Name: Isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprenda o isolamento de células de válvula aórtica de rato usando digestão com colagenase em duas etapas. Este método viabiliza estudos in vitro sobre calcificação valvar e vias moleculares em estenose aórtica.

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NOTA: Todos os procedimentos animais aqui descritos foram aprovados pela Escola de Medicina Icahn no comitê institucional de núcleo e uso do Monte Sinai.
1. Preparação antes do isolamento da célula da válvula de camundongos adultos
<ol><li>Limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos mostrados na Figura 1A utilizando 70% de v/v de etanol e, posteriormente, autoclavando-os por 30 minutos. limpe o espaço cirúrgico com 70% de etanol.</li>
	<li>Adicione 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Prepare uma alíquota de 50 mL de salina tamponada com fosfato de 1x (PBS). Mantenha as soluções no gelo.</li>
	<li>Prepare soluções de colagenase de 1 mg/mL e 4,5 mg/mL e utilize 5 mL de cada solução em tubos de 15 mL para realizar todo o procedimento. Para preparar 5 mL de colagenase de 1 mg/mL, misturar 5 mg de colagenase com 2,5 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, fetal bovino -free) e 2,5 mL de 10 mM HEPES complementado com antibióticos (1% penicilina-estreptomicina a partir da etapa 1.2). Filtre as soluções através de um filtro de 0,22 μm para remover qualquer contaminação. NOTA: Mantenha as soluções no gelo para proteger as enzimas.</li>
	<li>Aqueça a solução DMEM a 37 °C antes de usar em todas as etapas descritas abaixo. Prepare o meio completo suplementando OMEM com 1% de penicilina-estreptomicina, 1% piruvato de sódio, 5 mL de L-glutamina de 200 mM, 1 mL de reagente eliminatório de micoplasma (ver a Tabela de Materiais),e 10% FBS.</li>
</ol>2. Isolamento das células válvulas
<ol><li>Para obter 106 células para o experimento, use cinco camundongos de 8 semanas de idade (mínimo de três). Coloque o mouse em uma câmara de indução junto com um pequeno pedaço de papel de tecido encharcado com 1 mL de isoflurane, mas não permita contato com o tecido. Para confirmar que o animal está totalmente anestesiado; verificar o reflexo de beliscar o dedo do dedo do dedo, e, em seguida, eutanásia o rato por luxação cervical. Use isoflurane para aliviar qualquer dor antes da luxação cervical, pois o procedimento descrito abaixo é terminal.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma plataforma de dissecação e conserte as patas com cânulas para mantê-lo no lugar. Limpe o peito e o abdômen com etanol; abra o abdômen e o peito com uma tesoura. Com uma pequena tesoura cirúrgica, corte entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo para exsanguinar o rato. Perfunda o coração com 10 mL de 1x pbs frio para remover sangue do coração.</li>
	<li>Corte o coração e mantenha 3 mm da aorta ascendente como mostrado na Figura 1B. Disseca a válvula aórtica sob um estereótipo. Corte o coração horizontalmente no meio dos ventrículos(Figura 1C). Corte o ventrículo esquerdo em direção à aorta e disseca cuidadosamente a válvula aórtica(Figura 1D-F). Misture as válvulas em um pequeno prato de cultura de tecido de 35 mm.</li>
	<li>Lave as válvulas isoladas em um prato de cultura celular de 75 mm com 5 mL de HEPES frio (10 mM) complementados com antibióticos (1% penicilina-estreptomicina) para remover sangue(Figura 2). Prepare dois tubos de 15 mL de colagenase 1 mg/mL e 4,5 mg/mL conforme descrito acima na etapa 1.3. NOTA: Após a dissecção, manipule as válvulas isoladas em uma capa biossegurança estéril para minimizar a contaminação.</li>
