Name: Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a induzir tecidos retinianos 3D a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando um protocolo otimizado de organoides. Este método quantifica o tamanho dos corpos embrioides e a densidade de plaqueamento para melhorar a reprodutibilidade.

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Este estudo foi apoiado pelo National Key P&D Program of China (2016YFC1010103, 2017YFA0104101), o Fundo de Projetos de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (201803010078), o Projeto de Ciência & Tecnologia da Província de Guangdong (2017B020230003), a Natural Science Foundation (NSF) da China (81570874, 81970842), Cem programas de talentos da Universidade Sun Yat-sen (PT1001010) e os Fundos De Pesquisa Fundamental do Laboratório Estadual de Oftalmologia.

1. Cultura e expansão de hPSCs
<ol><li>Cultura HPSC
	<ol>
<li>Cubra dois poços de uma placa de 6 poços com matriz extracelular (ECM, matriz qualificada pelo HESC). Prepare 50 mL de uma solução ECM contendo 8-12 μg/mL de ECM no Meio de Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco. Em 49 mL de DMEM, adicione 1 mL da solução de estoque ECM descongelada (50x). Adicione 1 mL da solução ECM a cada poço de uma placa de 6 poços. Incuba-lo por 1h em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Prepare o meio de manutenção hPSC (MM) de acordo com a instrução do fabricante.</li>
		<li>MM pré-quente em temperatura ambiente (RT) por 30 min.</li>
		<li>Descongele um frasco criogênico de hPSCs (hiPSCs ou hESCs) (cerca de 1 x 106) de um tanque de nitrogênio líquido por incubação em um banho de água a 37 °C para 30 s.</li>
		<li>Retire o frasco e desinfete-o cuidadosamente usando um spray de álcool desinfecção de 75%. Coloque-o em um armário de biossegurança.</li>
		<li>Transfira a suspensão celular do frasco para um tubo de 15 mL, adicione 5 mL de gota MM pré-aquecida ao tubo usando uma pipeta de 5 mL. Enquanto isso, agite suavemente o tubo para misturar os hPSCs .</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 170 x g por 5 min. Remova a maior parte do supernante usando uma pipeta de 1 mL cuidadosamente e deixe para trás cerca de 50 μL de supernasce para evitar perder as células.</li>
		<li>Adicione 1 mL de MM ao tubo e resuspenque a pelota, em tubos suavemente para cima e para baixo uma ou duas vezes com uma pipeta de 1 mL. NOTA: A sobrevivência de células únicas de hPSCs é baixa. Pequenos aglomerados de células com células 3-5 são preferidos para manter os hPSCs crescendo em colônias.</li>
		<li>Retire o ECM dos poços pré-revestidos (etapa 1.1.1), adicione 1,5 mL de MM a cada poço e, em seguida, distribua 0,5 mL de suspensão celular por poço.</li>
		<li>Agite suavemente a placa para distribuir os hPSCs uniformemente, e coloque a placa em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Não mova a placa por pelo menos 24 horas para promover a adesão celular.</li>
		<li>Mude mm a cada dois dias e passagem os hPSCs quando a confluência atingiu cerca de 80%.</li>
	</ol></li>
	<li>Passagem de hPSCs NOTA: A manutenção do estado indiferenciado em hPSCs é bastante crítica para outras aplicações. Sob as condições aderentes, os HPSCs crescem em colônias com uma fronteira bem definida. As células devem ser passagemdas quando a confluência de hPSCs atingir cerca de 80%.<ol>
<li>Observe as células sob um microscópio. Marque e remova mecanicamente as células diferenciadas claramente visíveis (<5%) antes da passagem.</li>
		<li>Prepare a placa revestida de ECM conforme descrito na etapa 1.1.1.</li>
		<li>Soro fisiológico pré-aquecido MM e 1x tampão de fosfato (PBS) sem Ca2+ e Mg2+ no RT.</li>
		<li>Pré-aqueça a solução 0,5 mM EDTA (em 1x PBS) em um banho de água a 37 °C.</li>
		<li>Remova o meio da placa de cultura usando um sistema de aspiração a vácuo, adicione 1 mL de 1x PBS em cada poço para lavar as células usando uma pipeta de 1 mL e repita duas vezes.</li>
		<li>Adicione 1 mL de solução EDTA por poço para dissociar os hPSCs em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO2 por 5 min. Não exceda o tempo de incubação recomendado para evitar a dissociação de células únicas.</li>
		<li>Retire a placa e verifique se há desprendimento das células sob um microscópio. Os hPSCs confluentes se soltam e cada borda celular pode ser vista, mas as células não podem sair facilmente agitando suavemente a placa celular.</li>
