feixe suficiente para uma campanha de triagem completa de fragmentos. Os projetos individuais (Tier 1 ou Tier 2) devem ser concluídos dentro dos 6 meses do período de alocação (abril a setembro ou outubro a março).
O Block Allocation Group (BAG) é para um consórcio de grupos e projetos, onde um processo robusto de seleção e priorização de alvos está em vigor dentro do BAG, juntamente com um pipeline de acompanhamento claro. Os BAGs devem ter pelo menos um especialista totalmente treinado em XChem (superusuário), que coordene suas atividades com a equipe Diamond e treine os membros do BAG. O número alocado de turnos de tempo de feixe é definido pelo número de projetos cientificamente fortes no BAG e é reavaliado por período de alocação com base no relatório do BAG. O acesso está disponível por 2 anos.
O experimento XChem é dividido em três etapas, com um ponto de decisão para cada uma delas: teste de tolerância ao solvente, pré-tela e tela principal (Figura 2). O teste de tolerância ao solvente ajuda a definir os parâmetros de imersão, a quantidade de solvente (DMSO, etilenoglicol ou outros crioprotetores, se necessário) que o sistema de cristal pode tolerar e por quanto tempo. As concentrações de solventes normalmente variam de 5% a 30% em pelo menos dois pontos de tempo. Os dados de difração são coletados e comparados com a difração de base do sistema cristalino; Isso determinará os parâmetros de imersão para o estágio seguinte. Para a pré-peneira, 100-150 compostos são embebidos usando as condições determinadas no teste de solvente, e seu objetivo é confirmar que os cristais podem tolerar os compostos nessas condições. Se necessário, o crioprotetor é posteriormente adicionado às gotas que já contêm os fragmentos. Os critérios de sucesso são que 80% ou mais dos cristais sobrevivam bem o suficiente para produzir dados de difração de boa e consistente qualidade; Se isso falhar, as condições de imersão geralmente são revisadas alterando o tempo de imersão ou a concentração de solvente. Após uma pré-triagem bem-sucedida, o resto dos compostos escolhidos para o experimento pode ser configurado usando os parâmetros finais.
A biblioteca com equilíbrio DSI (ver Tabela de Materiais) foi projetada propositalmente para permitir uma rápida progressão de acompanhamento usando química equilibrada29 e tem sido a biblioteca de trabalho da instalação. Está disponível para usuários a uma concentração de 500 mM em DMSO. Os usuários acadêmicos também podem acessar outras bibliotecas fornecidas pelos colaboradores (mais de 2.000 compostos no total) em concentrações de 100-500 mM em DMSO (uma lista completa pode ser encontrada no site28). Grande parte da coleção global também está disponível em etilenoglicol, para sistemas de cristal que não toleram DMSO. Os usuários também podem trazer suas próprias bibliotecas, desde que estejam em placas compatíveis com o sistema de manuseio de líquidos acústicos (consulte Tabela de Materiais).
Para as três etapas do experimento (caracterização do solvente, pré-tela ou tela cheia), os seguintes procedimentos de preparação da amostra são idênticos (Figura 3): seleção do local de dispensação do composto através de imageamento e direcionamento das gotas de cristalização com TeXRank22; dosagem em gotas utilizando o sistema de dispensação de líquido acústico para solvente e compostos23; colheita eficiente dos cristais utilizando o shifter Crystal24; e upload de informações de amostras para o banco de dados de linhas de luz (ISPyB). A interface atual para projeto e execução de experimentos é uma aplicação baseada em Excel (SoakDB), que gera os arquivos de entrada necessários para os diferentes equipamentos da plataforma, e rastreia e registra todos os resultados em um banco de dados SQLite. Os scanners de código de barras são usados em vários estágios ao longo do processo para ajudar a rastrear amostras e esses dados são adicionados ao banco de dados.
Os dados de difração são coletados em modo autônomo usando tempo de feixe dedicado na linha de luz I04-1. Dois modos de centralização estão disponíveis, a saber, óptico e baseado em raios-X17. Para cristais em forma de agulha e haste, a centralização de raios X é aconselhada, enquanto cristais chunkier geralmente suportam o modo óptico, que é mais rápido e, portanto, permite que mais amostras sejam coletadas no tempo de feixe alocado. Dependendo da resolução dos cristais (estabelecida antes de entrar na plataforma) a coleta de dados pode ser de 60 s ou 15 s de exposição total. A coleta de dados durante a fase de teste de solvente geralmente informa qual combinação funcionará melhor com o desempenho da linha de luz I04-1.
O grande volume de análise de dados é gerenciado através do XChemExplorer (XCE)25, que também pode ser usado para iniciar a etapa de identificação de acertos usando o PanDDA26. O XCE é uma ferramenta de gerenciamento de dados e fluxo de trabalho que suporta a análise em larga escala de estruturas proteína-ligante (Figura 4); ele lê qualquer um dos resultados de processamento automático de dados coletados no Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 e STARANISO31) e seleciona automaticamente um dos resultados com base na qualidade dos dados e similaridade com um modelo de referência. É importante que o modelo seja representativo do sistema cristalino usado para a triagem do XChem, e deve incluir todas as águas ou outras moléculas de solvente, bem como todos os cofatores, ligantes e conformações alternativas visíveis em cristais embebidos apenas com solvente. A qualidade deste modelo de referência impactará diretamente a quantidade de trabalho necessário durante a fase de construção e refinamento do modelo. O PanDDA é usado para analisar todos os dados e identificar locais de vinculação. Alinha estruturas a uma estrutura de referência, calcula os mapas estatísticos, identifica eventos e calcula mapas de eventos26,32. No paradigma PanDDA, não é necessário nem desejável construir o modelo cristalográfico completo; O que deve ser modelado é apenas a visão da proteína onde um fragmento está ligado (o modelo de estado ligado), de modo que o foco precisa ser apenas na construção do ligante e das moléculas de resíduos/solventes circundantes de acordo com o mapa de eventos32.

