Name: Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Explore a modelagem de carcinoma hepatocelular associado à NASH em larvas de peixe-zebra usando dieta rica em colesterol e microscopia confocal. Este protocolo permite analisar o microambiente hepático e a infiltração de células imunes durante a hepatocarcinogênese precoce de forma não invasiva.

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O autor gostaria de agradecer aos técnicos da Faculdade de Medicina Albert Einstein Zebrafish Core Facility, Clinton DePaolo, e Spartak Kalinin pela assistência e manutenção de nossas linhas de zebrafish. A FJMN é apoiada pelo Cancer Research Institute e pela Fibrolamellar Cancer Foundation.

<ol><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease-Related+Hepatocellular+Carcinoma%3A+A+Problem+of+Growing+Magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminals+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude.</a> Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>El-Serag, H. B., Kanwal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+hepatocellular+carcinoma+in+the+United+States%3A+where+are+we%3F+Where+do+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go.</a> Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).</li>
<li>Estes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+NAFLD+disease+burden+in+China%2C+France%2C+Germany%2C+Italy%2C+Japan%2C+Spain%2C+United+Kingdom%2C+and+United+States+for+the+period+2016-2030%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030.</a> Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).</li>
<li>Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+epidemic+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+demonstrates+an+exponential+increase+in+burden+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease.</a> Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).</li>
<li>Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+innate+immune+response+in+non-alcoholic+Fatty+liver+disease%3A+metabolic+complications+and+therapeutic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools.</a> Frontiers in Immunology. 5, 177(2014).</li>
<li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+non-alcoholic+steatosis+to+steatohepatitis+and+fibrosis+parallels+cumulative+accumulation+of+danger+signals+that+promote+inflammation+and+liver+tumors+in+a+high+fat-cholesterol-sugar+diet+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 193(2015).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAFLD+causes+selective+CD4%28%2B%29+T+lymphocyte+loss+and+promotes+hepatocarcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis.</a> Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).</li>
<li>Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+drugs+for+NAFLD%3A+lessons+from+basic+models+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic.</a> Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).</li>
<li>Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There+is+something+fishy+about+liver+cancer%3A+Zebrafish+models+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).</li>
<li>Goessling, W., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+important+tool+for+liver+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An important tool for liver disease research.</a> Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).</li>
<li>Huo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiles+of+tumor-associated+neutrophils+reveal+prominent+roles+in+enhancing+angiogenesis+in+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish.</a> Science Reports. 9 (1), 1509(2019).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+neutrophils+and+macrophages+promote+gender+disparity+in+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Capece, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+microenvironment+in+hepatocellular+carcinoma%3A+A+pivotal+role+for+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages.</a> Biomed Research International. 2013, 187204(2013).</li>
<li>de Oliveira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+modulates+innate+immune-mediated+inflammation+and+early+progression+of+NAFLD-associated+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+device+for+improved+experimental+manipulation+of+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+entrapment+device+for+imaging+live+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chemical+inhibitors+of+beta-catenin-driven+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose+leads+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+that+is+reversed+by+mechanistic+target+of+rapamycin+%28mTOR%29+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition.</a> Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).</li>
<li>Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid-enriched+diet+induces+hepatic+steatosis+and+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+directly+induces+acute+inflammasome-dependent+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation.</a> Nature Communication. 5, 5864(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Com um aumento da incidência de CHC, especificamente o CHC induzido por NASH, é de grande importância ter modelos mais eficientes para estudar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no CHC associado à NASH. A deconvolução das interações célula-célula no fígado é crucial para entender melhor a progressão da doença hepática e a hepatocarcinogênese. A abordagem descrita neste protocolo oferece uma maneira única de analisar a progressão da doença hepática in vivo e de forma não invasiva.
