Usando o Corante Fluorescente, Rhodamine B, para estudar competitividade do acasalamento em mosquitos Aedes aegypti masculinos
7 de maio de 2021
Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a competitividade do Aedes aegypti masculino utilizando corante fluorescente como marcador. Mosquitos fêmeas são expostos a machos marcados e não marcados para cópula. Após o acasalamento, seus espermatozoides são examinados sob um microscópio de fluorescência para determinar seu parceiro de acasalamento.
Este protocolo mede a competitividade do acasalamento de mosquitos machos, que é um pré-requisito para programas de supressão populacional de mosquitos baseados em liberação masculina. Este critério de aptidão é avaliado como parte do controle de qualidade e avaliação da tensão. Este método reduz o tempo experimental em 90% e permite a comparação direta da competitividade do acasalamento entre duas linhas estéreis ou infectadas por Wolbachia.
A realização deste procedimento será Irene Li e Keng Wai Mak. Para começar, sexo os mosquitos machos e fêmeas na fase pupal, de acordo com suas diferenças de tamanho. Para cada conjunto de mosquitos, transfira 100 pupas machos para uma gaiola pré-rotulada para alimentação de sacarose ou alimentação de sacarose Rhodamine B.
Coloque a pupa fêmea em pequenos lotes de 40 a 50 por gaiola. Após o surgimento dos imagos, verifique as gaiolas para a presença de mosquitos machos. Para preparar a solução de sacarose Rhodamine B de 0,2%, dissolva 200 miligramas de pó de Rhodamina B para cada 100 mililitros de solução de 10% de sacarose.
Misture bem para garantir que todo o pó seja dissolvido. Prepare 20 garrafas de alimentador de açúcar com um pavio. Adicione 10 mililitros de 10% de sacarose a 10 garrafas alimentadores e 10 mililitros de solução de sacarose Rhodamine B de 0,2% para as outras 10 garrafas alimentadores.
Coloque cinco garrafas alimentados em cada gaiola masculina preparada e permita que os mosquitos machos se alimentem por três dias antes do experimento de acasalamento. Ligue a lâmpada do queimador de mercúrio e o microscópio estéreo. Deixe a fonte de luz para a lâmpada queimador de mercúrio estabilizar por 10 minutos.
Em seguida, coloque os filtros de fluorescência para proteína de fluorescência vermelha um. Aspire um pequeno número de mosquitos de cada vez no tubo de vidro do aspirador oral. Através do tubo de vidro, observe o corpo dos mosquitos machos sob o microscópio estéreo fluorescente.
Use apenas mosquitos machos marcados com Rhodamine B para o experimento. Transfere um mosquito macho em 12 copos de papel protegidos com redes. Coloque 10 mosquitos machos alimentados por xícara em seis xícaras, e 10 sacarose Rhodamine B alimentada mosquitos machos por xícara nas outras seis xícaras.
Repita este passo para os mosquitos machos conjuntos B. Coloque 12 gaiolas para o ensaio de acasalamento. Em cada uma das seis gaiolas, incluem 10 conjuntos De mosquitos machos que são marcados por Rhodamine B, 10 mosquitos machos não marcados e 10 mosquitos fêmeas fêmeas virgens.
Nas outras seis gaiolas, incluem 10 mosquitos machos não marcados, 10 mosquitos machos marcados por Rhodamine B e 10 mosquitos fêmeas fêmeas selvagens virgens. Rotule essas gaiolas para distinguir claramente entre as duas combinações de acasalamento. Coloque as respectivas xícaras de machos nas gaiolas de acasalamento de acordo com os rótulos.
Retire a rede e bata suavemente no copo para tirar os machos da xícara. Remova cuidadosamente o copo de papel e a rede da gaiola para garantir que nenhum mosquito escape da gaiola. Permita que os mosquitos machos se aclimatar na gaiola de acasalamento por pelo menos uma hora.
Usando um aspirador oral, transfira mosquitos fêmeas fêmeas virgens em 12 xícaras de papel, cada xícara contendo 10 mosquitos. Após o período de aclimatação para os mosquitos machos, transfira uma xícara de fêmeas para cada gaiola de acasalamento e remova a rede. Empurre suavemente o copo para encorajar qualquer mosquito fêmea restante para fora do copo, em seguida, remova cuidadosamente o copo de papel e a rede da gaiola para garantir que nenhum mosquito escape da gaiola.
Permita que o acasalamento ocorra por três horas e, em seguida, termine o experimento de acasalamento removendo todos os mosquitos de cada gaiola com um aspirador mecânico. Anesthetize os mosquitos no gelo por pelo menos cinco minutos. Quando os mosquitos estiverem totalmente anestesiados, pegue delicadamente os mosquitos fêmeas e abriga-os em um copo de papel separado protegido com rede.
Rotule o copo de papel transferindo o respectivo rótulo da gaiola de acasalamento para o copo. Para pontuar a espermatozoide fêmea, anestesiar o mosquito fêmea no gelo por pelo menos cinco minutos antes da dissecação sob um microscópio estéreo. Dissecar o mosquito fêmea sob o microscópio estéreo.
Examine a espermatozoide sob microscópio. Se a fêmea não for inseminada, todas as três espermatozoides estariam vazias, e se inseminadas, duas ou três das espermatozoides estariam cheias de espermatozoides. Para indivíduos inseminados, determine se a pasta de esperma contém rhodamine B fluido seminal marcado examinando-os sob o microscópio estéreo fluorescente equipado com um filtro RFP1.
