Congelamento rápido usando dispositivo de congelamento de sanduíches para boa preservação ultraestrutural de espécimes biológicos em microscopia eletrônica
19 de julho de 2021
Aqui mostramos como usar o dispositivo de congelamento de sanduíches para congelamento rápido de espécimes biológicos, incluindo bactérias, leveduras, células cultivadas, células isoladas, tecidos animais e humanos e vírus. Também mostramos como preparar espécimes para seção ultrathin após congelamento rápido.
Para observar a requintada ultra estrutura natural das células, é necessário fixar as células por congelamento rápido. O congelamento de sanduíches é um dos melhores métodos para congelar células sem formar cristais de gelo. Este protocolo demonstra o uso de dispositivo de congelamento de sanduíches, e também descreve o procedimento para fazer seções ultra finas de espécimes substituídos por congelados após o congelamento do sanduíche.
Comece a preparar propano líquido preenchendo o recipiente de nitrogênio líquido do dispositivo de congelamento do sanduíche ou SFD com nitrogênio líquido. Encha o recipiente de propano líquido com propano líquido introduzindo gás propano usando um bocal fino. Acelere a solidificação do propano usando uma barra de metal resfriada.
Para preparar os discos de cobre do tipo plano e do tipo cesta, coloque-os em um slide de vidro com o lado sem letra para cima e trate com descarga de brilho a 10 pascals, 400 volts, um milampere por 30 segundos para tornar a superfície do disco hidrofílica usando um aparelho de observador de íons. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de dois mililitros e centrífuga a 2.900 vezes G por 10 segundos à temperatura ambiente. Remova o supernatante e suspenda a pelota para obter uma suspensão grossa.
Coloque uma pequena quantidade ou aproximadamente 0,02 microliters da suspensão celular em um disco de cobre. Cubra-o com outro disco de cobre e pegue os discos com pinças. Faça um poço no centro do propano sólido com a barra de metal fina.
Coloque as pinças em um SFD e congele-as rapidamente pressionando o botão de injeção do aparelho. Mergulhe as pinças usadas em água de temperatura ambiente para aquecê-las para congelar os seguintes espécimes. Use tecidos animais e humanos fixados em 2,5% glutaraldeído, 0,1 tampão molar fosfato de pH 7,4.
Corte-os em seções de 0,1 a 0,2 milímetros de espessura com uma lâmina de barbear sob um microscópio estéreo. Coloque uma pequena gota da solução de glutaraldeído no disco de cobre tipo cesta, em seguida, use pinças para colocar um pedaço de tecido no glutaraldeído no disco de cobre e cobri-lo com o disco de cobre plano. Congele rapidamente os discos com os tecidos no propano de fusão do SFD, como demonstrado anteriormente.
Transfira os discos em nitrogênio líquido em um banho de trabalho. Usando um par de pinças resfriadas em nitrogênio líquido, retirem os discos um do outro para expor o espécime. Coloque os discos com as células em um frasco de vidro que é preenchido com um mililitro de acetona contendo 2%de tetroxida de ósseo que foi colocado em nitrogênio líquido e solidificado.
Transfira os discos para um congelador profundo e mantenha-os a menos 80 graus Celsius por dois a quatro dias para substituição congelante das células. Gradualmente leve os espécimes à temperatura ambiente, incubando-os por duas horas a menos 20 graus Celsius, duas horas a quatro graus Celsius e 15 minutos à temperatura ambiente. Transfira os discos para dois tubos de plástico mililitro que são preenchidos com um mililitro de acetona.
Prepare a resina epóxi misturando os reagentes em um recipiente plástico descartável usando um agitador. Troque a acetona sucessivamente com 30% de resina em acetona, 60% de resina e 90% de resina à temperatura ambiente por uma hora cada, depois troque a resina de 90%com 100% de resina a 37 graus Celsius durante a noite. Finalmente, incorpore as amostras em 100% de resina no molde de incorporação de silício e polimerize-as a 60 graus Celsius por 24 horas.