A preparação da dieta é fundamental para o sucesso do estabelecimento de um modelo de CHC associado à NASH. É importante deixar o éter dietílico evaporar completamente dentro do exaustor para evitar efeitos nocivos, enquanto prepara dietas para o peixe-zebra. Para usar essas dietas com larvas (5-12 dias após a fertilização), é extremamente importante moer as dietas em partículas finas para garantir a ingestão de alimentos pelas larvas. O uso de análogos de ácidos graxos marcados fluorescentemente pode ser usado para avaliar a ingestão de alimentos em larvas.
Antes de colocar as larvas nas caixas de reprodução e iniciar o procedimento de alimentação, é crucial garantir que a amostragem experimental seja uniformizada pela mistura de larvas de diferentes placas. Essa etapa é importante, uma vez que diferentes microambientes, a partir do Dia 0, são promovidos em cada uma das placas e podem afetar a resposta inflamatória.
Outro passo importante é contar as larvas, para saber quanto alimento é necessário para cada caixa de alimentação. Se a quantidade de alimento não for adequada para o número de larvas presentes em cada caixa, ocorrerá um dos dois cenários: 1) as larvas serão subalimentadas; 2) as larvas serão superalimentadas. A alimentação imprecisa levará a condições insalubres associadas à desnutrição ou supernutrição, como inflamação, o que afetará drasticamente o microambiente hepático. Se ocorrer uma alimentação imprecisa, as larvas mostrarão problemas de movimento. Nesta fase de desenvolvimento, as larvas devem nadar intensamente, portanto, se os problemas de movimento forem notados, as larvas foram criadas em condições insalubres (desnutrição ou exposição a doses tóxicas de colesterol devido à superalimentação). Por esta razão, os procedimentos de alimentação precisam ser rigidamente controlados para ambas as dietas, normal e colesterol enriquecido. Alguns ensaios podem ser realizados para abordar rapidamente a precisão da alimentação e da saúde das larvas, incluindo a presença de hepatomegalia (tamanho do fígado) e inflamação de tecidos e órgãos, particularmente fígado e intestino (aumento visível da infiltração de neutrófilos e macrófagos).
A limpeza diária e a substituição de 95% do E3 são fundamentais para reduzir o crescimento de microrganismos nas caixas de alimentação e melhorar a saúde e a sobrevivência das larvas. Alternativamente, as larvas podem ser colocadas em um sistema de rack autônomo. Para melhores resultados, coloque 60-80 larvas em um tanque de 3 litros. Mantenha o fluxo de água no nível mínimo, ajustando o fluxo para um modo de gotejamento rápido e alimentando as larvas com 3-4 mg duas vezes ao dia (AM e PM). O fluxo de água deve ser verificado regularmente para garantir o fluxo correto em cada tanque. Em nosso laboratório, este método nos dá 95-100% de sobrevivência com alimentação de curto prazo de 10% de HCD. Além disso, esse método reduziu consideravelmente a carga de trabalho inerente à limpeza diária e à troca de água necessária no protocolo de alimentação estática descrito.
Enquanto utilizamos uma dieta enriquecida com colesterol a 10% para induzir a EHNA em uma exposição de curto prazo (5 dias é suficiente para induzir esteato-hepatite), alterações na dieta podem ser realizadas e expandidas para usar frutose 18, ácidos graxos (como o ácido palmítico)19 ou protocolos de alimentação que podem ser estendidos usando uma dieta enriquecida com colesterol a 4%20. Atualmente, existem poucos alvos terapêuticos bem-sucedidos para CHC e nenhum para NASH. O uso de modelos de peixe-zebra oferece uma oportunidade única para expandir nosso conhecimento sobre hepatocarcinogênese, mas também um sistema de vertebrados inparalelo para realizar grandes rastreios de drogas de rendimento. As técnicas descritas neste protocolo facilitarão achados futuros e alvos terapêuticos para doença hepática e hepatocarcinogênese.

