Alcançando a triagem eficiente de fragmentos nas instalações da XChem na Diamond Light Source
29 de maio de 2021
Este artigo descreve o processo completo do XChem para triagem de fragmentos à base de cristal, desde a solicitação de acesso e todas as etapas subsequentes até a disseminação dos dados.
A instalação XChem na Diamond Light Source fornece triagem rotineira de fragmentos gráficos de cristal em larga escala, suportando todo o processo de deposição de cristal. A cristalografia de raios X é uma parte essencial para o kit de ferramentas FBDD. É sensível o suficiente para identificar ligantes fracos e produz diretamente informações estruturais sobre as interações em nível molecular.
A descoberta de drogas baseada em fragmentos é uma estratégia amplamente utilizada para a descoberta de chumbo. Entregou seis medicamentos para uso clínico e mais de 50 moléculas foram avançadas para testes clínicos. O impacto dos avanços e da eficiência proporcionados pela plataforma XChem sobre os métodos tradicionais de imersão, coleta de dados e métodos de análise melhor demonstrado visualmente.
Comece escolhendo os cristais e a localização do composto. Abra o TextRank a partir de um PC e selecione a bandeja de cristal, na lista no canto inferior direito ou digitando o código de barras na caixa no canto superior esquerdo. Selecione o formato de imagem correto e a visualização de poço único.
Para adicionar solvente ou compostos a uma gota sem atingir o cristal, clique com o botão direito do mouse dentro da gota, mas longe do cristal quando um cristal adequado para um experimento for encontrado enquanto se move pelas imagens da gota. Abra o software Echo e selecione novas soluções para dispensar usando o dispensador acústico. Escolha a placa de poço de origem correta e a classe de líquido.
Verifique se o tipo de placa correto está selecionado como a placa de destino. Em seguida, marque a caixa personalizada e continue. Selecione importar e escolha o arquivo em lote relevante.
Em seguida, conclua as etapas de importação conforme solicitado pelo software. Use os mapas de placas para verificar a solução a ser dispensada e os locais de destino. Em seguida, execute o protocolo seguindo os prompts à medida que eles aparecem.
As soluções da placa de origem serão dispensadas nas gotas de cristal escolhidas. Guarde o prato na incubadora pelo tempo necessário. Para colher os cristais usando o dispositivo de colheita de cristais semiautomático, pressione o botão de fluxo de trabalho de início para mover para a primeira posição de poço selecionada.
Se o cristal tiver sobrevivido, monte-o no laço e mergulhe-o no nitrogênio líquido, colocando-o na posição um no primeiro puck da lista. Selecione a descrição apropriada para o cristal na interface. Se a gota for um molho composto, registre a descrição do estado composto.
Se o cristal tiver sido montado com êxito, selecione montado, caso contrário, selecione falhar. Uma vez que os cristais tenham sido colhidos, leve os pucks para o scanner de código de barras e coloque-os no suporte, um de cada vez, para escanear o puck e os códigos de barras de pinos. Uma vez concluída a digitalização, coloque as tampas sobre os pucks e guarde-os em um dewar de armazenamento de nitrogênio líquido.
Para recuperar as amostras descentralizadas, observe a exibição do trocador de amostra no ISPyB e selecione a classificação por resolução AP para classificar as amostras por resolução processada automaticamente em uma graduação de cores de verde para vermelho. Clique nas amostras para verificar se há amostras vermelhas ou amarelas. Em seguida, verifique os instantâneos do cristal para ver se o cristal foi centralizado.
Para recuperar e analisar os resultados de processamento automático do Diamond por meio do XChem Explorer ou XCE, em um terminal, vá para o processamento da subpasta e use o alias XCE para abrir o XChem Explorer. Selecione o botão Atualizar tabelas da fonte de dados na guia Visão geral para atualizar o resumo dos dados experimentais. Na guia configurações, selecione o diretório de coleta de dados, abra a guia conjuntos de dados.
Escolha o destino no menu suspenso Selecionar destino, selecione Obter novos resultados do processamento automático no menu suspenso Conjuntos de dados e clique em Executar. Para calcular mapas iniciais usando Dimple, abra a guia de mapas, escolha o modelo de referência no menu suspenso e selecione os conjuntos de dados desejados seguido de executar Dimple em arquivos MTZ selecionados. Para gerar restrições de ligante, selecione os conjuntos de dados desejados e crie um arquivo SCF ou PDB ou PNG de compostos selecionados no menu suspenso de mapas e restrições.
