Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra.

Nossos modelos e protocolo de câncer de fígado de peixe-zebra oferecem uma oportunidade única de visualizar in vivo, de forma não invasiva, o microambiente hepático e a paisagem imunológica usando microscopia intravital. A transparência das larvas de peixe-zebra é, sem dúvida, a principal vantagem deste sistema, que nos permite realizar microscopia intravital não invasiva e obter informações sobre o microambiente e a infiltração de células imunes de um tecido e órgão profundos, como o fígado. Nosso modelo nefrótico induzido por dieta e as técnicas de imagem descritas neste protocolo podem ser facilmente aplicadas às interações célula-célula complicadas em outras doenças hepáticas ou campos de pesquisa, incluindo síndrome metabólica e doenças cardiovasculares.

Demonstrando o procedimento estarão Cassia Michael, nossa técnica de laboratório, e o Dr. Francisco Juan Martinez-Navarro, um pós-doutorado em meu laboratório. Para começar, pese quatro gramas de dieta comercial de alimentos secos para larvas de peixe-zebra em dois copos de vidro de 25 mililitros, um para dieta normal e outro para a dieta de colesterol 10% alto, ou HCD. Pese 0,4 gramas de colesterol em um copo de vidro de 10 mililitros e cubra o copo com papel alumínio.

Em um exaustor, meça cinco mililitros de éter dietílico usando uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 20. Em seguida, adicione o éter dietílico ao copo da dieta normal e misture-o imediatamente com o alimento seco usando uma espátula. Meça outros cinco mililitros de éter dietílico usando a mesma seringa e agulha e adicione-o ao copo contendo HCD.

Misture imediatamente aspirando para cima e para baixo com a seringa. Adicione rapidamente a solução de colesterol ao copo HCD e misture-a imediatamente com uma espátula até que a solução esteja uniforme. Deixe os copos no exaustor por até 24 horas para evaporar completamente o éter dietílico.

No dia seguinte, moa as dietas em partículas finas usando pilão e argamassa. Transfira cada dieta para um pequeno saco plástico rotulado ou um tubo de centrífuga de 50 mililitros e armazene-os a menos 20 graus Celsius. Configure linhas de peixes transgênicos no dia menos um.

No dia zero, colete ovos em um coador de malha depois que o peixe tiver desovado. Usando um frasco de lavagem com E3, lave bem os ovos e transfira-os cuidadosamente para placas de Petri de 10 centímetros com meio E3. Limpe as placas de todos os detritos que possam ter se acumulado nas caixas de reprodução, incluindo quaisquer ovos mortos ou não fertilizados para evitar o crescimento descontrolado de microrganismos e consequentes defeitos no desenvolvimento das larvas.

Em seguida, divida os ovos a uma densidade de 70 ou 80 ovos por prato contendo 25 mililitros de E3. No primeiro dia, verifique e limpe embriões mortos ou embriões com defeitos de desenvolvimento sob um escopo de dissecação equipado com uma base de transiluminação. No quinto dia, misture as larvas de todos os pratos em uma placa de Petri de 15 centímetros e adicione E3 sem azul de metileno. Divida as larvas nas caixas de alimentação e alimente-as conforme descrito no manuscrito do texto.

Mantenha as larvas na sala de peixes-zebra ou em uma incubadora a 28 graus Celsius em um ciclo de luz escura e alimente-as duas vezes ao dia do dia 5 ao dia 12. Remova os detritos alimentares diariamente, bem como 90 a 95% do meio usando um sistema de vácuo ligado a uma ponta de pipeta de um mililitro. Em seguida, despeje cuidadosamente o novo E3 sem azul de metileno em um canto da caixa de alimentação para evitar danificar as larvas.

Alternativamente, as larvas podem ser divididas em tanques de três litros com água do sistema e colocadas como uma unidade de sistema autônoma com um baixo fluxo de água. Essa alternativa economiza o tempo necessário para o processo de limpeza diária, e o sistema de filtragem ajuda a manter as larvas saudáveis até o ponto final. No dia 13, prepare os pratos de coleta de acordo com o número de condições experimentais que foram estabelecidas.