	<li>Incubar as válvulas em colagenase tipo I (1 mg/mL) por 30 min a 37 °C com agitação contínua(Figura 2). Centrifugar o tubo por 5 min a 150 × g,lavar a pelota uma vez com 2 mL de HEPES (10 mM) e vórtice para 30 s em alta velocidade. Despeje o conteúdo deste tubo em um prato de cultura de 35 mm, e transfira cuidadosamente os fragmentos de tecido usando pinças finas em um novo tubo. NOTA: Nesta fase, os VICs ainda não estão dissociados do tecido, e a pelota contém pedaços de tecido. Para evitar contaminação com células endoteliais, não centrífugue após o vórtice na etapa 2.5.</li>
	<li>Incubar a pelota em um tubo de 15 mL com 5 mL de colagenase tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C sob agitação contínua por 35 min. Suspenda as células com uma pipeta de 1 mL para separar as células e centrífugas a 150 × g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o supernatante e suspenda a pelota em 2 mL de DMEM completo. Centrifugar a 150 × g por 5 min a 4 °C. Repita este passo duas vezes para limpar as células. NOTA: A pelota ainda terá alguns fragmentos de tecido.</li>
	<li>Suspenda a pelota em 1 mL de meio completo, e emplaque as células em um poço de um prato de cultura celular de 6 poços em uma quantidade mínima de meio para facilitar seu apego ao prato de cultura. Deixe as células, sem perturbação, em uma incubadora de 37 °C com 5% de dióxido de carbono.</li>
	<li>Após 3 dias, verifique as células sob o microscópio para verificar um bom crescimento próximo aos detritos teciduais. Uma vez que 1.000 células são visíveis sob o microscópio, remova cuidadosamente os detritos teciduais com pinças autoclavadas, e mude o meio. NOTA: A placa não deve ser perturbada; se o número necessário de células não for observado, coloque o prato de cultura celular de volta na incubadora por mais 2 dias.</li>
	<li>Quando as células são 70% confluentes (2,5 × 10 5 ), experimento edepoistransferem-nas para um prato de cultura tecidual de 75 mm.</li>
</ol>3. Análise da identidade celular e morfologia
NOTA: A coloração da imunofluorescência foi utilizada para estudar morfologia celular e contaminação de células endoteliais.
<ol><li>Limpe o capô com 70% v/v/ etanol. Coloque tampas estéreis (22 mm x 22 mm) em placas de 6 poços. NOTA: Para esterilizar as tampas, lave-as com 70% de etanol e mantenha-as no capô durante a noite sob luz ultravioleta.</li>
	<li>Sementes 100.000 células por poço em uma placa de 6 poços. Depois de 24 horas, lave as células duas vezes em 1x PBS, e fixe-as em 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 minutos. Lave as células novamente duas vezes com 1x PBS. NOTA: Neste ponto, as células poderiam ser mantidas em PBS a 4 °C até o início do procedimento de coloração.</li>
	<li>Para verificar a pureza dos VICs, utilize actina muscular alfa-lisa (αSMA), vimentina e cluster de diferenciação 31 (CD31) para detectar contaminação com VECs.</li>
	<li>Prepare uma alíquota de tampão de bloqueio misturando 500 μL de soro normal (a mesma espécie do anticorpo secundário), 9,5 mL de 1x PBS e 30 μL de Triton X-100. Incubar as células em 2 mL do tampão de bloqueio por 1 h.</li>
	<li>Prepare o tampão de diluição de anticorpos contendo 30 μL de Triton X-100, 10 mL de 1x PBS e 0,1 g de albumina de soro bovino (BSA).</li>
	<li>Pegue uma caixa de pontas vazia, encha metade da caixa com água para criar uma câmara úmida. Cubra o suporte da ponta com um tecido molhado e, em seguida, com uma folha de parafilm.</li>