Retire os blocos polimerizados dos moldes de incorporação de silício e escreva o número da amostra no bloco. Remova os discos de cobre do bloco com uma lâmina de barbear e corte os espécimes incorporados na superfície do bloco usando uma lâmina de corte ultrassônica e lâminas de barbear sob um microscópio estéreo. Em seguida, aplique fita no mandril do bloco da amostra e no porta-espécimes do microtome e corte a fita no limite.
Remova o bloco do ultra microtómeo, coloque-o em um microscópio estéreo e corte-o ainda mais para 0,2 milímetros por 0,3 milímetros usando uma lâmina de barbear. Aplique neoprene nas grades para torná-los adesivos. Coloque o bloco de volta no microtoma ultra alinhando as peças gravadas.
Cubra o ultra microtome com uma tampa plástica e corte de 50 a 70 nanômetros de espessura. Recupere as seções usando um loop. Monte-os em 300 ou 400 redes de cobre de malha tratadas com neoprene e seque-as.
Coloque as grades com seções na ranhura do tubo de silicone. Mergulhe os espécimes em solução de acetato deuranyl por três minutos. Colete a solução de uryl usada e armazene-a em uma seringa.
Lave os espécimes em meio tubo com um jato de água e mergulhe os espécimes em citrato de chumbo por três minutos. Para amostras de leveduras e fungos, coloque as grades em um papel filtro, pegue-as com pinças e cubra-as com filme de naftalina polimerizada de plasma na superfície da água. Insira as grades no porta-espécimes de um microscópio eletrônico, em seguida, insira o suporte da amostra no microscópio eletrônico e observe a 100 kilovolts.
Seções ultra finas de E.coli e S.cerevisiae quando observadas sob o microscópio eletrônico mostraram morfologia natural e imagens claras. Seções ultra finas de células cultivadas rapidamente congeladas usando SFD foram observadas sob o microscópio eletrônico. As imagens de seções ultra finas da pele humana eram muito claras e mostravam morfologia natural.
As partículas do núcleo do vírus da hepatite B foram rapidamente congeladas com SFD e observadas pela microscopia eletrônica crio. A coisa mais importante a lembrar é que você deve aplicar uma quantidade muito pequena de células nos discos de cobre para que a formação de cristais de gelo seja impedida após o congelamento. Ao fixar tecidos animais com glutaraldeído de antemão, um bom congelamento a uma profundidade de cerca de 200 micrômetros é alcançado semelhante à profundidade alcançada pelo congelamento de alta pressão.
Essa técnica abre caminho para um pesquisador observar a requintada ultra estrutura natural das células facilmente a baixo custo.
Visão Geral
Este artigo demonstra o uso de um dispositivo de congelamento em sanduíche (SFD) para o congelamento rápido de espécimes biológicos, permitindo uma preservação superior da ultraestrutura celular para microscopia eletrônica. O protocolo detalha o preparo do espécime, congelamento rápido, substituição por congelação, inclusão em resina, seccionamento ultradelgado, coloração e obtenção de imagens, aplicáveis a bactérias, leveduras, células cultivadas, tecidos animais e humanos e vírus.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Microscopia eletrônica
- Técnicas de preparação de amostras
Antecedentes
- A fixação química frequentemente introduz artefatos e não preserva adequadamente a ultraestrutura celular.
- O congelamento rápido, particularmente o congelamento em sanduíche, impede a formação de cristais de gelo e mantém melhor a estrutura celular nativa.
- Dispositivos artesanais para congelamento em sanduíche limitaram sua adoção mais ampla; um novo dispositivo comercialmente disponível resolve esse problema.
- A substituição por congelação e a inclusão em resina são essenciais para o preparo de cortes ultrafinos para microscopia eletrônica.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o uso de um dispositivo comercial de congelamento tipo sanduíche para o congelamento rápido de diversos espécimes biológicos.
- Fornecer um protocolo detalhado para o preparo de espécimes para microscopia eletrônica após congelamento rápido.
