Name: Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprenda a preparar homogeneizados de músculo esquelético de rato para medições precisas de nitrato e nitrito. Este protocolo compara três métodos de homogeneização e preserva os íons durante o processamento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pela concessão intramural do NIH/NIDDK ZIA DK 0251041-14 a Alan N Schechter, MD.

O protocolo animal foi aprovado pelo NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Os animais foram manuseados e tratados de acordo com o atual Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, disponível gratuitamente no site da AAALAC.
1. Coleção muscular esquelética de ratos
<ol><li>Enquanto um rato está sob anestesia profunda (isoflurano a 5%, confirmado pela reação ausente ao aperto da cauda / perna), inicie a perfusão com solução salina contendo heparina colocando uma agulha 19 G em um ápice do ventrículo esquerdo e fazendo um corte no átrio direito. Permita que a solução salina com heparina penetre através dos órgãos internos até que pelo menos 1,5 litro / kg tenha fluído através do tecido. Neste ponto, os animais estão mortos por exsanguinação e as carcaças estão prontas para serem processadas para coleta de amostras. NOTA: Alcançar uma boa perfusão é fundamental, especialmente para medições precisas de nitrito, porque o nitrito é oxidado em nitrato por qualquer hemoglobina restante.</li>
	<li>Identificar os tecidos musculares alvo e retirá-los das patas traseiras22 usando instrumentos cirúrgicos limpos. Remova o máximo de gordura e tecidos conjuntivos dos tecidos musculares quanto possível.</li>
	<li>Coloque a quantidade desejada de músculo em um tubo de microcentrífuga e, em seguida, coloque no gelo seco. Conservar os tubos cheios de tecido no congelador a -80 °C. NOTA: No caso de amostras de biópsia humana, apague-as completamente imediatamente após a coleta com gaze limpa para remover o excesso de sangue.</li>
</ol>2. Preparação para homogeneização
<ol><li>Preparação de solução que conserva nitritos (solução de paragem)<ol><li>Preparar uma solução amarela límpida contendo 890 mM de ferricianeto de potássio (K3Fe(CN)6) e 118 mM de NEM (N-etilmaleimida) em água destilada, garantindo a ausência de cristais. Adicione o tensoativo não iônico (detergente) na proporção de 1:9 (v/v, Tabela de Materiais) e misture suavemente para evitar a formação de espuma.</li>
		<li>Diluir a solução de paragem na proporção de 1:9 com água destilada. Colocar a solução de paragem diluída (proporção de 1:5 de tecido muscular para solução de paragem diluída) no tubo de homogeneização. NOTA: Vinte miligramas de tecido exigirão 100 μL de solução de parada e 200 mg de tecido exigirão 1000 μL de solução de parada no tubo. A presença de detergente em solução adicionada é fundamental para a ruptura das membranas celulares. Qualquer detergente não iônico pode ser usado, mas deve-se tomar cuidado para verificar se ele não interfere com o método de quimioluminescência.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de tecidos<ol><li>Retire o tecido do congelador a -80 °C e descongele lentamente no gelo. Remova a gordura restante e o tecido conjuntivo do músculo esquelético. Corte pedaços de músculo esquelético e borre na gaze para secar.</li>
		<li>Pese a quantidade de tecido (20, 50 e 200 mg). Coloque o músculo esquelético pré-pesado na solução de parada nos tubos de homogeneização ou coloque o tecido pré-pesado em um tubo de microcentrífuga limpo para uso posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Homogeneização
<ol><li>Homogeneizador rotativo (Figura 1)<ol><li>Coloque na máquina o tubo do tipo M que contém o músculo esquelético pré-pesado e a solução de paragem pré-medida. Homogeneizar cada amostra duas vezes (colocando no ciclo de homogeneização mais destrutivo) e colocar o tubo no gelo imediatamente após cada homogeneização por 5 minutos para esfriar.</li>
		<li>Centrifugar brevemente a 2.000 × g e 4 °C durante 5 min. Coloque o tubo cheio de volta no gelo e adicione o volume apropriado de metanol (≥ 99,9%, 10x do peso do tecido). Vórtice completamente por 15 s. NOTA: Para 20 mg de tecido, use 200 μL de metanol. O metanol é usado para precipitar proteínas do homogeneizado tecidual e não interfere com o método de quimioluminescência. Se for utilizado outro método de precipitação de proteínas, testar a sua compatibilidade com a quimioluminescência.</li>