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um câncer agressivo com opções terapêuticas limitadas. Verificou-se que mais de 30% de todos os pacientes com CHC são obesos e apresentam EHNA, uma forma agressiva deDHGNA 1,2,3,4. O consumo de dietas ricas em calorias aumenta drasticamente a disponibilidade de ácidos graxos que causam mudanças metabólicas locais e sistêmicas e desencadeiam esteatose, lesão de hepatócitos, inflamação e fibrose - todas as principais características da NASH. A progressão da NASH para CHC envolve o acúmulo de lipídios no fígado, o que desencadeia inflamação e alteração da composição das células imunes 5,6,7. É de particular interesse e importância entender como o microambiente hepático e a paisagem das células imunes são alterados durante a progressão da doença hepática e como ela muda devido a certos fatores etiológicos. Para identificar melhor o impacto que o excesso de colesterol tem no microambiente hepático e na paisagem das células imunes, desenvolvemos um modelo único de peixe-zebra de CHC associado à NASH. O uso deste modelo nos deu uma melhor compreensão do impacto da dieta e da supernutrição no microambiente hepático e na progressão da doença hepática.
Modelos de mamíferos, como camundongos e amostras de tecido humano, têm sido essenciais para a compreensão da patogênese da esteato-hepatite e esteatose8. Os ratos são o modelo preferido para doenças hepáticas e câncer, mas eles não têm clareza óptica em nível celular, enquanto as amostras de tecido humano muitas vezes não têm o ambiente 3D que os modelos animais são capazes de imitar. Esses obstáculos fizeram do peixe-zebra um modelo poderoso na comunidade de pesquisa. O peixe-zebra tem semelhanças notáveis com os seres humanos, com pelo menos 70% de conservação genética. Mantêm o microambiente hepático, a composição celular hepática, a função, a sinalização e a resposta às lesões 9,10. Usando uma dieta rica em colesterol (HCD) em combinação com um modelo estabelecido de CHC de peixe-zebra transgênico, desenvolvemos um modelo de peixe-zebra de CHC associado à NASH.
Aqui apresentamos um protocolo explicando como gerar um modelo de peixe-zebra HCC associado à NASH e como estudar o microambiente hepático e abordar as características malignas precoces in vivo. Usando microscopia confocal não invasiva em combinação com linhagens transgênicas de peixe-zebra com membrana e núcleo de hepatócitos marcados fluorescentemente, podemos abordar as características de malignidade precoce analisando a morfologia hepática (área, volume e área de superfície), morfologia celular e nuclear (área de hepatócitos, área nuclear, relação N:C, circularidade nuclear, pontuação de micronúcleos/hérnia nuclear) e angiogênese (densidade dos vasos). O microambiente de células imunes também é uma característica importante na hepatocarcinogênese 11,12,13,14, portanto, também mostramos como analisar a composição de células imunes hepáticas em larvas de CHC associadas à NASH, usando linhagens transgênicas de zebrafish com células imunes marcadas (neutrófilos, macrófagos e células T). As técnicas descritas são exclusivas do modelo e extremamente úteis para avaliar o microambiente hepático e a composição das células imunes na progressão da doença hepática.

<table><tbody><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>Facilmente degradado. Loja -20&deg;C.</td></tr><tr><td>Kit de suporte Corning Netwells 15 mm</td><td>Fisher</td><td>07-200-223</td><td></td></tr><tr><td>Inserções Corning Netwells</td><td>Fisher</td><td>07-200-212</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Fisher</td><td>60-046-380</td><td>Altamente Volátil.</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #55 dumostar</td><td>Fisher</td><td>NC9504088</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in</td><td>Fisher</td><td>22-183624</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeído (PFA)</td><td>Ciência da Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Dieta Golden Pearl 5&ndash; 50 nm Active Spheres</td><td>Brine Shrimp</td> <td>Direct-Qualquer</td> <td>alimento comercial em pó seco para larvas pode ser usado.</td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência Graduada</td><td>Fisher</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4, 10X, Pacote com 10</td> Placas de Petri <td>Crystalgen</td><td>221-1422-10</td><td></td></tr><tr><td>100X20MM</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Solução de óleo vermelho O 0,5% isopropanol</td><td>Sigma</td><td>O1391-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vactrap</td><td>VWR</td><td>76207-630</td><td>Sistema de vácuo para coleta de larvas</td></tr><tr><td>Microscópios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td> <td>fluorescenteLeica</td><td>M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Confocal</td><td>Microscópio Nikon</td><td>Nikon CSU-W1</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>S9i com base</td><td></td> transiluminada</tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Programa de processamento de imagem Java de código aberto.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.6</td><td>Bitplane; Instrumentos de Oxford.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise do microambiente hepático durante a progressão precoce do carcinoma hepatocelular associado à doença hepática gordurosa não alcoólica em peixe-zebra.