		<li>Remova a solução EDTA com uma pipeta de 1 mL e adicione 1 mL de MM para impedir a dissociação. Pipete suavemente os hPSCs uma ou duas vezes com uma pipeta de 1 mL para resuspensar as células. Não há necessidade de centrífuga para coletar as células. NOTA: Se a maioria das células sair da placa após a incubação com EDTA, as células podem ser coletadas por centrífuga.</li>
		<li>Retire o ECM dos poços pré-revestidos (etapa 1.2.2) e adicione 1,5 mL de MM por poço.</li>
		<li>Transfira 150-200 μL de aglomerados celulares para cada poço. Geralmente, os hPSCs podem ser passagemdos a uma proporção de 1:6. Por exemplo, células de um poço de uma placa de 6 poços podem ser distribuídas para seis novos poços.</li>
		<li>Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente os hPSCs e cultue os hPSCs na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por pelo menos 24h sem tocar na placa.</li>
		<li>Mude MM a cada dois dias como descrito na etapa 1.1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Diferenciação de retina dos hPSCs
NOTA: Quando as colônias atingem ~80% de confluência(Figura 1B),elas podem ser guiadas a diferenciar-se em organoides de retina seguindo o protocolo esquematizado na Figura 1A. Para garantir que os hPSCs tenham alta qualidade e bom rendimento, avalie regularmente a pluripotência com marcadores moleculares como OCT4 ou NANOG usando IFC ou QPCR. Os HPSCs devem ser descartados se as células diferenciadas responderem por mais de 5% do total de células. Verifique se há contaminação por mycoplasma com um kit de detecção de mycoplasma de acordo com as instruções do fabricante. Use apenas hPSCs sem mycoplasma, pois o mycoplasma pode alterar a capacidade de diferenciação dos hPSCs.
<ol><li>Preparar mídia e reagentes
	<ol>
<li>Prepare o meio de indução neural (NIM) misturando o seguinte: 500 mL da mistura de médio/nutriente modificado da Águia Modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL de 1% de suplemento N2, 0,5 mL de heparina de 0,1% (2 mg/mL em 1x PBS) e 5 mL de aminoácidos não essenciais MEM (NEAA).</li>
		<li>Prepare o meio de diferenciação da retina (RDM) contendo 300 mL de DMEM/F-12, 200 mL de DMEM básico, 10 mL de suplemento B27 de 2%, 5 mL de 1% antibiótico antimycótico e 5 mL de 1% MEM NEAA. NOTA: Tanto o NIM quanto o RDM não são filtrados, mas um teste de esterilidade é realizado. Tire 1 mL de médio e adicione-o em um prato de 35 mm, e cultura por 3-7 dias em uma incubadora a 37 °C e 5% DE CO2. A mídia pode ser armazenada a 4 °C e deve ser usada dentro de 2 semanas para garantir a atividade dos componentes.</li>
		<li>Prepare 10 mM Blebbistatin (1.000x) em DMSO. Adicione 1.710 μL de DMSO para dissolver 5 mg de Blebbistatin para obter uma solução de estoque de 10 mM (1.000x), alíquota a 10 μL/tubo e armazenar a -20 °C. NOTA: Todos os meios de comunicação e reagentes devem ser aquecidos em RT por 30 minutos antes do uso, a menos que seja mencionado de outra forma.</li>
	</ol></li>
	<li>Formação do corpo embrionário (EB)
	<ol>
<li>No dia 0 (D0), inicie a diferenciação. Retire um poço de hPSCs de uma placa de 6 poços, que cresceu para ~80% de confluência. Colete as células com solução de dissociação EDTA conforme descrito nas etapas 1.2.1 a 1.2.6.</li>
		<li>Remova a solução EDTA, adicione 1 mL de MM contendo Blebbistatin de 10 μM para parar a dissociação celular e colete as células com uma pipeta de 1 mL. O tamanho dos aglomerados celulares é um dos fatores-chave que impactam o rendimento dos EBs. Aproximadamente, cinco células por aglomerado são preferidas para produzir o tamanho certo de EBs em D5 a D7. NOTA: Este é um passo fundamental. Não enconha as células muitas vezes, uma vez que agregados semelhantes ao EB são difíceis de formar a partir de células únicas de hPSCs.</li>
		<li>Transfira a suspensão celular (cerca de 2 x 106 células) para uma placa de Petri de fixação ultra-baixa de 100 mm e adicione 9 mL de MM contendo Blebbistatin de 10 μM ao prato.</li>
		<li>Agite suavemente o prato duas vezes para distribuir as células uniformemente, e coloque o prato na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Em D1, depois que as células são cultivadas por pelo menos 24 h, tire o prato e observe-o sob o microscópio. Um grande número de pequenos agregados celulares será espontaneamente formado por esta altura(Figura 1C).</li>
		<li>Prepare 12 mL de mistura com MM e NIM a uma proporção de 3:1 (9 mL de MM e 3 mL de NIM) em um tubo de 15 mL.</li>
		<li>Transfira as culturas celulares para um tubo de centrífugas de 15 mL com uma pipeta de 10 mL perpendicularmente, e adicione 10 mL da mistura pré-aquecida ao prato.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 60 x g por 3 min para coletar os agregados, remova o supernatante usando uma pipeta de 5 mL e deixe para trás cerca de 500 μL para evitar a perda de células.</li>