- Mostrar a eficácia deste método na preservação da morfologia celular natural.
Métodos Utilizados
- Preparação de propano líquido e discos de cobre para congelamento.
- Aplicação de amostras celulares ou teciduais entre discos de cobre e congelamento rápido em propano sólido utilizando o SFD.
- Substituição por congelação em acetona com tetróxido de ósmio a -80°C, seguida de aquecimento gradual.
- Inclusão em resina, corte do bloco, seccionamento ultrafino (50–70 nm) e montagem em grades de cobre.
- Coloração com acetato de uranila e citrato de chumbo, e obtenção de imagens por microscopia eletrônica.
Resultados Principais
- Secções ultradelgadas de E. coli, S. cerevisiae, células cultivadas e pele humana mostraram morfologia clara e natural ao microscópio eletrônico.
- Partículas do core do vírus da hepatite B foram observadas com sucesso por microscopia eletrônica criogênica após congelamento rápido.
- A fixação com glutaraldeído antes do congelamento permitiu boa preservação até profundidade de 200 µm, comparável ao congelamento sob alta pressão.
- A formação mínima de cristais de gelo foi alcançada mediante a aplicação de volumes muito pequenos da amostra.
Conclusões
- O dispositivo de congelamento em sanduíche permite a preservação fácil, de baixo custo e eficaz da ultraestrutura celular para microscopia eletrônica.
- Este método é amplamente aplicável a diversos espécimes biológicos, incluindo células, tecidos e vírus.
- O manuseio adequado das amostras e a aplicação de volume mínimo são essenciais para resultados ideais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A preservação da ultraestrutura celular nativa é essencial para a desmistificação mecanicista e a validação de alvos na descoberta precoce e na pesquisa translacional. O dispositivo de congelamento em sanduíche permite um preparo rápido de amostras com mínimos artefatos para microscopia eletrônica, apoiando análises morfológicas de alta confiabilidade em diversos sistemas biológicos. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva em pontos críticos do processo de P&D na indústria biofarmacêutica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a visualização de alta fidelidade de estruturas celulares e subcelulares para testes de hipóteses mecanicistas.
- Reduz artefatos de fixação, apoiando a validação funcional de alvos e a redução de riscos biológicos.
- Facilita a análise ultraestrutural comparativa entre tipos celulares e tecidos para triagem de portfólios.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece preparação padronizada e reprodutível de amostras para ensaios downstream baseados em microscopia eletrônica.
- Permite avaliação morfológica quantitativa para verificação de prontidão e validação de ensaios.
- Permite preparação escalonável de diversos espécimes biológicos, incluindo bactérias, leveduras, células de mamíferos e tecidos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a preservação ultraestrutural à análise de tecidos relevantes para a doença, garantindo continuidade translacional.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, permitindo desfechos morfológicos robustos.
- Facilita comparações entre espécies e entre sistemas de modelos para validação pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O dispositivo de congelamento tipo sanduíche se integra ao continuum de descoberta até a fase pré-clínica, permitindo um preparo robusto de amostras para análise baseada em microscopia eletrônica, desde a descoberta inicial até a pesquisa translacional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação baseada em hipóteses da arquitetura celular e da localização de vias metabólicas.
- Triagem: Fornece leituras ultraestruturais quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Fornece dados morfológicos de alta resolução para comparação estatística de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Mantém a integridade ultraestrutural em tecidos clinicamente relevantes, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo padronizado e escalável, adaptável a diversos modelos biológicos e equipes de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras, melhorando a reprodutibilidade e a escalabilidade entre projetos.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e reduz riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas de descoberta e translacionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia eletrônica e manipulação de amostras para obter resultados ideais.
- Necessita de acesso a equipamentos de congelamento rápido, criogênicos e infraestrutura de microscopia eletrônica.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de preparação de amostras para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a uma ampla variedade de espécimes biológicos, incluindo células, tecidos e vírus.
- O volume e a manipulação da amostra são críticos para prevenir a formação de cristais de gelo e preservar a ultraestrutura.