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

O câncer de fígado é atualmente a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo, e o carcinoma hepatocelular (CHC) é responsável por 75-90% de todos os casos de câncer de fígado. Com a introdução de tratamentos eficazes para prevenir e tratar a hepatite B / C, a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e a forma mais agressiva conhecida como esteato-hepatite não alcoólica (NASH), estão rapidamente se tornando os fatores de risco número um para desenvolver CHC nas sociedades modernas. Para entender melhor o papel que a NASH tem no desenvolvimento do HCC, projetamos um peixe-zebra HCC associado ao NASH. A clareza óptica e a tratabilidade genética das larvas de peixe-zebra as tornam um modelo atraente e poderoso para estudar o microambiente hepático e a composição das células imunes usando imagens vivas fluorescentes não invasivas. Este protocolo descreve como usar um modelo de peixe-zebra HCC associado à NASH para investigar o efeito do excesso de colesterol no microambiente hepático e seu impacto na composição de células imunes nos estágios iniciais da doença. Primeiro, alimentamos larvas de CHC (s704Tg), que expressam beta-catenina ativada específica para hepatócitos, com uma dieta de colesterol alto a 10% por 8 dias para desenvolver um modelo de CHC associado à NASH. Aqui descrevemos como fazer uso de diferentes linhagens transgênicas para avaliar várias características malignas precoces no fígado por microscopia confocal não invasiva, como área hepática, célula e morfologia nuclear (área de hepatócitos, área nuclear, relação nuclear:citoplasmática (relação N:C), circularidade nuclear, pontuação de micronúcleos/hérnia nuclear) e angiogênese. Em seguida, usando linhas transgênicas com células imunes marcadas (neutrófilos, macrófagos e células T), mostramos como analisar a composição das células imunes do fígado em larvas de CHC associadas à NASH. As técnicas descritas são úteis para avaliar o microambiente hepático e a composição das células imunes nos estágios iniciais da hepatocarcinogênese, mas também podem ser modificadas para estudar tais características em outros modelos de doença hepática.

Ao introduzir uma dieta de colesterol alto a curto prazo em um modelo de peixe-zebra de carcinoma hepatocelular (CHC), que superexpressa uma forma constitutivamente ativa específica de hepatócitos de beta-catenina (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, somos capazes de criar um modelo de vertebrado não mamífero de CHC associado à NASH. A progressão da doença hepática pode ser monitorada precocemente pela medição da esteatose hepática, tamanho do fígado, hepatócito, morfologia nuclear, angiogênese e infiltração de células imunes (Figura 1).
Larvas de CHC alimentadas com uma dieta normal não apresentam esteatose hepática leve, medida pela coloração Oil Red O. No entanto, larvas de CHC alimentadas com dieta rica em colesterol apresentam aumento significativo da esteatose hepática (Figura 2).
Um marcador bem conhecido de doença hepática é a hepatomegalia17. Para avaliar o tamanho do fígado, as larvas de CHC podem ser cruzadas com uma linha transgênica que expressa especificamente um marcador fluorescente nos hepatócitos, como o Tg(fabp10a:H2BmCherry). Para avaliar a hepatomegalia, a avaliação da área hepática (2D), da área de superfície hepática e do volume hepático (3D) é realizada. Após 8 dias de exposição a um excedente de colesterol, observou-se aumento hepático em larvas de CHC (Figura 3).