		<li>Adicione 2 mL da mistura ao tubo e transfira a suspensão para o mesmo prato (etapa 2.2.7).</li>
		<li>Agite suavemente o prato para distribuir uniformemente os agregados celulares, e coloque o prato de volta na incubadora.</li>
		<li>Em D2, prepare 12 mL de uma nova mistura com MM e NIM a uma proporção de 1:1 (6 mL de MM e 6 mL de NIM) em um tubo de 15 mL. Mude o meio celular com a mistura fresca preparada repetindo os passos de 2.2.5 para 2.2.10.</li>
		<li>Em D3, troque o meio celular com 15 mL de NIM como descrito acima. Cultume as células por pelo menos 5 dias sob as condições de suspensão. NOTA: Durante a D1 para a D3, o meio deve ser alterado todos os dias, proporcionando nutrição suficiente. Desde a D3, o NIM pode ser alterado a cada dois dias. Além disso, os EBs podem ser divididos em diversos pratos para proporcionar nutrição abundante.</li>
	</ol></li>
	<li>Sementes os EBs NOTA: Em D5 a D7, escolha um ponto de tempo apropriado para emplacar os EBs nos pratos revestidos de ECM de acordo com o tamanho dos EBs. EBs com diâmetro aproximado de 200 μm é apropriado para a diferenciação da retina. Em geral, um poço de hPSCs em uma placa de 6 poços pode produzir cerca de 300 a 1.000 EBs. A variação do rendimento do EB é variada pelas linhas hPSC.<ol>
<li>Na D4, prepare pratos revestidos de ECM para a cultura aderente aos EBs. Adicione 5 mL de ECM a cada prato de cultura de tecido de 100 mm (tratado na superfície) e coloque-os na incubadora durante a noite.</li>
		<li>Em D5, retire o ECM dos pratos pré-revestidos e adicione 10 mL de NIM pré-aquecido a cada prato.</li>
		<li>Tire o prato que contém EBs. Verifique a qualidade dos EBs sob o microscópio e certifique-se de que eles são bastante brilhantes e redondos em forma. O tamanho dos EBs tem aproximadamente 200 μm de diâmetro. Colete todos os EBs em um tubo de 15 mL. Transfira os EBs dos pratos para um tubo de 15 mL com uma pipeta de 5 mL. Deixe os EBs se acalmarem por 5 minutos. Remova a maior parte do supernaspe, deixando para trás cerca de 2 mL de meio.</li>
		<li>Distribua os EBs nos pratos revestidos contendo 10 mL de NIM gota a gota com uma pipeta de 1 mL. Semente os EBs a uma densidade de aproximadamente 2-3 EBs por cm2. Por exemplo, adicione cerca de 120-180 EBs em um prato de 100 mm. Para julgar aproximadamente o número do EB, coloque uma gota de suspensão do EB em um deslizamento de cobertura, e conte o número de EBs sob o microscópio. NOTA: A densidade de revestimento dos EBs é um dos fatores-chave que impactam a eficiência da indução da retina. A densidade também pode ser ajustada por cada linha hPSC.</li>
		<li>Agite delicadamente os pratos para distribuir os EBs uniformemente. Coloque-os na incubadora a 37 °C e 5% de CO2. NOTA: Não mova os pratos por pelo menos 24h para aumentar a adesão dos EBs.</li>
	</ol></li>
	<li>Indução de vesículas ópticas (OVs) e epitélio pigmento de retina (RPE) em condições aderentes NOTA: Depois que os EBs são semeados na superfície revestida de ECM, os hPSCs podem desenvolver estruturas semelhantes a OV, que podem ser observadas tão cedo quanto D20 após a diferenciação. Neste protocolo, fatores específicos de crescimento ou moléculas de sinalização não são necessários para guiar os hPSCs para o destino da retina, exceto a adição de suplementos N2 e B27 na mídia.<ol>
<li>Em D8-D9, remova os pratos e observe os EBs sob o microscópio. Todos os EBs serão anexados e distribuídos nos pratos(Figura 1D). Adicione 10 mL de NIM fresco a cada prato de 100 mm contendo 10 mL de meio antigo. Coloque-os de volta na incubadora. NOTA: Não remova o meio antigo.</li>
		<li>Em D12, troque metade do meio com NIM usando uma pipeta de 10 mL. Mantenha a cultura na incubadora.</li>
		<li>Em D16, remova todos os NIM dos pratos usando um sistema de aspiração a vácuo. Adicione 20 mL de RDM a cada prato. Continue culminando em RDM e troque metade do meio a cada dois dias.</li>
		<li>Durante a D10-D30, observe as alterações morfológicas das células duas vezes por semana sob um microscópio e avalie a eficiência da diferenciação da retina. NOTA: Desde D10, os domínios de eye field (EF) são auto-organizados nas zonas periféricas dos EBs aderentes. As estruturas semelhantes a OV aparecem entre D20 e D25, gradualmente se projetam do prato, e auto-formam um copo óptico, que é cercado pelo RPE pigmentado(Figura 1E). Os OVs podem ser facilmente reconhecidos com o anel NR brilhante, refrativo e grosso.</li>