Se a pasta é preenchida com fluido seminal que não está marcado com Rhodamina B, nenhuma fluorescência é observada. Por outro lado, se a espermatozoide contém rhodamina B marcado fluido seminal, ele fluoresceria laranja. O objetivo deste ensaio de competitividade de acasalamento foi determinar se poderia haver uma perda na aptidão do acasalamento masculino após várias gerações de endogamia.
Triplicados experimentais do ensaio de competitividade de acasalamento foram realizados, e os dados de inseminação são mostrados aqui. As fêmeas selvagens foram inseminadas pelos machos de raça ou de fora, com marcação recíproca. Os resultados mostram que a proporção de fêmeas inseminadas pelos machos de raça ou outcross não foi afetada pela marca rhodamina B.
Uma porcentagem significativamente maior de fêmeas acasaladas com os machos de fora do que com os machos de raça nos três replicantes, indicando que a endogamia poderia levar à perda no acasalamento. É importante preparar gaiolas extras de mosquitos fêmeas. Não utilize mosquitos fêmeas de uma gaiola contaminada por mosquitos machos, pois fêmeas pré-inseminadas tornariam todos os dados inválidos.
Além do ensaio de competitividade de acasalamento baseado em laboratório, este procedimento pode ser usado em experimentos de liberação de marcas para estudar biologia de acasalamento de insetos, dinâmica populacional e sua dispersão.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para avaliar a competitividade de acasalamento em mosquitos machos Aedes aegypti, uma consideração importante nas estratégias de controle de população de mosquitos. Ao usar Rhodamine B como marcador fluorescente, os pesquisadores podem comparar diretamente o sucesso de acasalamento de machos marcados versus não marcados após a exposição a mosquitos fêmeas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Competitividade de acasalamento de mosquitos
- Estratégias de supressão de população
- Comportamento e biologia de insetos
Fundo
- A necessidade de controle efetivo da população de mosquitos devido ao seu papel na transmissão de doenças.
- Importância da avaliação da aptidão de acasalamento dos machos para controle de qualidade em programas de técnica de insetos estéreis.
- Uso de marcadores fluorescentes para melhorar a precisão e eficiência experimental.
Métodos Utilizados
- Ensaios de acasalamento controlados usando mosquitos machos marcados e não marcados.
- Aedes aegypti como organismo modelo.
- Microscopia de fluorescência para analisar resultados de acasalamento e presença de espermatozoides.
Principais Resultados
- A endogamia reduz a aptidão de acasalamento dos machos, como evidenciado pelas taxas de inseminação mais baixas em machos endogâmicos em comparação com machos cruzados.
- A marcação fluorescente não afetou a proporção de fêmeas inseminadas.
- Método eficiente permite avaliação rápida da competitividade de acasalamento.
Conclusões
- Este estudo destaca o impacto dos fatores genéticos no sucesso de acasalamento em Aedes aegypti.
- Os resultados são relevantes para futuras pesquisas em controle de mosquitos e dinâmica de população.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Assessing male mating competitiveness is critical for evaluating strain fitness in sterile insect technique programs, directly impacting the success of vector control strategies. This fluorescent dye-based method enables rapid, quantitative comparison of mating fitness between strains, reducing experimental time by 90% and supporting data-driven go/no-go decisions in pipeline advancement. By providing a scalable, reproducible assay for target validation in vector-borne disease intervention, it enhances predictive confidence in preclinical strain selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mating fitness as a phenotypic endpoint for strain fitness evaluation.
- Operational Value: Reduces assay duration from days to hours by eliminating blood-feeding and egg-hatching steps.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying competitive mating success between sterile or Wolbachia-infected lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for mating partner identification in spermathecae.
- Operational Value: Uses sucrose feeding for non-invasive male marking, enabling high-throughput preparation of labeled cohorts.
- Reproducibility: Standardized Rhodamine B concentration (0.2% in 10% sucrose) ensures consistent labeling across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges laboratory strain evaluation to field release readiness by assessing a key fitness criterion for population suppression.
- Mechanistic De-risking: Detects fitness costs of inbreeding through reduced insemination rates, informing strain maintenance strategies.
- Disease-Relevant System: Uses Aedes aegypti, a vector for dengue, Zika, and chikungunya, aligning with global health priorities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting strain selection after genetic modification and before field trial planning, by providing a quantitative mating competitiveness metric.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that genetic background influences mating success through competitive male-female interactions.
- Screening: Produces standardized, fluorescent sperm labeling enabling blind scoring of mating outcomes across experimental groups.
- Analytics: Generates proportional insemination data per male strain, facilitating statistical comparison of mating fitness.
- Translational Research: Connects laboratory competitiveness to field efficacy by validating a prerequisite for sterile male release success.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing any two male strains, applicable across vector control programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mating fitness determinants, reducing ambiguity in strain selection.
- Operational Value: Eliminates dependency on blood feeding and embryology, simplifying workflow and increasing throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying fitness defects early, reducing investment in non-competitive strains.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated mating competitiveness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, sex separation at pupal stage, and fluorescence microscopy.
- Necessitates stereo microscope with RFP1 filter set and mercury burner lamp for standardized fluorescence detection.
- Demands cross-team standardization of male marking protocols and female dissection procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to different mosquito species or strains with varying feeding behaviors.
- Includes practical limitations such as the need to avoid pre-inseminated females and ensure proper cage labeling to prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Male and Female Mosquitoes
1:11
Preparation of 0.2% RhB Sucrose Solution and Feeding of Male Mosquitoes
1:52
Checking for RhB Fluorescence in Male Mosquitoes
2:46
Mating Competitiveness Assay
5:36
Results: Assessment of Mating Competitiveness in Male Mosquitoes
6:27
Conclusion