		<li>Homogeneize mais uma vez e incube no gelo por 30 min. Centrifugar as amostras durante 35 minutos a 4 °C e 3 500 × g. Aspirar o sobrenadante e medir os níveis de nitrito/nitrato ou conservar a -80 °C para utilização posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneizador de esferas (Figura 2)<ol><li>Colocar o tecido muscular esquelético num tubo contendo grânulos (proporção de 1:5 para tecido:solução de paragem diluída) e homogeneizar duas vezes durante 45 s à velocidade mais elevada disponível no instrumento utilizado. Coloque o tubo no gelo imediatamente após cada homogeneização por 5 minutos para esfriar.</li>
		<li>Centrífuga brevemente usando uma pequena centrífuga de desktop (2.000 x g) por 5 seg. Coloque o tubo de volta no gelo e adicione um volume apropriado de metanol (pureza ≥ 99,9%, 10x do peso do tecido). Vórtice completamente por 15 s. NOTA 1: Para 20 mg de tecido, use 200 μL de metanol. NOTA 2: O metanol é usado para precipitar proteínas do homogeneizado tecidual e não interfere com o método de quimioluminescência. Se for utilizado outro método de precipitação de proteínas, testar a sua compatibilidade com a quimioluminescência.</li>
		<li>Homogeneizar mais uma vez por 45 s na velocidade mais alta disponível no instrumento utilizado. Incubar no gelo por 30 min. Centrífuga a 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirar o sobrenadante e medir os níveis de nitrito/nitrato ou conservar a -80 °C para utilização posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulverizador (Figura 3)<ol><li>Preparar tubos contendo solução de parada diluída (5x do peso do tecido) e pesá-los. Registar o peso (tubo + solução de paragem).</li>
		<li>Coloque a ferramenta pulverizadora de nitrogênio líquido no gelo seco e aguarde aproximadamente 30 minutos para que ela atinja a temperatura desejada.</li>
		<li>Usando pinças resfriadas em nitrogênio líquido, transfira uma amostra (peso do tecido já medido) para o pulverizador. Adicione uma pequena colher de nitrogênio líquido para garantir que o tecido esteja à temperatura do nitrogênio líquido.</li>
		<li>Depois que 95% do nitrogênio líquido tiver vaporizado, coloque a ferramenta de esmagamento em cima do tecido e pressione firmemente. Você deve sentir o esmagamento da amostra. Usando o martelo, bata na ferramenta de esmagamento 3-5x.</li>
		<li>Verifique a amostra para quaisquer pedaços restantes usando uma colher resfriada em nitrogênio líquido. Depois de resfriar em nitrogênio líquido, use um pedaço de papel de seda para limpar qualquer água congelada antes de tocar no tecido. Se um pedaço estiver presente, mova-o para o centro e, em seguida, ataque mais 5-6 vezes com o martelo.</li>
		<li>Quando toda a amostra tiver sido pulverizada, utilizar a colher de azoto líquido refrigerada para transferir directamente o tecido triturado para o tubo pré-pesado que contém a solução de paragem diluída (passo 3.3.1). Certifique-se de realizar esta etapa rapidamente, pois quando o músculo esquelético esmagado aquece, fica pegajoso e difícil de transferir.</li>
		<li>Vórtice por 15 s. Verifique se nenhum tecido está preso na parte superior do tubo, abrindo o tubo. Se houver, tente desalojá-lo e, em seguida, vórtice novamente.</li>
		<li>Centrifugar a amostra por 2-3 s usando uma pequena centrífuga de desktop. Pese o tubo novamente. Calcular o peso do tecido deduzindo o peso original do tubo (passo 3.3.1) deste novo peso. Coloque o tubo no gelo. NOTA: Os pesos exatos ajudarão a determinar o peso exato do tecido e quanto tecido foi perdido durante a pulverização.</li>
		<li>Uma vez que todas as amostras tenham sido processadas até ao passo 3.3.8, adicionar um volume adequado de metanol (≥ 99,9 %, 10x do peso tecidual). Vórtice completamente por 15 s e incube no gelo por 30 min. NOTA: Para 20 mg de tecido, use 200 μL de metanol. O metanol é usado para precipitar proteínas do homogeneizado tecidual e não interfere com o método de quimioluminescência. Se for utilizado outro método de precipitação de proteínas, testar a sua compatibilidade com a quimioluminescência.</li>
		<li>Centrífuga a 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirar o sobrenadante e medir os teores de nitrito/nitrato ou conservar a -80 °C para utilização posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Medição de nitrito/nitrato com analisador de óxido nítrico (NOA)
<ol><li>Preparar todas as amostras por um dos três métodos de homogeneização diferentes descritos acima e injetá-las em um NOA para medição de nitrato e nitrito. NOTA: Protocolos detalhados para uso da NOA foram publicados anteriormente19.</li>
</ol>