	</ol></li>
	<li>Despeito e cultura OVs e RPE em suspensão para obter organoides de retina (ROs)
	<ol>
<li>Na D28-D35, a maioria dos OVs aparecem nos pratos. Use uma agulha de tungstênio ou uma agulha com seringa de 1 mL para desprender mecanicamente os OVs morfologicamente identificáveis junto com o RPE adjacente. Cultuá-los em suspensão. NOTA: A aparência e o rendimento de OVs e RPE variam amplamente em diferentes linhas hPSC. Assim, o ponto de tempo de desapegar OV e RPE é flexível. OVs óbvios com o RPE adjacente podem ser destacados e, em seguida, movidos para um prato de cultura de baixa fixação contendo RDM. Continue a culminar o resto das células até que todos os OVs e RPEs sejam levantados.</li>
		<li>Coloque 50-60 OVs em cada prato de cultura de apego baixo de 100 mm contendo 15 mL de RDM para a formação de ROs(Figura 1F).</li>
		<li>Altere rdm a cada 2-3 dias até D42, quando os ROs são bem em forma redonda.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Desenvolvimento e maturação da retina
NOTA: Neste protocolo, o soro é necessário para manter os ROs crescer e amadurecer para a cultura de longo prazo.
<ol><li>
Laminação e especificação da retina em ROs
	<ol>
<li>Prepare 10 mL de taurina de 100 mM (1.000x) em 1x PBS. Pesar 125 mg de taurina, e dissolver em 10 mL de 1x PBS. Filtre a solução com um filtro de seringa de 0,22 μm. Alíquota a 500 μL/tubo e armazena a -20 °C.</li>
		<li>Prepare a cultura da retina meio 1 (RC1). Misture os seguintes componentes: 250 mL de DMEM/F-12, 175 mL de DMEM básico, 50 mL de soro bovino fetal,10 mL de suplemento B27 de 2%, 5 mL de 1% Antibiótico Antimycótico, 5 mL de 1% MEM NEAA, 0,5 mL de 100 μM taurina, e 5 mL de 2 mM L-alanyl-L-glutamine.</li>
		<li>Prepare o meio de cultura da retina 2 (RC2) contendo 450 mL de DMEM/F-12, 50 mL de soro bovino fetal, 5 mL de suplemento N2 de 1%, 5 mL de 1% Antibiótico Antimycético, 0,5 mL de 100 μM taurina, 5 mL de 1% MEM NEAA, e 5 mL de 2 mM L-alnyl-L-glutamina. NOTA: O RC1 e o RC2 não são filtrados, mas passam por um teste de esterilidade. Tire 1 mL de médio, adicione-o a um prato de 35 mm e cultura por 3-7 dias na incubadora a 37 °C e 5% de CO2, para garantir a esterilidade antes do uso. O meio pode ser armazenado a 4 °C e deve ser usado dentro de 2 semanas para garantir a atividade dos componentes. Todos os meios de comunicação e reagentes devem ser pré-aquecidos em RT por 30 minutos antes do uso.</li>
		<li>Em D42, mude o meio de cultura de RDM para RC1.</li>
		<li>Incline os pratos em cerca de 30° e deixe os ROs se acalmarem por 30 s. Remova o RDM antigo com uma pipeta de 10 mL deixando para trás cerca de 1 mL de média para evitar perder ROs. Adicione 15 mL de RC1 fresco a cada prato.</li>
		<li>Agite suavemente os pratos para distribuir os ROs uniformemente. Coloque os pratos de volta na incubadora. Troque todo o meio duas vezes por semana depois disso.</li>
		<li>Durante o D50-D90, selecione a alta qualidade dos ROs para cultura de longo prazo, que são em forma redonda com uma NR grossa e brilhante. Coloque 30-40 ROs em um prato de 100 mm de baixa fixação com 20 mL de RC1, e mude todo o meio duas vezes por semana.</li>
		<li>Para a cultura de suspensão a longo prazo dos ROs, pipeta os ROs para evitar a religação RO-RO usando uma pipeta. Transfira ROs para novos pratos culturais uma vez por mês para evitar que os ROs grudem na superfície dos pratos. NOTA: Sob as condições de cultura de suspensão, os ROs são em forma redonda, com um anel NR brilhante e grosso anexado com mais ou menos RPE de um lado. A retina neural laminada desenvolve e subtipos de células da retina aparecem sequencialmente com células gânglios da retina geradas pela primeira vez, seguidas por células fotorreceptoras, células amacrinas e células bipolares.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amadurecimento do fotoreceptor humano com enriquecimento de cones em ROs
	<ol>
<li>Depois de D90, mude o meio de RC1 para RC2, que é adequado para a maturação do fotorreceptor.</li>
		<li>Alterar o meio conforme descrito nas etapas 3.1.7-3.1.8. NOTA: Sob esta condição de cultura, os ROs podem crescer a longo prazo(Figura 1G),até d300 testados. As células retinianas em ROs tornam-se maduras, e todos os subtipos celulares da retina neural, incluindo células glial muller, hastes e cones também são adquiridos. Sem qualquer adição de RA, os fotorreceptores de cone também são ricos em ROs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li>
<li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li>
</ol>