Usando imagens vivas não invasivas, linhagens de peixes transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em membranas de hepatócitos (como Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) e em núcleos de hepatócitos (como Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) podem ser usadas para avaliar alterações morfológicas celulares e nucleares associadas à malignidade em hepatócitos. A área de hepatócitos foi aumentada no CHC associado à NASH (Figura 4A,B,D), bem como na área nuclear (Figura 4C,E) e na relação nuclear:citoplasmática (Figura 4F). Uma diminuição significativa da circularidade nuclear também foi observada no grupo HCD+HCC (Figura 4G). A lipotoxicidade desencadeia danos ao DNA, uma característica da carcinogênese na presença de micronúcleos. Utilizando o marcador H2B-mCherry observou-se maior incidência de micronúcleos nas larvas do CHC alimentadas com dieta hipercolesterolística (Figura 4H).
A vasculatura hepática pode ser facilmente avaliada em modelos de peixe-zebra usando uma linha marcada transgênica, como Tg (kdrl:mCherry ou Tg(fli:EGFP), que rotulam a vasculatura. Observou-se aumento significativo da densidade dos vasos nas larvas de CHC+HCD (Figura 5).
Para observar a resposta inflamatória desencadeada precocemente no CHC associado à NASH, uma linhagem de peixes transgênicos expressando proteínas fluorescentes em macrófagos e neutrófilos, como Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP), foi cruzada com a linha transgênica do CHC. A infiltração de neutrófilos e macrófagos ocorre tanto no CHC quanto no HCC alimentados com HCD, o que foi avaliado pela quantificação do número e densidade de neutrófilos/macrófagos no fígado e arredores (área circundante até 75μm) (Figura 6A-H). No entanto, o HCC+HCD apresentou um aumento significativo no número e densidade de neutrófilos (Figuras 6F-H). Aos 13 dias após a fertilização, o sistema imunológico adaptativo já está funcional. Usando uma linha de peixes transgênicos expressando proteína fluorescente em células T, como a Tg(lck:EGFP), e em combinação com a linha transgênica HCC; avaliamos o impacto do excesso de colesterol no recrutamento de células T para o fígado. Uma diminuição significativa na densidade de células T e no número total foi observada em larvas de CHC alimentadas com HCD (Figura 6I-K).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Linhagens transgênicas de peixe-zebra</td>
			<td>Referência ZFIN</td>
			<td>Análise</td>
		</tr><tr><td>Casper</td>
			<td>roya9; mitfaw2</td>
			<td>Ose hepática da estese</td>
		</tr><tr><td>Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: Vênus / fabp10a: H2B-mCherry )</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg</td>
			<td>Morfologia hepática</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Vênus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg</td>
			<td>Hepatócitos e morfologia nuclear</td>
		</tr><tr><td>Tg (fabp10a: pt-β-catenin_ cryaa: Vênus; fli: EGFP)</td>
			<td>s704Tg / y1Tg</td>
			<td>Angiogênese</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Vênus;  mfap4: Tomate-CAAX; lyzC:BFP)</td>
			<td>s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg</td>
			<td>Recrutamento de macrófagos e neutrófilos</td>
		</tr><tr><td>Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: Vênus; lck: EGFP)</td>
			<td>s704Tg / cz1Tg</td>
			<td>Recrutamento de células T</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Linhagens transgênicas de peixe-zebra a serem utilizadas em diferentes ensaios.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Número de larvas</td>
			<td>Tamanho da caixa de alimentação</td>
			<td>Quantidade de alimento por dia (mg)</td>
			<td>Volume E3 (ml)</td>
		</tr><tr><td>30-40</td>
			<td>Caixa de reprodução pequena</td>
			<td>3-4</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>60-80</td>
			<td>Caixa de reprodução pequena/grande</td>