<ol><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system%3A+a+historical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).</li>
<li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-arginine-nitric+oxide+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li>
<li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li>
<li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li>
<li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomach+NO+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502(1994).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans%3A+measurements+in+expelled+air%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li>
<li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li>
<li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans%3A+role+for+nitrite-derived+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li>
<li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).</li>
<li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li>
<li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+nitrate+store%3A+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li>
<li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Nitrite+and+Nitrate%2C+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway%2C+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879(2016).</li>
<li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li>
<li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li>
<li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li>
<li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA%28y%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter conflitos de interesse. Alan N. Schechter está listado como co-inventor em várias patentes emitidas para os Institutos Nacionais de Saúde para o uso de sais de nitrito para o tratamento de doenças cardiovasculares. Ele recebe royalties com base no licenciamento do NIH dessas patentes para desenvolvimento clínico, mas nenhuma outra compensação. Esses arranjos não afetam sua adesão às políticas do periódico JoVE.

Para monitorar as mudanças nos metabólitos do NO, nitrato e nitrito, em função de intervenções fisiológicas, é imperativo medir os níveis desses íons nos diferentes órgãos que são críticos em seu metabolismo. Como a hemoglobina no sangue reagirá com o NO e seus metabólitos, também é importante remover o sangue rapidamente das amostras de tecido, tanto quanto possível. Assim, os animais foram perfundidos com solução salina antes de coletar tecidos musculares esqueléticos (glúteos, TA, EDL, músculo gastrocnêmio), e o tecid...

O óxido nítrico (NO), uma pequena molécula sinalizadora gasosa, desempenha um papel crítico nos processos fisiológicos e fisiopatológicos1. O NO pode ser produzido a partir da L-arginina por enzimas endógenas da família da óxido nítrico sintase (NOS) antes de ser submetido à rápida oxidação em nitrato (NO 3-) e, possivelmente, nitrito (NO 2-) no sangue e nos tecidos 2,3. Recentemente, esses ânions demonstraram ser reduzidos de volta ao NO em sistemas de mamíferos4. O nitrato é convertido em nitrito, principalmente por nitrato redutases bacterianas comensais na cavidade oral atuando sobre íons secretados pelas glândulas salivares e ingeridos diretamente 5 e, em certa medida, por enzimas de mamíferos como a xantina oxidorredutase 6,7. O nitrito pode ser ainda reduzido a NO por vários mecanismos, incluindo desoxihemoglobina8, desoximioglobina9, enzimas contendo molibdênio 10 e redução não enzimática na presença de prótons11,12.
Esta via nitrato-nitrito-NO é reforçada em condições hipóxicas, em que a atividade da NOS é diminuída porque a NOS requer oxigénio para a geração NO4. Muitos estudos recentes têm relatado efeitos benéficos do nitrato dietético na regulação da pressão arterial e no desempenho do exercício, sugerindo que as vias de redução do nitrato contribuem para o aumento da sinalização do NO13,14,15. Estudos anteriores mostraram que alguns músculos esqueléticos são provavelmente os principais locais de armazenamento de nitrato no corpo16. Em comparação com o sangue ou outros órgãos internos, como o fígado, o músculo esquelético (glúteo máximo) contém níveis significativamente mais elevados de nitrato e tem uma massa substancial no corpo dos mamíferos. O exercício em esteira foi mostrado para aumentar a redução de nitrato para nitrito e para NO em glúteos em um modelode rato 7. Esses resultados implicam que alguns músculos esqueléticos podem ser fontes importantes de NO através de vias de redução de nitrato em situações fisiológicas. Estudos mais recentes sugerem que esses achados, incluindo alterações nos níveis de nitrato muscular durante o exercício, também ocorrem em humanos17.
Dois dos autores atuais já haviam estabelecido um método para medir os níveis de nitrato e nitrito no sangue e em outras amostras líquidas18. No entanto, quando os níveis desses ânions em homogeneizados teciduais foram inicialmente analisados, protocolos detalhados não estavam disponíveis. Para entender a dinâmica nitrato-nitrito-NO em vários órgãos diferentes, nosso objetivo foi desenvolver um método preciso e eficiente para medir os níveis de nitrato e nitrito em tecidos de mamíferos, incluindo o músculo esquelético. Em estudos anteriores, tecidos de roedores foram utilizados para desenvolver processos de homogeneização confiáveis e, em seguida, analisar os teores de nitrato e nitrito nesses homogeneizados 7,16,19. O uso desse método de homogeneização foi estendido às amostras de biópsia do músculo esquelético humano, sendo confirmados os valores e, o que é mais importante, os valores observados para o músculo em comparação com o sangue/plasma estavam em faixas e proporções semelhantes às observadas em roedores17. Nos últimos anos, outros grupos também começaram a medir os níveis de nitrato e nitrito em homogeneizados musculares esqueléticos, relatando valores comparáveis aos relatados por nosso grupo20,21.
O objetivo deste trabalho de protocolo é descrever em detalhes a preparação de homogeneizados musculares esqueléticos utilizando três diferentes métodos de homogeneização para posterior medição dos níveis de nitrato e nitrito. Além disso, os efeitos do peso tecidual utilizado para homogeneização sobre os valores de nitrato e nitrito em amostras de músculo esquelético foram examinados. Acreditamos que esses métodos podem ser facilmente aplicados a outros tipos de tecidos de mamíferos. Recentemente, especialmente no campo da fisiologia do exercício, foi dada atenção às possíveis diferenças na fisiologia do nitrato/nitrito/NO de acordo com os grupos musculares. Também relatamos as quantidades de nitrato e nitrito em quatro músculos de roedores diferentes e encontramos uma distribuição não uniforme de ambos os íons entre esses diferentes músculos; uma observação que requer um estudo mais aprofundado.