<table><tbody><tr><td>Biblioteca de fragmentos</td><td>Enamine</td><td>DSI-896</td><td></td></tr><tr><td>Séries Echo 550 e 650</td><td>Sistema de dosagem acústica</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas</td><td>Echo Beckman-Coulter</td><td>001-12380; 001-8768; 001-6025</td><td>Microplacas de 1536 poços e 384 poços</td></tr><tr><td>Shifter</td><td>Oxford Lab Technology</td><td></td><td>dispositivo de colheita Microplaca</td></tr><tr><td> centrífuga com rotor basculante</td><td>Centrífuga de microplacas</td><td>Sigma</td><td>modelo 11121</td></tr><tr><td>Placas de cristalização de 3 gotas</td><td>Swissci</td><td>3W96T-UVP</td><td>Placas de cristalização</td></tr><tr><td>Formulatrix Imageador de placas e software Rockmaker</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Dispositivo de imagem de placas de cristalização</td></tr></tbody></table>

alcançando a triagem eficiente de fragmentos nas instalações da xchem na diamond light source

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

Na descoberta de drogas baseadas em fragmentos, centenas ou muitas vezes milhares de compostos menores que ~300 Da são testados contra a proteína de interesse para identificar entidades químicas que podem ser desenvolvidas em potentes candidatos a fármacos. Como os compostos são pequenos, as interações são fracas e, portanto, o método de triagem deve ser altamente sensível; Além disso, informações estruturais tendem a ser cruciais para a elaboração desses acertos em compostos semelhantes a chumbo. Portanto, a cristalografia de proteínas sempre foi uma técnica padrão-ouro, mas historicamente muito desafiadora para encontrar uso generalizado como tela primária.
Experimentos iniciais do XChem foram demonstrados em 2014 e, em seguida, testados com colaboradores acadêmicos e industriais para validar o processo. Desde então, um grande esforço de pesquisa e um tempo de feixe significativo simplificaram a preparação de amostras, desenvolveram uma biblioteca de fragmentos com possibilidades de acompanhamento rápido, automatizaram e melhoraram a capacidade da linha de luz I04-1 para coleta autônoma de dados e implementaram novas ferramentas para gerenciamento de dados, análise e identificação de acertos.
O XChem é agora uma instalação para triagem de fragmentos cristalográficos em larga escala, suportando todo o processo de deposição de cristais e acessível a usuários acadêmicos e industriais em todo o mundo. O programa de usuários acadêmicos revisado por pares tem sido ativamente desenvolvido desde 2016, para acomodar projetos de um escopo científico o mais amplo possível, incluindo projetos bem validados e exploratórios. O acesso acadêmico é alocado por meio de chamadas semestrais para propostas revisadas por pares, e o trabalho proprietário é organizado pelo grupo de Ligação Industrial da Diamond. Esse fluxo de trabalho já foi aplicado rotineiramente a mais de uma centena de alvos de diversas áreas terapêuticas e identifica efetivamente ligantes fracos (1%-30% de taxa de acerto), que servem como pontos de partida de alta qualidade para o projeto de compostos e fornecem informações estruturais extensas sobre locais de ligação. A resiliência do processo foi demonstrada pela triagem contínua dos alvos SARS-CoV-2 durante a pandemia COVID-19, incluindo uma reviravolta de 3 semanas para a protease principal.