	<li>Pegue 1 μL do anticorpo primário e misture-o com 100 μL do tampão de diluição preparado na etapa 3.5. Coloque 50 μL do anticorpo diluído no parafilme. Pegue as tampas dos poços, vire-as e coloque-as no topo das gotas de anticorpo; incubar as células durante a noite com o anticorpo.</li>
	<li>Adicione 1 mL de PBS na placa de 6 poços. Retire cuidadosamente o deslizamento do parafilme, vire-o e coloque-o no poço. Lave as células com uma agitação suave contínua por 5 minutos. Substitua o PBS por PBS fresco; lavar as células 3 vezes.</li>
	<li>Incubar as células com o anticorpo secundário diluído (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) por 1h. Adicione 1 μL do anticorpo secundário a 500 μL do tampão de diluição de anticorpos (preparado na etapa 3.5). Cubra a placa com papel alumínio. Lave as células 3 vezes com 1 mL de 1x PBS com agitação contínua.</li>
	<li>Monte as tampas com 50 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI)-montagem média, e observe as células sob o microscópio para analisar a morfologia das células e contaminação do VEC.</li>
</ol>4. Ensaio de calcificação in vitro
<ol><li>Limpe o capô com 70% de etanol, aqueça o médio DMEM a 37 °C.</li>
	<li>Semente 100.000 células/condição em placas de 6 poços em DMEM completo, e cultura por 24 h a 37 °C.</li>
	<li>Prepare o meio calcificante misturando 2 mM de NaH2PO4, insulina de 10-7 M e 50 μg/mL ácido ascórbico em DMEM com 5% de FBS. Para 93 mL de DMEM, adicione 5 mL de FBS, 1 mL de antibióticos (concentração final 1%), 1 mL de piruvato de sódio (100 mM), 27,5 mgs de NaH2PO4, 5,8 μL de insulina e 5 mg de ácido ascórbico. NOTA: Filtre a solução usando um filtro de 0,22 μm antes de usar.</li>
	<li>Após 24 horas, substitua o meio supernante pelo meio calcificador. Incubar as células por 7 dias a 37 °C. No3º dia, substitua por meio calcificador fresco, e coloque a placa de volta na incubadora para completar os 7 dias de tratamento.</li>
	<li>Após 7 dias, remova o meio e lave as células duas vezes com 2 mL de 1x PBS. Incubar as células em 1 mL de ácido clorídrico de 0,6 N (HCl) por 24 h a 37 °C. Colete o HCl em um tubo de 1,5 mL e evapore-o em um evaporador rotativo. Suspenda o conteúdo de todos os tubos em 60 μL de HCL. NOTA: O procedimento de secagem é importante para concentrar a solução e ter o mesmo volume para cada condição.</li>
	<li>Use uma placa de 96 poços para medir a concentração de cálcio usando reagente Arsenazo III, disponível em um kit pronto para uso (consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes).</li>
	<li>Prepare uma solução padrão de cálcio de concentração de 10 mg/dL. Pesar 10 mg de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) e dissolver em 100 mL de água destilada.</li>
	<li>Em uma placa clara de 96 poços, pipet 2 μL de solução em branco (HCl, 0,6 N), a solução padrão, a amostra por poço (10 mg/dL) e as amostras. Realize o experimento em triplicado para verificar a variabilidade da pipetação. Adicione 200 μL do reagente para cada condição. NOTA: As amostras acima de 15 mg/dL devem ser diluídas 1:1 com soro fisiológico, re-ensaio, e o resultado multiplicado por dois.</li>
	<li>Incubar a reação por 15 minutos em temperatura ambiente. NOTA: A reação é estável por 60 min.</li>
	<li>Leia e grave a absorvância da placa a 650 nm. Use a seguinte fórmula para calcular a quantidade de cálcio nas amostras: Cálcio (mg/mL) = (Absorvância de amostra/absorvância de padrão) × Concentração de padrão</li>
</ol>