Xiufeng Zhong é o inventor de patentes relacionado à geração de células retinais a partir de células-tronco pluripotentes humanas.

Neste protocolo de indução de retina de várias etapas, os HPSCs foram guiados passo a passo para ganhar o destino da retina, e auto-organizados em organoides de retina contendo NR e RPE laminados. Durante a diferenciação, os HPSCs recapitularam todos os principais passos do desenvolvimento da retina humana in vivo, desde EF, OV e RPE, até laminação da retina, gerando todos os subtipos de células da retina, incluindo células de gânglios da retina, células amacrinas, células bipolares, rod e fotorreceptores de con...

As doenças degenerativas da retina (RD), como a degeneração macular relacionada à idade (ED) e a retinite pigmentosa (RP), são caracterizadas pela disfunção e morte de células fotorreceptoras e normalmente levam à perda irreversível da visão sem formas efetivas de cura1. O mecanismo subjacente a essas doenças é parcialmente desconhecido devido à falta de modelos de doenças humanas2. Ao longo das últimas décadas, avanços significativos foram realizados na medicina regenerativa através da tecnologia de células-tronco. Muitos pesquisadores, incluindo nós mesmos, mostraram que células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs), podem se diferenciar em todos os tipos de células da retina, mesmo tecidos mini-retinas através de várias abordagens de diferenciação3,4,5,6,7,8,9,10, 11, proporcionando enorme potencial na modelagem da doença e na terapia celular12,13,14.
No entanto, o processo de indução de hPSCs para células de retina é altamente complicado e demorado com baixa repetibilidade, o que requer pesquisadores com rica experiência e altas habilidades. Durante o processo de indução complexa e dinâmica, uma série de fatores impactará o rendimento dos tecidos da retina15,16,17. Além disso, diferentes métodos de indução muitas vezes variam consideravelmente em tempo e expressão robusta de marcadores de retina, o que pode confundir a coleta de amostras e a interpretação dos dados3. Portanto, um protocolo simples de diferenciação de retina dos hPSCs com orientação passo a passo seria demandado.
Aqui, com base em nossos estudos publicados18,19,20,21, um protocolo otimizado de indução de retina para gerar organoides de retina (ROs) com fotorreceptores de cone rico de hPSCs, o que não requer o suplemento de ácido retinóico (RA). Este protocolo se concentra na descrição do método de várias etapas para gerar retina neural e RPE. A formação do EB é a parte essencial da fase inicial de indução. Tanto o tamanho quanto a densidade de revestimento dos EBs são otimizados quantitativamente, o que aumenta cientificamente o rendimento dos tecidos da retina e promove a repetibilidade. Na segunda parte da indução, vesículas ópticas (OVs) se auto-organizam na cultura de adesão e forma de ROs na cultura de suspensão; os cursos de tempo e eficiência desta parte variam consideravelmente em diferentes linhas hPSC. A maturação e especificação das células da retina em ROs ocorrem principalmente no estágio médio e tardio da indução. Sem a adição de RA, podem ser produzidos fotorreceptores maduros com cones ricos e hastes.
O objetivo deste protocolo é descrever quantitativamente e detalhar cada passo para pesquisadores inexperientes se repetirem. Várias linhas de hPSC foram induzidas com sucesso em ROs por este protocolo com um rendimento robusto de tecidos retinados ricos em cone e alta repetibilidade. Os ROs derivados do HPSCs com este protocolo podem recapitular os principais passos do desenvolvimento da retina in vivo, e sobreviver a longo prazo, o que facilita aplicações a jusante, como modelagem de doenças, rastreamento de medicamentos e terapia celular.