O pipeline do XChem para triagem de fragmentos por cristalografia de Raios-X foi amplamente simplificado, possibilitando sua absorção pela comunidade científica (Figura 5). Esse processo foi validado em mais de 150 campanhas de rastreamento com taxa de acerto variando entre 1% e 30G,48,49,50,51,52 e por muitos usuários repetidos. Sistemas cristalinos que não são adequados (baixa resolução, inconsistentes na cristalização ou na qualidade da difração) ou não toleram DMSO ou etilenoglicol são eliminados no início do processo, economizando tempo, esforço e recursos. Campanhas bem-sucedidas fornecem um mapa tridimensional de potenciais locais de interação na proteína alvo; um resultado típico é a triagem XChem da protease principal do SARS-CoV-2 (Figura 6). Tipicamente, os acertos dos fragmentos são encontrados em: (a) locais de interesse conhecidos, como sítios ativos enzimáticos e subbolsas48; (b) sítios alostéricos putativos, por exemplo, nas interações proteína-proteína53; (c) interfaces de empacotamento de cristais, geralmente consideradas como falsos positivos (Figura 6). Esses dados estruturais geralmente fornecem uma base para a fusão, ligação ou crescimento de fragmentos em pequenas moléculas semelhantes a chumbo 1,3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig01.jpg"> Figura 1: O pipeline do XChem. A plataforma é representada esquematicamente desde a proposta do projeto até a preparação da amostra, coleta de dados e identificação de acertos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig02.jpg"> Figura 2: Estratégia de triagem. O fluxo de trabalho indica a finalidade de cada etapa, os requisitos do experimento e os pontos de decisão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig03.jpg"> Figura 3: Fluxo de trabalho de preparação da amostra. As etapas críticas para a preparação da amostra são representadas com as informações de cada etapa sendo registradas em um banco de dados SQLite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig04.jpg"> Figura 4: Análise dos dados utilizando XCE. As etapas críticas na análise de dados são representadas por um diagrama de fluxo de trabalho com os pacotes de software relevantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig05.jpg"> Figura 5: Evolução do programa de usuários do XChem: O gráfico demonstra a aceitação e consolidação do programa de usuários de 2015 a 2019 com a criação de BAGs em 2019 e a resiliência da plataforma durante a pandemia de COVID-19 em 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig06.jpg"> Figura 6: Resultados representativos da tela de fragmento do XChem. O dímero da protease principal do SARS-CoV2 (Mpro) é representado na superfície com os acertos do sítio ativo mostrados em amarelo, os possíveis hits alostéricos mostrados em magenta e os artefatos de superfície/empacotamento de cristais mostrados em verde. A figura foi feita usando entradas de quimera e Mpro PDB a partir de G_1002156 de deposição de grupo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este artigo descreve o processo completo do XChem para triagem de fragmentos à base de cristal, desde a solicitação de acesso e todas as etapas subsequentes até a disseminação dos dados.

Alcançando a triagem eficiente de fragmentos nas instalações da XChem na Diamond Light Source