<ol><li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+disease+in+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li>
<li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li>
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<li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures%3A+Incidence%2C+sources%2C+effects%2C+detection%2C+elimination%2C+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li>
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<li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA%2FROCK-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li>
<li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+valve+disease%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li>
<li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenazo+III%3A+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Chemistry+and+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li>
<li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Valve+Disease%22%5BJournal%5D)">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li>
</ol>

Este artigo apresenta um protocolo detalhado do isolamento celular da válvula do rato para a cultura primária. Três válvulas aórticas de camundongos de 8 semanas foram agrupadas para obter um número adequado de células. Além disso, este protocolo descreve a caracterização do fenótipo VIC e o ensaio de mineralização in vitro. O método foi adaptado do protocolo descrito anteriormente por Mathieu et al.7.
Durante o isolamento das válvulas aórticas, deve-...

A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD) é a doença cardíaca valvular mais prevalente nas populações ocidentais, afetando quase 2,5% dos idosos com mais de 65 anos de idade1. Cavd afeta mais de seis milhões de americanos e está associado a mudanças nas propriedades mecânicas dos folhetos que prejudicam o fluxo sanguíneo normal1,2. Atualmente, não há tratamento farmacológico para impedir a progressão da doença ou ativar a regressão mineral. A única terapia eficaz para tratar cavd é a substituição da válvula aórtica por cirurgia ou substituição da válvula aórtica transcateter3. Por isso, é imprescindível investigar os mecanismos moleculares que levam à mineralização da válvula para identificar novos alvos farmacológicos. De fato, a estenose aórtica não tratada tem várias consequências adversas, como disfunção ventrículo esquerda e insuficiência cardíaca4.
A válvula aórtica consiste em três camadas conhecidas como fibrosa, esponiosa e ventricular, que contêm VICs como a célula predominante tipo5. A fibrosa e a ventricular são cobertas por uma camada de células endoteliais vasculares (VECs)5. Os VECs regulam a permeabilidade das células inflamatórias, bem como os sinais paracrinos. O aumento do estresse mecânico pode afetar a integridade dos VECs e perturbar a homeostase da válvula aórtica, levando à invasão celular inflamatória6. As análises de microscopia eletrônica de varredura mostraram endotélio interrompido em uma válvula aórtica calcificada humana7. 
Análises histológicas do tecido calcificado revelam a presença de osteoblastos e osteoclartos. Além disso, observou-se diferenciação osteogênica dos VICs tanto in vitro quanto no tecido da válvula humana8. Este processo é orquestrado principalmente pelo fator de transcrição relacionado ao Runt 2 (Runx2) e pelas proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs)8,9.

<table><tbody><tr><td>Tesoura de ponta de 3 mm</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de actina de músculo liso anti-alfa</td><td>abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488</td><td>conjugado Sinalização celular</td><td>4412</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de reagentes Arsenazo-III</td><td>POINT SCIENTIFIC</td><td>C7529-500</td><td>um kit para medir a concentração de cálcio</td></tr><tr><td>Bonn Tesoura</td><td>FST</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de cálcio</td><td>SIGMA -Aldrich 31219</td><td>31219</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Novusbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase tipo I&nbsp; (125 unidades/mg)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Tthermofisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Pinça graefe extra fina</td><td>F.S.T</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco 16000044</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>F.S.T Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solução</td><td>STEMCELLS TECNOLOGIAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 100x</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>Mycozap</td><td>Lanza</td><td>VZA-2011</td><td>Reagente de eliminação de micoplasma</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penecilina estreptomicina 100x</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate 100 mM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>11360070</tr><tr><td>Pinça padrão padrão</td><td>&nbsp; FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica - Sharp-Blunt</td><td>FST</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,05%</td> <td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>abcam</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

A calcificação das células válvulas aórticas é a marca registrada da estenose aórtica e está associada à fibrose da cúmlica da válvula. As células intersticiais da válvula (VICs) desempenham um papel importante no processo de calcificação na estenose aórtica através da ativação de seu programa de desdiferente para células semelhantes a osteoblastos. Os VICs do mouse são uma boa ferramenta in vitro para a elucidação das vias de sinalização que conduzem a mineralização da célula da válvula aórtica. O método aqui descrito, utilizado com sucesso por esses autores, explica como obter células recém-isoladas. Foi realizado um procedimento de colagem em duas etapas com 1 mg/mL e 4,5 mg/mL. O primeiro passo é crucial para remover a camada celular endotelial e evitar qualquer contaminação. A segunda incubação de colagem é facilitar a migração de VICs do tecido para a placa. Além disso, discute-se um procedimento de coloração de imunofluorescência para a caracterização do fenótipo das células da válvula isolada do rato. Além disso, o ensaio de calcificação foi realizado in vitro utilizando-se o procedimento de medição do reagente de cálcio e a coloração vermelha de alizarina. O uso da cultura primária da célula de válvula de camundongos é essencial para testar novos alvos farmacológicos para inibir a mineralização celular in vitro.