<table><tbody><tr><td>dissociador gentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>tubo MACS M suave</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td>Comprimento: 87 mm; Diâmetro: 30 mm</td></tr><tr><td>Heparina Sódica</td><td>Hospira</td><td>NDC-0409-7620-13</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>NDC-10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>646377</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de esferas Minilys</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de óxido nítrico</td><td>GE</td><td>Sievers NOA 280i</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonilfenilpolietilenoglicol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianeto de potássio; Kit de lise K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>Precellys</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td>contém tubos de 2 mL com grânulos de cerâmica (óxido de zircônio) de 2,8 mm para homogeneização</td></tr><tr><td>Kit</td><td>Pulverizer Cellcrusher</td> Kit <td></td><td>Cellcrusher</td></tr></tbody></table>

preparação de homogeneizados do músculo esquelético de rato para medições de nitrato e nitrito

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Íons de nitrato (NO3-) já foram pensados para ser produtos finais inertes do metabolismo do óxido nítrico (NO). No entanto, estudos anteriores demonstraram que os íons nitrato podem ser convertidos de volta ao NO em mamíferos através de um mecanismo de redução de duas etapas: o nitrato sendo reduzido a nitrito (NO2-) principalmente por bactérias comensais orais, em seguida, o nitrito sendo reduzido a NO por vários mecanismos, incluindo através de proteínas contendo heme ou molibdênio. Esta via redutora do nitrato contribui para melhorar as vias de sinalização mediadas pelo NO, particularmente no sistema cardiovascular e durante o exercício muscular. Os níveis de nitrato no organismo antes dessa utilização são determinados por duas fontes diferentes: oxidação endógena do NO e ingestão dietética de nitrato, principalmente de plantas. Para elucidar o complexo ciclo do NO em circunstâncias fisiológicas, examinamos ainda mais a dinâmica de seus metabólitos, nitrato e íons nitrito, que são relativamente estáveis em comparação com o NO. Em estudos anteriores, o músculo esquelético foi identificado como um importante órgão de armazenamento de íons nitrato em mamíferos, bem como uma fonte direta de NO durante o exercício. Portanto, estabelecer uma metodologia confiável para medir os níveis de nitrato e nitrito no músculo esquelético é importante e deve ser útil para estender sua aplicação a outras amostras de tecido. Este artigo explica em detalhes a preparação de amostras de músculo esquelético, utilizando três métodos de homogeneização diferentes, para medições de nitrato e nitrito e discute questões importantes relacionadas aos processos de homogeneização, incluindo o tamanho das amostras. As concentrações de nitrato e nitrito também foram comparadas em quatro grupos musculares diferentes.