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

A instalação XChem na Diamond Light Source fornece triagem rotineira de fragmentos gráficos de cristal em larga escala, suportando todo o processo de deposição de cristal. A cristalografia de raios X é uma parte essencial para o kit de ferramentas FBDD. É sensível o suficiente para identificar ligantes fracos e produz diretamente informações estruturais sobre as interações em nível molecular.A descoberta de drogas baseada em fragmentos é uma estratégia amplamente utilizada para a descoberta de chumbo. Entregou seis medicamentos para uso clínico e mais de 50 moléculas foram avançadas para testes clínicos. O impacto dos avanços e da eficiência proporcionados pela plataforma XChem sobre os métodos tradicionais de imersão, coleta de dados e métodos de análise melhor demonstrado visualmente.Comece escolhendo os cristais e a localização do composto. Abra o TextRank a partir de um PC e selecione a bandeja de cristal, na lista no canto inferior direito ou digitando o código de barras na caixa no canto superior esquerdo. Selecione o formato de imagem correto e a visualização de poço único.Para adicionar solvente ou compostos a uma gota sem atingir o cristal, clique com o botão direito do mouse dentro da gota, mas longe do cristal quando um cristal adequado para um experimento for encontrado enquanto se move pelas imagens da gota. Abra o software Echo e selecione novas soluções para dispensar usando o dispensador acústico. Escolha a placa de poço de origem correta e a classe de líquido.Verifique se o tipo de placa correto está selecionado como a placa de destino. Em seguida, marque a caixa personalizada e continue. Selecione importar e escolha o arquivo em lote relevante.Em seguida, conclua as etapas de importação conforme solicitado pelo software. Use os mapas de placas para verificar a solução a ser dispensada e os locais de destino. Em seguida, execute o protocolo seguindo os prompts à medida que eles aparecem.As soluções da placa de origem serão dispensadas nas gotas de cristal escolhidas. Guarde o prato na incubadora pelo tempo necessário. Para colher os cristais usando o dispositivo de colheita de cristais semiautomático, pressione o botão de fluxo de trabalho de início para mover para a primeira posição de poço selecionada.Se o cristal tiver sobrevivido, monte-o no laço e mergulhe-o no nitrogênio líquido, colocando-o na posição um no primeiro puck da lista. Selecione a descrição apropriada para o cristal na interface. Se a gota for um molho composto, registre a descrição do estado composto.Se o cristal tiver sido montado com êxito, selecione montado, caso contrário, selecione falhar. Uma vez que os cristais tenham sido colhidos, leve os pucks para o scanner de código de barras e coloque-os no suporte, um de cada vez, para escanear o puck e os códigos de barras de pinos. Uma vez concluída a digitalização, coloque as tampas sobre os pucks e guarde-os em um dewar de armazenamento de nitrogênio líquido.Para recuperar as amostras descentralizadas, observe a exibição do trocador de amostra no ISPyB e selecione a classificação por resolução AP para classificar as amostras por resolução processada automaticamente em uma graduação de cores de verde para vermelho. Clique nas amostras para verificar se há amostras vermelhas ou amarelas. Em seguida, verifique os instantâneos do cristal para ver se o cristal foi centralizado.Para recuperar e analisar os resultados de processamento automático do Diamond por meio do XChem Explorer ou XCE, em um terminal, vá para o processamento da subpasta e use o alias XCE para abrir o XChem Explorer. Selecione o botão Atualizar tabelas da fonte de dados na guia Visão geral para atualizar o resumo dos dados experimentais. Na guia configurações, selecione o diretório de coleta de dados, abra a guia conjuntos de dados.Escolha o destino no menu suspenso Selecionar destino, selecione Obter novos resultados do processamento automático no menu suspenso Conjuntos de dados e clique em Executar. Para calcular mapas iniciais usando Dimple, abra a guia de mapas, escolha o modelo de referência no menu suspenso e selecione os conjuntos de dados desejados seguido de executar Dimple em arquivos MTZ selecionados. Para gerar restrições de ligante, selecione os conjuntos de dados desejados e crie um arquivo SCF ou PDB ou PNG de compostos selecionados no menu suspenso de mapas e restrições.Para identificar acertos usando o Panda, selecione a guia Pandas, verifique se o diretório de saída está definido corretamente e execute o panda. analisar a partir do menu suspenso de identificação de visitas. Para analisar os acertos identificados pelo Panda, execute o Panda.Inspecione a partir do menu suspenso Identificação de Ocorrências. Para abrir o Coot com o painel de controle do Panda. Carregue mapas de média e 2mFo-DFc do Dimple para comparação com o mapa e modelo de eventos.Depois que um ligante tiver sido instalado, clique em mesclar ligante com modelo e salve o modelo antes de navegar para outro evento para evitar perder quaisquer alterações no modelo de estado vinculado. Anote o evento de vinculação usando o campo de comentário de evento e anote os sites de vinculação usando informações de site de registro. Depois que todos os ligantes viáveis tiverem sido modelados, mesclados e salvos com base no mapa de eventos, feche panda.inspect.Exporte os modelos de inspeção do Panda de volta para o diretório do projeto e inicie uma rodada inicial de refinamento para os conjuntos de dados selecionados, e o refinamento agora estará visível na guia de refinamento. O pipeline XChem para triagem de fragmentos por cristalografia de raios X foi amplamente simplificado, permitindo sua absorção pela comunidade científica. Este gráfico demonstra a adesão e consolidação do programa de usuários de 2015 a 2019 com a criação de grupos de alocação de blocos em 2019 e a resiliência da plataforma durante a pandemia de COVID-19 em 2020.Campanhas bem-sucedidas produzem um mapa tridimensional de potenciais locais de interação na proteína-alvo. Um resultado típico é a triagem XChem da protease principal do SARS-CoV-2. Os locais de interesse conhecidos, como sítios ativos enzimáticos e subbolsas, são mostrados em amarelo.Os sítios alostéricos putativos, tais como aqueles envolvidos nas interações proteína-proteína, são mostrados em magenta, e as interfaces de empacotamento de cristais geralmente consideradas falsos positivos são mostradas em verde. Historicamente, o uso da cristalografia como tela de fragmento primário tem sido difícil. Este estudo documentou os protocolos de pipeline do XChem desde a preparação da amostra até as estruturas finais.A triagem cristalográfica de fragmentos complementa outras técnicas biofísicas e geralmente é essencial para a progressão de impactos de fragmentos para compostos de chumbo. Pode ser aplicado a qualquer classe alvo de descoberta de drogas.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Neste relatório, nós descrevemos os procedimentos detalhados para a realização de experimentos de difração de cristal único de raios-X com uma bigorna de diamante na GSECARS de 13 BM-C beamline na Advanced Photon Source. programas Atrex e RSV são usados ​​para analisar os dados.

