Análise em todo o genoma da distribuição de modificações de histona usando o Método de Sequenciamento de Imunoprecipitação de Chromatina em Magnaporthe oryzae

Este método pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à regulação dos genes alvo candidatos através de modificações epigenéticas durante a patogênese fúngica na patologia vegetal. A tecnologia de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina pode detectar eficientemente segmentos de DNA que interagem com histones e fatores de transcrição em todo o genoma. Em comparação com outros métodos, pode melhorar a eficiência e a resolução.

Comece adicionando 100 microliters de meio líquido completo às placas de agger de tomate de aveia usando uma pipeta de 100 microliteres. Usando um laço de inoculação, raspe a micélia da cepa do tipo selvagem e a tensão do nocaute. Pegue os detritos de micélia e transfira-os para 250 mililitros de meio líquido completo.

Lave a hifa fúngica com 500 mililitros de 0,7 solução de cloreto de sódio molar. Então pegue o myceliUM fúngico e pese-o. Adicione aproximadamente um mililitro de solução de permeação de enzima de lise por um grama do micélio fúngico.

Coloque a hifa para corte a 28 graus Celsius por três a quatro horas com agitação a 150 RPM. Lave a hifalica com 50 mililitros de 0,7 solução de cloreto de sódio molar. Centrifugar a amostra e descartar cuidadosamente o sobrenante.

Suspenda o protoplasto em 20 mililitros de 0,7 solução de cloreto de sódio molar. Adicione 55 microliters de 37% de formaldeído gota a gota a dois mililitros de tampão de cloreto de sódio contendo protoplastos para ligação cruzada até que a concentração final seja de 1%Para saciar o formaldeído não redigido, adicione 20 microliters de 10 vezes a glicina a cada tubo. Descarte o supernatante cuidadosamente após a centrifugação.

Suspenda a pelota em um mililitro de 0,7 solução de cloreto de sódio molar. Descarte o supernatante cuidadosamente após a centrifugação e suspenda a pelota em 750 microliters de buffer RIPA. Adicione 37,5 microliters de 20 vezes o inibidor de protease.

Cisalhamento a cromatina por sônica por oito minutos usando um homogeneizador ultrassônico. Depois que a amostra for quebrada ultrasonicamente, tire uma parte da amostra como entrada contendo todo o DNA e proteína liberados após a amostra ser sônica. Para analisar o comprimento dos fragmentos de DNA, execute uma eletroforese de gel de 1%agarose após a sônica.

Após a centrifugação, transfira o supernatante centrifuado para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e armazene-o a 80 graus Celsius negativos para uso posterior. Antes de realizar o experimento IP, dilua cada amostra de cromatina para uma razão de 1 a 10 com um buffer RIPA de uma vez. Pipeta 50 microliters de contas de proteína super paramagnética em um tubo de centrífuga de dois mililitros.

Coloque os tubos em um suporte magnético e deixe as contas magnéticas precipitarem. Em seguida, remova o supernatante. Adicione um mililitro de tampão pré-resfriado uma vez RIPA ao tubo e lave contas de proteína super paramagnética três vezes.

Coloque os tubos em um suporte magnético e remova o sobrenatante. Adicione 100 microliters de um tampão RIPA de uma vez a cada tubo. Adicione 30 microliters da amostra de cromatina, 100 microliters de contas de proteína super paramagnética e quatro microliters de anticorpoS H3K4me3 ao tubo, misturando-os bem.

Coloque as amostras em um agitador rotativo para incuba-las durante a noite a quatro graus Celsius a 30 vezes G.Lave o anticorpo de contas de proteína super paramagnética e o complexo de cromatina, reutilizando as contas em um mililitro de um tampão RIPA de uma vez. Lave a amostra com um mililitro de tampão de lavagem complexo imunológico de baixo sal, em seguida, com um mililitro de tampão de lavagem complexo imunológico de sal alto. Enxágüe as contas com um mililitro de tampão de cloreto de lítio e remova o sobrenatante.

Em seguida, adicione um mililitro de tampão de TE ao tubo. Coloque o tubo novamente com um mililitro de tampão de TE e remova o supernatante com uma pipeta. Adicione 100 microliters de tampão de eluição a cada tubo de centrífuga.

Realize a elução a 65 graus Celsius por 15 minutos. Centrifugar por um minuto a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius e coletar o supernatante em novos tubos de centrífuga. Adicione oito microliters de cinco cloreto de sódio molar a todos os tubos e incubar a 65 graus Celsius por quatro a cinco horas ou durante a noite para reverter as ligações cruzadas da proteína do DNA.

Adicione um microliter de Rnase A e incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius. Adicione quatro microliters de proteinase K em cada tubo e incubar a 45 graus Celsius por uma a duas horas. Adicione 550 microliters do clorofórmio fenal e mistura de álcool isoamílico ao tubo centrífuga.

Centrifugar por 15 minutos a 10.000 vezes G e aspirar o supernante. Adicione 1/10 de volume de três soluçãos de acetato de sódio molar, 2,5 volumes de etanol absoluto e três microliters de glicogênio ao tubo. Coloque a amostra em uma geladeira a 20 graus Celsius negativo durante a noite para precipitação.

No dia seguinte, centrifufique os tubos e descarte o supernatante. Lave a pelota três vezes com um mililitro de etanol recém-preparado 75% a 10.000 vezes G.Adicione 50 microliters de água deionizada estéril para dissolver suficientemente o precipitado. Reparar as extremidades de DNA para gerar DNA sem cortes usando um kit de reparação final de DNA, e instruções mencionadas no manuscrito do texto.

Para adicionar base de adenina às três extremidades primos, adicione 30 microliters de DNA, dois microliters de água, cinco microliters de 10 vezes tampão Taq, 10 microliters de um dATP mililitro e três microliters de polimerase de DNA Taq a um tubo de centrífugo PCR de 0,2 microliter. Misture-os e reaja em uma máquina PCR a 72 graus Celsius por 10 minutos. Realize a ligadura de linker misturando 10 microliters de DNA, 9,9 microliters de água, 2,5 microliters de tampão de ligase de DNA T4, 0,1 microliter de mistura de oligo adaptador e 2,5 microliters de ligase de DNA T4 em um tubo de centrífugo PCR 0,2 microliter.

Incubar o tubo a 16 graus Celsius por quatro horas. Para amplificar o DNA usando primers PCR, adicione 10,5 microlitros de DNA, 12,5 microlitros de duas vezes a mistura mestre de fidelidade. um microliter de primer PCR PE 1.0 e um microliter de primer PCR PE 2.0 a um tubo de centrífugas PCR de 0,2 microliter e misturar bem.

Os sinais H3K4me3 dos mutantes de eliminação de mobre2, mospp1 e moswd2 foram significativamente diminuídos em suas regiões-alvo funcionais. Em comparação com a cepa do tipo selvagem P131, os sinais de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina H3K4me3 enriquecido foram largamente diminuídos. Após este procedimento, chip no chip e chip qPCR pode ser realizado.

Eles são geralmente usados para testar o gene alvo a jusante de uma proteína e estudar interações de DNA de proteína em locais conhecidos de ligação de genoma.