Para identificar acertos usando o Panda, selecione a guia Pandas, verifique se o diretório de saída está definido corretamente e execute o panda. analisar a partir do menu suspenso de identificação de visitas. Para analisar os acertos identificados pelo Panda, execute o Panda.
Inspecione a partir do menu suspenso Identificação de Ocorrências. Para abrir o Coot com o painel de controle do Panda. Carregue mapas de média e 2mFo-DFc do Dimple para comparação com o mapa e modelo de eventos.
Depois que um ligante tiver sido instalado, clique em mesclar ligante com modelo e salve o modelo antes de navegar para outro evento para evitar perder quaisquer alterações no modelo de estado vinculado. Anote o evento de vinculação usando o campo de comentário de evento e anote os sites de vinculação usando informações de site de registro. Depois que todos os ligantes viáveis tiverem sido modelados, mesclados e salvos com base no mapa de eventos, feche panda.inspect.
Exporte os modelos de inspeção do Panda de volta para o diretório do projeto e inicie uma rodada inicial de refinamento para os conjuntos de dados selecionados, e o refinamento agora estará visível na guia de refinamento. O pipeline XChem para triagem de fragmentos por cristalografia de raios X foi amplamente simplificado, permitindo sua absorção pela comunidade científica. Este gráfico demonstra a adesão e consolidação do programa de usuários de 2015 a 2019 com a criação de grupos de alocação de blocos em 2019 e a resiliência da plataforma durante a pandemia de COVID-19 em 2020.
Campanhas bem-sucedidas produzem um mapa tridimensional de potenciais locais de interação na proteína-alvo. Um resultado típico é a triagem XChem da protease principal do SARS-CoV-2. Os locais de interesse conhecidos, como sítios ativos enzimáticos e subbolsas, são mostrados em amarelo.
Os sítios alostéricos putativos, tais como aqueles envolvidos nas interações proteína-proteína, são mostrados em magenta, e as interfaces de empacotamento de cristais geralmente consideradas falsos positivos são mostradas em verde. Historicamente, o uso da cristalografia como tela de fragmento primário tem sido difícil. Este estudo documentou os protocolos de pipeline do XChem desde a preparação da amostra até as estruturas finais.
A triagem cristalográfica de fragmentos complementa outras técnicas biofísicas e geralmente é essencial para a progressão de impactos de fragmentos para compostos de chumbo. Pode ser aplicado a qualquer classe alvo de descoberta de drogas.
Visão Geral
Este artigo descreve o processo completo XChem para triagem de fragmentos baseada em cristais, detalhando as etapas desde a solicitação de acesso até a disseminação dos dados. A Instalação XChem na Diamond Light Source aprimora a descoberta de fármacos baseada em fragmentos por meio de cristalografia de raios X eficiente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Descoberta de fármacos baseada em fragmentos (FBDD)
- Cristalografia de raios X
- Biologia estrutural
Contexto
- A descoberta de fármacos baseada em fragmentos é uma estratégia para a identificação de compostos iniciais.
- A cristalografia de raios X fornece informações estruturais sobre interações moleculares.
- Os métodos tradicionais de imersão apresentam limitações que o XChem resolve.
- A plataforma XChem demonstrou resiliência durante a pandemia de COVID-19.
Objetivo do Estudo
- Documentar os protocolos do pipeline XChem, desde a preparação da amostra até as estruturas finais.
- Demonstrar a eficiência da plataforma XChem para triagem de fragmentos.
- Destacar o impacto da triagem cristalográfica de fragmentos na descoberta de fármacos.
Métodos Utilizados
- Seleção de cristais e compostos para triagem.
- Uso de dispensadores acústicos para a dispensação de soluções.
- Coleta de cristais utilizando dispositivos semiautomáticos.
- Análise de dados por meio dos softwares XChem Explorer e Panda.
Resultados Principais
- Campanhas bem-sucedidas geram mapas tridimensionais de sítios de interação.
- Registro da utilização do programa por usuários de 2015 a 2019.