			<td>6-8</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>100-150</td>
			<td>Grande caixa de reprodução</td>
			<td>10-15</td>
			<td>500</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Estabelecer condições das caixas de alimentação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fenótipo</td>
			<td>Método de pontuação</td>
		</tr><tr><td>Nenhum</td>
			<td>Núcleos normais, sem micronúcleos ou hérnia</td>
		</tr><tr><td>Moderada</td>
			<td>Baixo número de micronúcleos (menos de 5 por campo de visão) e/ou hérnia</td>
		</tr><tr><td>Moderado / Grave</td>
			<td>Número moderado a elevado de micronúcleos (mais de 5 por campo de visão) e/ou hérnia</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Micronúcleos e Pontuação da Hérnia Nuclear.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de protocolo resumindo as principais etapas experimentais e a abordagem de análise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig02.jpg"> Figura 2: Ensaio de Controle para Esteatose Hepática - Coloração ORO. Larvas de CHC foram alimentadas com dieta normal ou com colesterol alto e coloração Oil Red O (ORO) foi realizada para avaliar a esteatose hepática. (A) Diagrama da placa de 12 poços para realizar a coloração ORO sequencial usando as inserções de poço de malha. (B) Imagem da ferramenta de cílios usada para manipular larvas. (C) Imagens representativas de fígados corados com Vermelho Óleo; Larvas de CHC e HCC+HCD. (D) Gráfico qui-quadrado mostrando porcentagem de larvas com diferentes escores de esteatose hepática. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig03.jpg"> Figura 3: Imagens representativas do tamanho do fígado. Larvas transgênicas de CHC expressando um marcador hepático (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) foram fotografadas ao vivo e de forma não invasiva, em microscópio confocal de disco giratório invertido usando um zWEDGI. (A) Reconstruções 3D representativas de fígados em larvas de CHC e HCC+HCD. (B-D) Gráfico mostrando alterações morfológicas hepáticas, incluindo área hepática (B), área de superfície hepática (C) e volume hepático (D) em larvas de CHC e HCC + HCD. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig04.jpg"> Figura 4: Imagens representativas de hepatócitos e morfologia dos núcleos. Foram fotografadas linhagens transgênicas de CHC expressando proteínas fluorescentes nas membranas dos hepatócitos (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) e nos núcleos dos hepatócitos (Tg(fabp10a:H2B-mCherry). (A-C) Reconstruções 3D representativas dos núcleos de F-actina e hepatócitos de larvas de CHC e HCC+HCD. As pontas de seta abertas mostram núcleos aumentados; as pontas de seta brancas mostram o núcleo com forma alterada; e setas vermelhas mostram micronúcleos e hérnia nuclear. (D-G) Gráficos mostrando médias de parâmetros celulares e nucleares em larvas de 13 dias de idade de CHC e HCC+HCD. (D) Área dos hepatócitos. (E) Área Nuclear. (F) Relação nuclear:citoplasma. (G) Circularidade nuclear. Cada ponto representa médias por larva. Os gráficos de pontos mostram gráficos qui-quadrados médios ±SEM (H) mostrando porcentagem de larvas com diferentes escores de Micronúcleos e Hérnia nuclear. Barra de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig05.jpg"> Figura 5: Imagens representativas da vasculatura hepática. Linhagens transgênicas de CHC expressando proteínas fluorescentes em núcleos de hepatócitos (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) e em células endoteliais (Tg)fli:EGFP)). (A) Reconstruções 3D representativas da vasculatura hepática em larvas de CHC e HCC+HCD. (B-C) Gráfico mostrando o índice de densidade dos vasos por área de superfície hepática (B) volume (C) em larvas de CHC e HCC+HFCD. Os gráficos de pontos mostram a média ±SEM. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig06.jpg"> Figura 6: Imagens representativas da paisagem das células imunes do fígado. Linha de CHC transgênica que expressa proteínas fluorescentes em macrófagos e neutrófilos (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) ou em células T (Tg(lck-EGFP). (A, C, F) Reconstruções 3D representativas de fígados e recrutamento de leucócitos para a área hepática em larvas de CHC e HCC + HCD de 13 dias de idade. (B) Diagrama da área do fígado fotografada. (D-E) Gráfico mostrando a densidade (D) e o número (E) de macrófagos na área hepática em larvas de CHC e HCC+HCD. (G-H) Gráfico mostrando a densidade (G) e o número (H) de neutrófilos na área hepática em larvas de CHC e HCC+HCD. (G) Reconstruções 3D representativas do recrutamento de células T para a área do fígado em larvas de CHC e HCC + HCD. (H-I) Gráfico mostrando a densidade de células T (H) e o número (I) na área do fígado em larvas de CHC e HCC + HCD. Os gráficos de pontos mostram a média ±SEM. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela Suplementar 1: Tabela de Buffers e Soluções <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/JoVE_Table_of_buffersandsolutions.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Aqui, apresentamos como gerar um modelo de peixe-zebra associado ao Carcinoma Hepatocelular (CHC) associado à doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) para estudar o impacto do excedente de colesterol no microambiente hepático e na paisagem das células imunes.

Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra.

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Nossos modelos e protocolo de câncer de fígado de peixe-zebra oferecem uma oportunidade única de visualizar in vivo, de forma não invasiva, o microambiente hepático e a paisagem imunológica usando microscopia intravital. A transparência das larvas de peixe-zebra é, sem dúvida, a principal vantagem deste sistema, que nos permite realizar microscopia intravital não invasiva e obter informações sobre o microambiente e a infiltração de células imunes de um tecido e órgão profundos, como o fígado. Nosso modelo nefrótico induzido por dieta e as técnicas de imagem descritas neste protocolo podem ser facilmente aplicadas às interações célula-célula complicadas em outras doenças hepáticas ou campos de pesquisa, incluindo síndrome metabólica e doenças cardiovasculares.Demonstrando o procedimento estarão Cassia Michael, nossa técnica de laboratório, e o Dr. Francisco Juan Martinez-Navarro, um pós-doutorado em meu laboratório. Para começar, pese quatro gramas de dieta comercial de alimentos secos para larvas de peixe-zebra em dois copos de vidro de 25 mililitros, um para dieta normal e outro para a dieta de colesterol 10% alto, ou HCD. Pese 0,4 gramas de colesterol em um copo de vidro de 10 mililitros e cubra o copo com papel alumínio.Em um exaustor, meça cinco mililitros de éter dietílico usando uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 20. Em seguida, adicione o éter dietílico ao copo da dieta normal e misture-o imediatamente com o alimento seco usando uma espátula. Meça outros cinco mililitros de éter dietílico usando a mesma seringa e agulha e adicione-o ao copo contendo HCD.Misture imediatamente aspirando para cima e para baixo com a seringa. Adicione rapidamente a solução de colesterol ao copo HCD e misture-a imediatamente com uma espátula até que a solução esteja uniforme. Deixe os copos no exaustor por até 24 horas para evaporar completamente o éter dietílico.No dia seguinte, moa as dietas em partículas finas usando pilão e argamassa. Transfira cada dieta para um pequeno saco plástico rotulado ou um tubo de centrífuga de 50 mililitros e armazene-os a menos 20 graus Celsius. Configure linhas de peixes transgênicos no dia menos um.No dia zero, colete ovos em um coador de malha depois que o peixe tiver desovado. Usando um frasco de lavagem com E3, lave bem os ovos e transfira-os cuidadosamente para placas de Petri de 10 centímetros com meio E3. Limpe as placas de todos os detritos que possam ter se acumulado nas caixas de reprodução, incluindo