Como as válvulas aórticas murinas têm tipicamente 1 mm de diâmetro, pelo menos três válvulas devem ser agrupadas para coletar um milhão de células viáveis para diferentes procedimentos experimentais. As diferentes etapas do processo de isolamento VIC são mostradas na Figura 1 e Figura 2. Como é difícil raspar manualmente o tecido da válvula, é preferível usar o estresse de tesoura criado por vórtice para remover os VECs. De fato, os resultados da coloração da im...

Este artigo descreve o isolamento das células da válvula aórtica do rato por um procedimento de colagem de duas etapas. Células de válvulas isoladas do rato são importantes para a realização de diferentes ensaios, como este ensaio de calcificação in vitro, e para investigar as vias moleculares que levam à mineralização da válvula aórtica.

Isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

O uso de células válvulas isoladas de camundongos é essencial para investigar a via de sinalização que leva à calcificação da válvula no uso de células geneticamente modificadas de camundongos transgênicos. A digestão em duas etapas é um método rápido e eficiente. A parte mais desafiadora deste protocolo é o isolamento da válvula aórtica de oito semanas de ratos.É melhor praticar em ratos mais velhos para visualizar melhor a válvula aórtica. Antes de iniciar o experimento, limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e espaço de trabalho com 70% de etanol e autoclave os instrumentos cirúrgicos por 30 minutos. Quando a configuração inicial estiver pronta, comece com a limpeza do peito e da região do abdômen de um rato eutanizado de oito semanas usando etanol.Usando uma tesoura, abra o abdômen e o peito do rato, depois corte entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo com uma pequena tesoura cirúrgica. Remova o sangue do coração perfundiando 10 mililitros de PBS frio e corte o coração, mantendo três milímetros da aorta ascendente. Sob um estereótipo, disseca a válvula aórtica cortando o coração horizontalmente no meio dos ventrículos e cortando o ventrículo esquerdo em direção à aorta, em seguida, dissecar cuidadosamente a válvula aórtica.Misture as válvulas em um pequeno prato de cultura de tecido de 35 milímetros. Lave as válvulas isoladas em um prato de cultura de células de 75 mililitros com cinco mililitros de HEPES frios recém-preparados de 10 mililitros complementados com antibióticos e incubar em cinco mililitros de colagenase tipo um por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação contínua. Após a incubação, centrifugar o tubo por cinco minutos, a 150 vezes G e lavar a pelota uma vez com dois mililitros de 10 mililitros HEPES com vórtice em alta velocidade por 30 segundos.Colete a suspensão resultante do tubo em um prato de cultura de 35 milímetros e use pinças finas para transferir cuidadosamente os fragmentos de tecido para um tubo fresco. Em seguida, incubar a pelota em um tubo de 15 mililitros com cinco mililitros de colagenase tipo um a 37 graus Celsius sob agitação contínua por 35 minutos. Separe as células reutilizando com uma pipeta de um mililitro e centrífuga a 150 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Limpe as células duas vezes, reutilizando a pelota separada em dois mililitros de DMEM completos e centrifugando a 150 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Para chapeamento, resuspengue a pelota em um mililitro de meio completo e adicione-a a um poço de um prato de cultura de seis poços em uma quantidade mínima de meio. Mantenha as placas intactas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Após três dias de incubação, confirme o crescimento próximo aos detritos teciduais observando as células sob o microscópio. Uma vez que 1.000 células são visíveis, remova cuidadosamente os detritos teciduais com pinças autoclavadas e mude o meio. Trypsinize as células depois de atingir 70% de confluência e transfira-as para um prato de cultura de tecido de 75 mililitros.Antes de iniciar o ensaio, limpe o capô de biossegurança com 70% de etanol e aqueça o MMEM médio a 37 graus Celsius. Em seguida, sementes 100.000 células por condição em seis placas de poço em DMEM completo e cultura a 37 graus Celsius. Após 24 horas, substitua o meio supernante pelo meio calcificador e incuba as células por sete dias a 37 graus Celsius, substituindo o meio no terceiro dia.Após sete dias, meça a concentração de cálcio em uma placa de 96 poços usando o reagente Arsenazo III e registrando a absorvância em 650 nanômetros. Na análise representativa, vários fenótipos de células válvulas foram identificados com coloração imunofluorescente após três a cinco dias de cultura. Mouse VIC expressou vimentina e Alpha SMA, os marcadores significativos das células válvulas.Além disso, a coloração imunofluorescente CD31 não verificou contaminação de células endoteliais na cultura VIC. Vic's de culturing com meio calcificador rico em fosfato estimulam uma calcificação nas células, ainda confirmada com a coloração positiva vermelha para nódulos de cálcio. O protocolo é baseado em um pool de três a cinco válvulas de diferentes ratos.O uso de erva-ninhada e três diferentes réplicas biológicas é importante para validar os achados. O uso de células válvulas de camundongos é vital para entender o caminho molecular que leva à estenose aórtica isolando células de camundongos transgênicos. Este protocolo tem sido usado anteriormente para investigar a implicação do caminho para o receptor na regressão mineral da válvula aórtica calcificada.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós fornecemos um método para isolar e populações de cultura pura de células endoteliais válvula cardíaca (VEC). VEC pode ser isolado de ambos os lados da cúspide ou folheto e imediatamente a seguir, a célula intersticial subjacente isolamento (VIC) é simples.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células intersticiais da válvula aórtica do coração de um camundongo adulto usando um procedimento de colagenase em duas etapas e sua subsequente cultura em meio de crescimento de baixo volume.