<table><tbody><tr><td>(&menos;)-Blebistatina</td><td>Sigma</td><td>B0560-5mg</td><td>ROCK-inibidor 1</td></tr><tr><td>ml pontas</td><td>Kirgen</td><td>KG1313</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>10 ml pipeta</td><td>Sorfa</td><td>3141001</td><td>Pipeta</td></tr><tr><td>100 mm Cultura de tecidos</td><td>BIOFIL</td><td>TCD000100</td><td>100 mm Placa de Petri</td></tr> de <tr><td>100 mm Cultura de tecidos</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm Placa de Petri</td></tr><tr><td>de 15 ml Tubos de centrífuga</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td>Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>35 mm Placas de cultura de tecidos</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 mm Placa de Petri</td></tr><tr><td>Pipeta de 5 ml</td><td>Sorfa</td><td>313000</td><td>Pipeta</td></tr><tr><td>50 ml Tubos de centrífuga</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td>Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>6 poços Placas de cultura de tecidos</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Placas</td></tr><tr><td>de cultura Anti-AP2&alpha; Anticorpo</td><td>DSHB</td><td>3b5</td><td>Primário&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>ANTIBIÓTICO ANTIMICÓTICO 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Antibiótico-Antimicótico</td></tr><tr><td>Anti-ISL1 Anticorpo</td><td>Boster</td><td>BM4446</td><td>Primário&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Primário&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-L/M opsina Anticorpo</td><td>presente do Dr. jeremy</td><td>/</td><td>Primary&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-PAX6 Anticorpo</td><td>DSHB</td><td>pax6</td><td>Primário&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-coelho 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td>Burro anti-Coelho IgG (H+L) Anticorpo Secundário, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-Recoverina Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>ab5585</td><td>Primário&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-Rodopsina Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab5417</td><td>Primário&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-ovelha 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21436</td><td>Burro anti-Ovelha IgG (H+L) Anticorpo Secundário, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-SOX9 Anticorpo</td><td>Abclonal</td><td>A19710</td><td>Primário&nbsp; anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-VSX2 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>ab9016</td><td>Primário&nbsp; suplemento de anticorpo</td></tr><tr><td>B-27 W/O VIT A (50X)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>Suplemento</td></tr><tr><td>Frasco de tubo criogênico</td><td>Thermo scientific-NUNC</td><td>375418</td><td>1,8 ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>D532</td><td>4',6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetila (DMSO) Hybri-max</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Médio</td></tr><tr><td>DMEM /F12</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td>Médio</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>0.5 M PH 8.0</td></tr><tr><td>FBS</td><td>NATOCOR</td><td>SFBE</td><td>Filtro de</td></tr><tr><td></td><td>Soro Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22&mu; m, filtro Millex estéril</td></tr><tr><td>GlutaMax, 100X</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanil-L-glutamina</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>2 mg/ml em PBS para usar</td></tr><tr><td>Matrigel, 100x</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matriz extracelular (ECM)</td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM NEAA</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEM CELL</td><td>85850</td><td>Suplemento de meio de manutenção de hPSCs (MM)</td></tr> <tr><td>N2</td><td>Suplemento Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>GNM</td><td>GNM10010</td><td>sem Ca+,Mg+,PH7.2&plusmn; 0.1 0.1M</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td>Suplemento</td></tr><tr><td>Ultra-baixo acessório placas de cultura 100mm placa de Petri, placa</td> de <td>Petri</td> <td>Corning</td><td>CLS3262-20EA</td> de baixo anexo</tr></tbody></table>

sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3d de células-tronco pluripotentes humanas

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Doenças degenerativas da retina são as principais causas de cegueira irreversível sem tratamento efetivo. Células-tronco pluripotentes que têm o potencial de se diferenciar em todos os tipos de células da retina, mesmo mini-tecidos da retina, possuem enormes promessas para pacientes com essas doenças e muitas oportunidades na modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos. No entanto, o processo de indução de hPSCs para células de retina é complicado e demorado. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado de indução da retina para gerar tecidos de retina com alta reprodutibilidade e eficiência, adequados para várias células-tronco pluripotentes humanas. Este protocolo é realizado sem a adição de ácido retinóico, que beneficia o enriquecimento de fotorreceptores de cone. A vantagem deste protocolo é a quantificação do tamanho do EB e da densidade de revestimento para aumentar significativamente a eficiência e a repetibilidade da indução da retina. Com este método, todas as principais células da retina aparecem sequencialmente e recapitulam os principais passos do desenvolvimento da retina. Facilitará aplicações a jusante, como modelagem de doenças e terapia celular.