- Identificação de sítios alostéricos potenciais e sítios ativos em proteínas.
- Protocolos simplificados permitem acesso mais amplo pela comunidade científica.
Conclusões
- O pipeline XChem melhora significativamente a eficiência da triagem de fragmentos.
- A triagem cristalográfica de fragmentos complementa outras técnicas biofísicas.
- Avanços na plataforma XChem apoiam os esforços contínuos de descoberta de fármacos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A descoberta de fármacos baseada em fragmentos depende da detecção sensível de interações moleculares fracas, onde a cristalografia de raios X fornece tanto a afinidade de ligação quanto os detalhes estruturais essenciais para a otimização de compostos iniciais. A instalação XChem na Diamond Light Source simplifica a triagem cristalográfica de fragmentos, desde o preparo da amostra até a deposição dos dados, permitindo a identificação rotineira de ligantes fracos com alta fidelidade estrutural. Essa capacidade apoia a validação precoce de alvos e a progressão de hits para compostos líderes em diversas áreas terapêuticas, reduzindo a incerteza mecanicista nos processos de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da observação direta dos modos de ligação do ligante em resolução atômica.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos ao confirmar o engajamento do alvo e a acessibilidade do sítio de ligação antes do investimento na campanha.
- Valor Preditivo: Gera pontos iniciais com alta confiabilidade para a química medicinal ao identificar fragmentos com geometrias de interação definidas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Fornece saídas estruturais padronizadas e reprodutíveis que permitem a avaliação confiável de compostos em diversas campanhas.
- Escalabilidade: Permite triagem em alto rendimento por meio do manuseio automatizado de amostras e coleta autônoma de dados na linha de feixe I04-1.
- Qualidade dos Dados: Gera mapas quantitativos de densidade eletrônica e restrições de ligantes que apoiam a validação de hits e o refinamento subsequente.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Fornece informações estruturais que se alinham ao desenvolvimento de biomarcadores por meio da identificação de sítios de interação relevantes para a função.
- Redução de Riscos Pré-clínicos: Permite acompanhamento rápido de alvos promissores a partir de novos alvos emergentes, conforme demonstrado durante a triagem da protease principal do SARS-CoV-2, com retorno em 3 semanas.
- Relevância para o Portfólio: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer evidências estruturais de ligação em diversas classes de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A plataforma XChem integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos ativos, oferecendo dados estruturais que orientam a seleção de hits e as estratégias de otimização.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer evidências estruturais diretas de interações entre compostos e alvos, esclarecendo os mecanismos de ligação.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de fluxos de trabalho automatizados de manipulação de cristais, dispensação de solventes e processamento de dados que garantem reprodutibilidade.
- Análises: Gera resultados mensuráveis, incluindo mapas de eventos de ligação de ligantes, modelos prontos para refinamento e anotações de sítios que permitem análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta fragmentos ativos à continuidade pré-clínica ao fornecer contexto estrutural para o engajamento do alvo e modulação alostérica.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade de triagem estrutural reutilizável, acessível por meio de vias acadêmicas revisadas por pares e industriais proprietárias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da visualização estrutural direta de interações de ligantes fracos, reduzindo a ambiguidade na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos simplificados, dispensação automatizada e gerenciamento centralizado de dados através do XChem Explorer.
- Valor Estratégico: Decisões de prosseguimento ou interrupção aprimoradas mediante a confirmação estrutural de acertos que complementa o triagem biofísica.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco possibilitada por dados estruturais sobre a plasticidade do sítio de ligação e pontos críticos de interação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cristalografia, manipulação de bibliotecas de fragmentos e interpretação de dados estruturais.
- Depende do acesso a linhas de luz de sincrotrons, sistemas de dispensação acústica e ferramentas automatizadas de colheita de cristais.
- Necessita padronização entre equipes no rastreamento de amostras, nomenclatura de dados e protocolos de deposição por meio do ISPyB e do XChem Explorer.
- Envolve considerações de adaptação quanto à qualidade dos cristais, compatibilidade com solventes e condições de imersão específicas para o alvo.
- As limitações práticas incluem a dependência da obtenção de cristais e da sensibilidade à radiação X de certos alvos, conforme observado no estudo.