Isolamento de células intersticiais da válvula de camundongo: um método enzimático para isolar e cultivar VICs da válvula aórtica de camundongo

Este vídeo demonstra uma técnica de ensaio para avaliar a calcificação das células intersticiais da válvula aórtica in vitro. O ensaio ajuda a quantificar a concentração de cálcio usando o reagente arsenazo III, um corante sensível ao cálcio que reage com íons de cálcio para formar um complexo cálcio-arsenazo de cor roxa.

Ensaio de calcificação para medir a concentração de cálcio em células intersticiais da válvula aórtica

A capacidade de isolar células endoteliais da válvula cardíaca (VECs) é fundamental para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento, manutenção e doença da válvula.  Aqui descrevemos o isolamento de VECs de camundongos Tie2-GFP embrionários e adultos usando FACS que permitirá estudos determinando a contribuição de VECs em processos de desenvolvimento e doença.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

A calcificação vascular é um importante preditor e contribuinte para doenças cardiovasculares humanas. Este protocolo descreve métodos para induzir calcificação de células musculares lisas vasculares primárias cultivadas e para quantificar a calcificação e a carga de macrófagos em aortas de animais usando imagens de fluorescência no infravermelho próximo.

Calcificação das células do músculo vascular liso e de imagem da aorta calcificação e inflamação

Este protocolo descreve o isolamento, cultura e calcificação de células intersticiais do rato-derivado da válvula, um modelo altamente fisiológica em vitro da doença valvar aórtica calcífica (CAVD). Exploração deste modelo de rato facilita a pesquisa CAVD em explorar a célula e os mecanismos moleculares que estão subjacentes a este complexo processo patológico.

Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Neste estudo, descrevemos o processo de isolamento de linfócitos T a partir de amostras frescas de válvulas aórticas calcificadas e as etapas analíticas da clonagem de células T para a caracterização dos subconjuntos leucócitos adaptativos usando a análise de citometria de fluxo.

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Este protocolo descreve a coleta de valvas aórticas humanas extraídas durante procedimentos cirúrgicos de substituição valvar aórtica ou de tecido cadavérico e o subsequente isolamento, expansão e caracterização de células endoteliais e intersticiais valvares primárias específicas do paciente. Estão incluídos detalhes importantes sobre os processos necessários para garantir a viabilidade celular e a especificidade do fenótipo.

Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

Este trabalho apresenta a metodologia para obtenção e avaliação da calcificação vascular pelo isolamento de aortas murinas seguidas da extração de vesículas extracelulares calcificadas para observação do potencial de mineralização.

Análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo

Aprenda o isolamento de células de válvula aórtica de rato usando digestão com colagenase em duas etapas. Este método viabiliza estudos in vitro sobre calcificação valvar e vias moleculares em estenose aórtica.

Isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro

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