Para a obtenção de resultados representativos, foram utilizados tecidos musculares esqueléticos de 8 ratos Wistar (machos e fêmeas, peso 250 ± 50 g). Homogeneizados do músculo esquelético de ratos (50 mg de músculo glúteo máximo para cada método) foram preparados por três diferentes ferramentas de homogeneização (homogeneizador rotativo, homogeneizador de esferas e pulverizador). Os teores de nitrato e nitrito desses homogeneizados foram então determinados por meio de um analisador de óxido nítrico (NOA) (<strong class="...

Apresentamos protocolos para três métodos diferentes para a homogeneização de quatro diferentes grupos musculares de tecido muscular esquelético de ratos para medir e comparar os níveis de nitrato e nitrito. Além disso, comparamos diferentes pesos amostrais para investigar se o tamanho da amostra tecidual afeta os resultados da homogeneização.

Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

O músculo esquelético serve como um importante reservatório de nitrato que, após sua conversão em nitrito, serve como fonte de NO durante o exercício. Aqui apresentamos metodologia para medir esses íons no músculo e outros tecidos. Para começar, prepare a solução de preservação ou parada de nitrato combinando 890 milimolares de ferricianeto de potássio e 118 milimolares de n-metilmaleimida em água destilada, garantindo que nenhum cristal permaneça em solução, em seguida, adicione um surfactante não iônico em uma proporção de 1 para 9 e misture suavemente para evitar a formação de espuma.Diluir a solução de paragem numa proporção de 1 para 9 com água destilada e adicionar a solução de paragem diluída ao tubo de homogeneização. Em seguida, descongele o tecido muscular de rato isolado e congelado anterior no gelo. Uma vez que o tecido tenha descongelado, remova a gordura restante e o tecido conjuntivo do músculo esquelético.Corte pedaços do músculo esquelético e seque-os em uma gaze para secar. Pesar a quantidade apropriada de tecido muscular esquelético e, em seguida, colocar o tecido pré-pesado nos tubos de homogeneização que contêm a solução de parada. Para homogeneização em um homogeneizador rotativo, coloque na máquina o tubo do tipo M contendo o músculo esquelético pré-pesado e a solução de parada pré-medida.Homogeneizar cada amostra duas vezes e, após cada homogeneização, colocar o tubo no gelo imediatamente durante 5 minutos para arrefecer. Após a homogeneização, centrifugar o tubo brevemente. Coloque o tubo de volta no gelo e adicione o volume apropriado de metanol antes de vórtice por 15 segundos.Homogeneizar a amostra novamente e incubá-la no gelo por 30 minutos, em seguida, centrifugar a amostra, aspirar o sobrenadante e proceder à medição dos níveis de nitrito e nitrato. Para homogeneização do talão, coloque o tecido muscular esquelético em um tubo contendo contas e homogeneize duas vezes por 45 segundos na velocidade mais alta disponível no instrumento. Após cada homogeneização, coloque imediatamente o tubo no gelo por 5 minutos para esfriar, em seguida, centrifugar o tubo, coloque o tubo de volta no gelo e adicione o volume apropriado de metanol antes de vórtice por 15 segundos.Homogeneizar a amostra mais uma vez por 45 segundos e incubá-la no gelo por 30 minutos. Centrifugar a amostra, aspirar o sobrenadante e proceder à medição dos níveis de nitrito e nitrato. Para homogeneização à base de pulverizador, prepare tubos contendo a solução de parada diluída e, em seguida, pese e registre o peso dos tubos.Depois de resfriar a ferramenta do pulverizador em gelo seco por 30 minutos, usando pinças resfriadas em nitrogênio líquido, transfira a amostra de tecido pré-pesada para o pulverizador e, em seguida, adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido para garantir que o tecido esteja à temperatura do nitrogênio líquido. Depois que 95% do nitrogênio líquido tiver vaporizado, coloque a ferramenta de esmagamento em cima do tecido e pressione firmemente para sentir o esmagamento da amostra, em seguida, usando um martelo, bata na ferramenta de esmagamento 3 a 5 vezes. Quando toda a amostra tiver sido pulverizada, utilizando uma colher e uma pinça resfriadas com azoto líquido, transfira directamente o tecido triturado para o tubo pré-pesado que contém a solução de paragem diluída.Em seguida, vortex o tubo por 15 segundos e, em seguida, abra o tubo para verificar se há algum tecido preso na tampa. Se houver, tente desalojá-lo, então vórtice novamente. Centrifugar brevemente a amostra durante 2 a 3 segundos.Pese o tubo novamente e calcule o peso do tecido deduzindo o peso original do tubo desse novo peso. Coloque o tubo no gelo. Adicionar um volume apropriado de metanol ao tubo e desvitrificar o tubo completamente por 15 segundos antes de incubá-lo no gelo por 30 minutos, depois centrifugar a amostra, aspirar o sobrenadante e proceder à medição dos níveis de nitrito e nitrato.Os níveis de nitrato e homogeneizados do músculo esquelético de ratos preparados usando um homogeneizador rotativo, homogeneizador de contas e pulverizador foram semelhantes. Curiosamente, para os níveis de nitrito, a amostra homogeneizada preparada por um pulverizador apresentou o maior valor, que foi estatisticamente diferente dos outros dois valores amostrais. Uma comparação dos níveis de nitrito e nitrato em homogeneizados glúteos preparados a partir de 20, 50 e 200 miligramas de tecido usando um homogeneizador de contas mostrou que nem os níveis de nitrato nem nitrito foram significativamente diferentes entre os tamanhos das amostras musculares.A comparação dos níveis de nitrato em diferentes tecidos musculares esqueléticos da perna de roedores revelou que o músculo glúteo tinha níveis de nitrato aproximadamente duas vezes maiores do que os outros três tecidos musculares. No entanto, essas diferenças não alcançaram significância estatística. Semelhante aos níveis de nitrato, a concentração de nitrato no músculo glúteo também foi maior do que na dos outros três tecidos musculares e foi significativamente maior do que a da amostra de gastrocnêmio.Nosso método é relativamente simples e adequado para pequenas amostras, preservando nitrato e nitrito durante a preparação da amostra.