Despeje E3 suficiente sem azul de metileno para cobrir o fundo de cada prato. Em seguida, com cuidado, usando o sistema de vácuo, aspirar a água das caixas de alimentação. Quando o nível da água começar a ficar baixo, levante lentamente a caixa de alimentação para fazer as larvas nadarem para um dos cantos e, em seguida, aspirar na direção oposta.

Uma vez que apenas cerca de 20 a 30 mililitros do líquido permanecem, decante cuidadosamente as larvas na placa de Petri da coleção preparada e coloque a fita rotulada da caixa de alimentação na tampa do prato. Em um estereomicroscópio de fluorescência, examine as larvas anestesiadas em busca de marcadores fluorescentes desejados. Em seguida, adicione tricaine E3 nas câmaras do dispositivo de ferimento e aprisionamento.

Remova as bolhas de ar das câmaras e do canal de contenção usando uma micropipeta P-200. Remova todo o excesso de tricaina E3, deixando apenas volume suficiente para encher as câmaras. Em seguida, transfira uma larva anestesiada para a câmara de carga do dispositivo de enrolamento e aprisionamento e posicione-a para imagens do lobo esquerdo usando uma ferramenta de cílios.

Fotografe a morfologia de todas as células necessárias no fígado sob um microscópio confocal, conforme descrito no manuscrito do texto. Abra o software Fiji. Em seguida, abra o arquivo de imagem e marque a opção Dividir canais na guia Opções de importação de formato biológico.

Depois de criar projeções de intensidade máxima para cada canal, crie um ROI em torno do fígado larval e meça a área do fígado. Em seguida, adicione uma barra de escala como referência e crie um segundo ROI, incluindo a área do fígado e 75 micrômetros da área circundante. No menu Plug-ins, selecione a opção Analisar seguida de Contador de células e conte as células imunes dentro da área de recrutamento.

Registre o número de células imunes recrutadas em uma planilha. Calcule as densidades de neutrófilos, macrófagos e células T normalizando o número de células imunes por área hepática. Larvas de peixe-zebra HCC alimentadas com dieta normal não apresentam esteatose hepática, conforme medido pela coloração Oil Red O.

No entanto, larvas de CHC alimentadas com HCD mostram um aumento significativo na esteatose hepática. Após oito dias de exposição a um excedente de colesterol, o aumento do fígado foi observado em larvas de CHC. Para avaliar a hepatomegalia, a área hepática, a área de superfície hepática e o volume hepático foram avaliados.

No CHC associado à esteato-hepatite não alcoólica, a área dos hepatócitos, juntamente com a área nuclear, e a relação nuclear-citoplasmática foram aumentadas. Uma diminuição significativa na circularidade nuclear também foi observada no grupo de CHC alimentado com dieta rica em gordura. Utilizando o marcador H2B-mCherry, uma maior incidência de micronúcleos foi detectada nas larvas de CHC alimentadas com HCD.

A avaliação da vasculatura hepática mostrou um aumento significativo na densidade dos vasos em larvas de CHC alimentadas com HCD. A infiltração de macrófagos e neutrófilos ocorreu tanto no CHC quanto no HCC alimentados com larvas de HCD. A quantificação de neutrófilos em macrófagos no fígado e suas proximidades mostrou um aumento significativo no número e densidade das células em larvas de CHC alimentadas com HCD.

Em contraste, uma diminuição significativa na densidade de células T no número total foi observada em larvas de CHC alimentadas com HCD. A limpeza dos tanques e a alimentação são os passos mais importantes para garantir a viabilidade das larvas e evitar o desenvolvimento de esteatose ou inflamação crônica hepática e sistêmica nos controles devido à má qualidade da água ou alimentação inadequada. Outros métodos, como a microscopia de lapso de tempo e a análise da interação entre as diferentes células que povoam o fígado, podem ser realizados.

Além disso, a busca de RNA de célula única de fígados dissecados em diferentes estágios de câncer de fígado pode ser realizada para entender na íntegra como o cenário imunológico do fígado evolui com a progressão da doença.