O processo de indução da retina neste protocolo imita o desenvolvimento da retina fetal humana. Para iniciar a diferenciação da retina, os HPSCs foram dissociados em pequenos aglomerados e cultivados em suspensão para induzir a formação de EBs. Em D1, formaram-se os agregados de células uniformizadas ou EBs(Figura 1C). O meio de cultura foi gradualmente transformado em NIM. Na D5, os EBs foram banhados nos pratos de cultura revestidos de ECM. As células migraram gradualmente para fora dos EB...

Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

O processo de indução de hPSCs para células retinentais é complicado e demorado. Este protocolo otimizado pode gerar tecidos de retina com alta reprodutibilidade e sem custo. A vantagem deste protocolo é a quantificação do tamanho do EB e da densidade de revestimento para aumentar significativamente a eficiência e a repetibilidade da indução da retina a partir de hPSCs.Com este método, todas as principais células da retina aparecem sequencialmente e recapitulam os principais passos do desenvolvimento da retina. Facilitará a modelagem da doença e a terapia celular para doenças degenerativas da retina. Demonstrando o procedimento, estamos com Yuanyuan Guan, um estudante de doutorado, e Bingbing Xie, um técnico do laboratório.Comece preparando 50 mL de solução ECM adicionando 1 mL da terceira solução de estoque de 50 vezes a 50 mL de DMEM. Em seguida, adicione 1 mL desta solução ECM preparada para cada poço de uma placa de seis poços e incuba-a por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Prepare o meio de manutenção hPSC de acordo com a instrução do fabricante e pré-o à temperatura ambiente por 30 minutos.Despeje um frasco criogênico de hPSCs de um tanque de nitrogênio líquido incubando-o em um banho de água a 37 graus Celsius por 30 segundos. Desinfete-o cuidadosamente usando um spray de álcool de 75% e coloque-o em um armário de biosegurança. Transfira a suspensão celular do frasco para um tubo de 15 milímetros.Em seguida, adicione 5 mL de manutenção pré-aquecida meio gota a gota ao tubo usando uma pipeta de 5 mL, enquanto agita suavemente o tubo para misturar os hPSCs. Centrifugar o tubo a 170 vezes G por cinco minutos. Remova cuidadosamente a maior parte do supernante usando uma pipeta de 1 mL, deixando para trás aproximadamente 50 microlitres de supernascer para evitar a perda das células.Suspenda a pelota com 1 mL de meio de manutenção por tubulação para cima e para baixo. Retire o ECM dos poços pré-revestidos e adicione 1,5 mililitros de meio de manutenção a cada poço. Em seguida, distribua 0,5 mililitros de suspensão celular em cada poço.Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente os hPSCs. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 24 horas para promover a adesão celular. Alterar o meio todos os dias e a passagem de hPSCs em 80% de confluência.No dia-0, inicie a diferenciação removendo as células de confluência de 80% de um poço da placa de seis poços. Colete as células com solução de dissociação EDTA, conforme descrito no manuscrito do texto. Remova a solução EDTA e adicione 1 mL de meio de manutenção contendo 10 fluvastatina micromolar para parar a dissociação celular.Colete as células com uma pipeta de 1 mL. Transfira a suspensão celular para uma placa de Petri ultra-baixa de 100 milímetros e adicione 9 mL de meio de manutenção contendo 10 fluvastatina micromolar ao prato. Agite suavemente o prato duas vezes para distribuir as células uniformemente.Em seguida, coloque-o na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois que as células forem cultivadas por pelo menos 24 horas, observe-as sob o microscópio. Adicione 9 mL de meio de manutenção e 3 mL de NIM a um tubo de 15 mL.Transfira as culturas celulares para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 10 mL da mistura nim pré-aquecida ao prato. Centrifugar o tubo a 60 vezes G durante 3 minutos para coletar os agregados. Em seguida, remova o supernatante usando uma pipeta de 5 mL, deixando para trás aproximadamente 500 microliters para evitar a perda de células.Adicione 2 mL da mistura ao tubo e transfira a suspensão de volta para a mesma placa de Petri. Agite suavemente o prato para distribuir uniformemente os agregados celulares. Em seguida, coloque o prato de volta na incubadora.No dia-5, retire o ECM dos pratos pré-revestidos e adicione 10 mL de NIM pré-aquecido a cada prato. Pegue o prato que contém Ebs e verifique a qualidade dos EBs sob o microscópio, certificando-se de que eles são brilhantes e redondos. Colete todos os EBs em um tubo de 15 mL e deixe que eles se acomodem por 5 minutos.Em seguida, remova a maior parte do supernante, deixando para trás cerca de 2 mL de médio. Depois de contar os EBs, semeou-os drop-by-drop a uma densidade de aproximadamente 2-3 EBs por centímetro quadrado em pratos revestidos contendo 10 mL de NIM. Agite delicadamente os pratos para distribuir os EBs uniformemente e coloque-os na incubadora por pelo menos 24 horas.Use uma agulha de tungstênio ou uma agulha com uma seringa de 1 mL para desprender mecanicamente as vesículas ópticas morfologicamente identificáveis, juntamente com o epitélio pigmento de retina adjacente nos dias 28 a 35. Cultuá-los em suspensão. Coloque 50-60 vesículas ópticas em cada prato de cultura de baixa fixação de 100 milímetros, contendo 15 mL de RDM para formação organoide de retina.Troque o meio a cada 2 a 3 dias até o dia 42. Para iniciar a diferenciação da retina, os HPSCs foram dissociados em pequenos aglomerados e cultivados em suspensão, que formavam EBs desde o Dia-1. No Dia-5, os EBs foram banhados nos pratos de cultura revestidos pelo ECM e as células migraram gradualmente para fora dos EBs.No dia 16, o meio de indução foi substituído pelo RDM, fazendo com que os domínios da retina neural se formassem e gradualmente se projetassem do prato, bem como, células formando estruturas semelhantes a vesículas ópticas cercadas por células RPE. Durante os dias-28 a 35, organoides de retina constituídos pela retina neural, ligados a uma esfera RPE. De um lado, as células se formaram.À medida que a diferenciação e especificação da retina progrediam, os hPSCs produziam subtipos de retina neural que gradualmente se alinhavam em camadas, imitando as características arquitetônicas de uma retina humana nativa. As células gânglios retinais foram geradas pela primeira vez a partir de progenitores da retina e acumuladas no lado basal da retina neurológica. Com este protocolo, os organoides da retina desenvolveram-se em fotorreceptores altamente maduros com ambos, varas e cones ricos.As células fotorreceptoras estavam localizadas no lado apical, enquanto as células amacrinas, as células horizontais, as células bipolares e as células gliais muller estavam todas localizadas na camada intermediária da retina neural. Os pontos-chave deste protocolo são criar alta qualidade de Ebs e semeá-los na densidade certa.