preparation-rat-skeletal-muscle-homogenates-for-nitrate-nitrite

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, demonstramos a fabricação de colágeno baseado em construções de tecido contendo os mioblastos esqueléticos. Essas construções 3-D de engenharia podem ser usados ​​para substituir ou reparar...

Fabricação de Miogênica Constrói engenharia de tecidos

Descrevemos а protocolo para o isolamento de puro coração de rato, altamente acoplado mitocôndria para estudos funcionais ou estruturais da bioenergética celular, medições biofísicas, proteômica ou DNA mitocondrial e análise de lipídios.

Preparação de coração de rato altamente acoplado mitocôndrias

Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de...

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Este vídeo demonstra a preparação cirúrgica e os procedimentos necessários para estudar as respostas contráteis da preparação músculo gastrocnêmio medial de...

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

A produção endógena de óxido nítrico (NO) regula uma grande variedade de funções biológicas. Está se tornando cada vez mais claro que a ruptura ou desregulagem de sinalização NO base está envolvida em muitas doenças humanas. Os métodos para quantificar relevante metabólitos podem fornecer novos biomarcadores de diagnóstico ou de prognóstico para a doença humana.

Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

O óxido nítrico (NO) é uma importante molécula de sinalização na homeostase vascular. A produção de NO in vivo é muito baixa para medição direta. A quimioluminescência fornece informações úteis sobre o ciclo de NO por meio da medição de seus precursores e produtos de oxidação, nitrito e nitrato. A determinação de nitrito / nitrato nos tecidos e fluidos do corpo é explicada.

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Aqui, apresentam-se um protocolo para a fibra muscular rápida análises, o que permite melhor qualidade de coloração, e assim aquisição automática e quantificação de populações de fibras utilizando o software ImageJ livremente disponíveis.

Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

A regulação intacta da absorção de glicose muscular é importante para manter a homeostase de glicose corporal inteira. Este protocolo apresenta avaliação da absorção de glicose estimulada pela insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado ao delinear o impacto de várias intervenções fisiológicas em todo o metabolismo da glicose corporal.

Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Aprenda a preparar homogeneizados de músculo esquelético de rato para medições precisas de nitrato e nitrito. Este protocolo compara três métodos de homogeneização e preserva os íons durante o processamento.

Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito

Explorar mais vídeos