Alta Pressão Único Difração de Cristal no PX ^ 2

É apresentado um protocolo simplificado para realizar uma extensa Caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação do substrato de hidrato de carbono do Streptococcus pneumoniae .

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Nós descrevemos uma configuração de trajetória para realizar mapeamento de microdiffraction fluorescência e raio-x rápida radiografia bidimensional do único cristal ou pó amostras usando Laue (radiação policromática) ou difração (radiação monocromática). Os mapas resultantes fornecem informações sobre tensão, orientação, distribuição de fase e deformação plástica.

Síncrotron Microdiffraction de raio-x e imagem latente de fluorescência das amostras de rocha e minerais

Aqui, descrevemos como usar a triagem automatizada e opções de coleta de dados disponíveis em um pouco de luz síncroton síncrotron. Os cientistas enviar amostras de cryocooled para o síncrotron e as propriedades de difração são selecionadas, os conjuntos de dados são recolhidos e tratados e, sempre que possível, uma solução de estrutura é realizada — tudo sem intervenção humana.

Caracterização totalmente autónoma e coleta de dados de cristais de macromoléculas biológicas

Apresentamos um guia abrangente para preparação fixa de amostras de alvo, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia síncrotron serial na linha de feixe Diamond I24.

Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

A triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin é realizada usando um fluxo de trabalho com bibliotecas compostas dedicadas, ferramentas de manuseio de cristais, instalações rápidas de coleta de dados e análise de dados amplamente automatizada. O protocolo apresentado pretende maximizar a produção de tais experimentos para fornecer pontos de partida promissores para o design de ligante baseado em estrutura a jusante.

Fluxo de trabalho e ferramentas para triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin

A relação sinal-ruído dos dados é uma das considerações mais importantes na realização de medições de difração de raios-X a partir de microcristais. A linha de feixe VMXm fornece um ambiente de baixo ruído e micróbios para tais experimentos. Aqui, descrevemos métodos de preparação de amostras para montagem e resfriamento de microcristais para VMXm e outras linhas de cristalografia macromolecular microfocus.

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

Aqui, apresentamos um protocolo para preparação de amostras criogênicas e transferência de cristais para a estação final de vácuo na linha de luz I23 na Diamond Light Source, para experimentos de cristalografia de raios-X de comprimento de onda longa.

Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

Monitorar mudanças na temperatura de fusão de uma proteína alvo (ou seja,ensaio de mudança térmica, TSA) é um método eficiente para triagem de bibliotecas de fragmentos de algumas centenas de compostos. Apresentamos um protocolo TSA implementando fluoremetria nano-diferencial assistida por robótica (nano-DSF) para monitorar fluorescência triptofano intrínseca e dispersão de costas leves para triagem de fragmentos.

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

Aqui, descrevemos como usar os dutos de cristalografia macromolecular automatizados para análises de proteínas para estrutura, análise rápida do complexo ligante-proteína e triagem de fragmentos em larga escala com base na tecnologia CrystalDirect no Laboratório HTX em EMBL Grenoble.

Os gasodutos automatizados de cristalização no embl HTX Facility em Grenoble

Apresentamos um protocolo para a cristalização de proteínas usando a instalação de cristalização no Complexo de Pesquisa em Harwell e subsequente coleta de dados cristalográficos de raios X in situ de cristais dentro das placas na linha de luz Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) de Diamond. Descrevemos os requisitos da amostra, protocolos de cristalização e diretrizes de coleta de dados.

Cristalização e Coleta de Dados de Temperatura Ambiente In Situ Usando a Instalação de Cristalização em Harwell e Linha de Luz VMXi, Fonte de Luz Diamante

Descubra a triagem eficiente de fragmentos por cristalografia de raios X usando a plataforma XChem na Diamond Light Source. Este método acelera a descoberta de fármacos baseada em fragmentos.

Alcançando a triagem eficiente de fragmentos nas instalações da XChem na Diamond Light Source

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