retinal-organoid-induction-system-for-derivation-3d-retinal-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A produção de células especializadas da retina, de células-tronco pluripotentes é um ponto de viragem no desenvolvimento da terapia baseada em células-tronco para doenças da retina. O presente documento descreve um método simples para uma eficiente geração de organoids da retina e Epitélio pigmentado da retina para pesquisa básica, translacional e clínica.

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos

Aqui apresentamos um protocolo passo-a-passo para gerar organoides humanos maduros da retina e utilizá-los em um ensaio de toxicidade de fotorreceptores para identificar candidatos farmacêuticos para a doença degenerativa retiniana relacionada à idade telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).

Rastreios de toxicidade em organoides da retina humana para descoberta farmacêutica

Usando um método de auto-organização, desenvolvemos um protocolo com a adição de COCO que poderia aumentar significativamente a geração de fotorreceptores.

Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.

Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

O presente protocolo descreve um sistema otimizado de indução de retina neural 3D que reduz a adesão e fusão de organoides da retina com alta repetibilidade e eficiência.

Gerando Retina Neural a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

A microglia é uma célula imune residente única na retina, desempenhando papéis cruciais em várias doenças degenerativas da retina. A geração de um modelo de co-cultura de organoides retinianos com microglia pode facilitar uma melhor compreensão da patogênese e do progresso do desenvolvimento das doenças retinianas.

Montagem de organoides retinianos com microglia

Este protocolo combina limpeza óptica e imunomarcação para imagens confocais de volume total de organoides retinianos de montagem total. Ele preserva a estrutura 3D, permitindo a visualização detalhada das principais vias neuronais, melhorando o estudo da maturação da retina, organização espacial e suas potenciais aplicações na modelagem de doenças e medicina personalizada.

Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

O artigo descreve uma técnica simplificada de córnea especiais de consumo e eviscerar os tecidos da retina do globo ocular de humanos doadores cadavéricos. A técnica descrita aqui vai ajudar a impostos especiais de consumo tecidos de boa qualidade para ser utilizados para transplantação, cirúrgicos ou de pesquisa, sem danificar outros tecidos do globo ocular.

Uma técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; Excisão de Córnea e evisceração de tecido da retina do globo ocular humano

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Usamos amostras de retina de retinectomy para uma análise transcriptomic de descolamento de retina. Foi desenvolvido um processo que permite a conservação de ARN entre os blocos cirúrgicos e laboratoriais. Temos um protocolo padronizado para purificar RNA por ultracentrifugação de cloreto de césio para assegurar que os ARN purificados são adequados para a análise de microarray.

Análise de Transcriptoma Humanos espécimes cirúrgicos retina utilizando Jornal

Aprenda a induzir tecidos retinianos 3D a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando um protocolo otimizado de organoides. Este método quantifica o tamanho dos corpos embrioides e a densidade de plaqueamento para melhorar a reprodutibilidade.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

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