quaisquer ovos mortos ou não fertilizados para evitar o crescimento descontrolado de microrganismos e consequentes defeitos no desenvolvimento das larvas.Em seguida, divida os ovos a uma densidade de 70 ou 80 ovos por prato contendo 25 mililitros de E3. No primeiro dia, verifique e limpe embriões mortos ou embriões com defeitos de desenvolvimento sob um escopo de dissecação equipado com uma base de transiluminação. No quinto dia, misture as larvas de todos os pratos em uma placa de Petri de 15 centímetros e adicione E3 sem azul de metileno. Divida as larvas nas caixas de alimentação e alimente-as conforme descrito no manuscrito do texto.Mantenha as larvas na sala de peixes-zebra ou em uma incubadora a 28 graus Celsius em um ciclo de luz escura e alimente-as duas vezes ao dia do dia 5 ao dia 12. Remova os detritos alimentares diariamente, bem como 90 a 95% do meio usando um sistema de vácuo ligado a uma ponta de pipeta de um mililitro. Em seguida, despeje cuidadosamente o novo E3 sem azul de metileno em um canto da caixa de alimentação para evitar danificar as larvas.Alternativamente, as larvas podem ser divididas em tanques de três litros com água do sistema e colocadas como uma unidade de sistema autônoma com um baixo fluxo de água. Essa alternativa economiza o tempo necessário para o processo de limpeza diária, e o sistema de filtragem ajuda a manter as larvas saudáveis até o ponto final. No dia 13, prepare os pratos de coleta de acordo com o número de condições experimentais que foram estabelecidas.Despeje E3 suficiente sem azul de metileno para cobrir o fundo de cada prato. Em seguida, com cuidado, usando o sistema de vácuo, aspirar a água das caixas de alimentação. Quando o nível da água começar a ficar baixo, levante lentamente a caixa de alimentação para fazer as larvas nadarem para um dos cantos e, em seguida, aspirar na direção oposta.Uma vez que apenas cerca de 20 a 30 mililitros do líquido permanecem, decante cuidadosamente as larvas na placa de Petri da coleção preparada e coloque a fita rotulada da caixa de alimentação na tampa do prato. Em um estereomicroscópio de fluorescência, examine as larvas anestesiadas em busca de marcadores fluorescentes desejados. Em seguida, adicione tricaine E3 nas câmaras do dispositivo de ferimento e aprisionamento.Remova as bolhas de ar das câmaras e do canal de contenção usando uma micropipeta P-200. Remova todo o excesso de tricaina E3, deixando apenas volume suficiente para encher as câmaras. Em seguida, transfira uma larva anestesiada para a câmara de carga do dispositivo de enrolamento e aprisionamento e posicione-a para imagens do lobo esquerdo usando uma ferramenta de cílios.Fotografe a morfologia de todas as células necessárias no fígado sob um microscópio confocal, conforme descrito no manuscrito do texto. Abra o software Fiji. Em seguida, abra o arquivo de imagem e marque a opção Dividir canais na guia Opções de importação de formato biológico.Depois de criar projeções de intensidade máxima para cada canal, crie um ROI em torno do fígado larval e meça a área do fígado. Em seguida, adicione uma barra de escala como referência e crie um segundo ROI, incluindo a área do fígado e 75 micrômetros da área circundante. No menu Plug-ins, selecione a opção Analisar seguida de Contador de células e conte as células imunes dentro da área de recrutamento.Registre o número de células imunes recrutadas em uma planilha. Calcule as densidades de neutrófilos, macrófagos e células T normalizando o número de células imunes por área hepática. Larvas de peixe-zebra HCC alimentadas com dieta normal não apresentam esteatose hepática, conforme medido pela coloração Oil Red O.No entanto, larvas de CHC alimentadas com HCD mostram um aumento significativo na esteatose hepática. Após oito dias de exposição a um excedente de colesterol, o aumento do fígado foi observado em larvas de CHC. Para avaliar a hepatomegalia, a área hepática, a área de superfície hepática e o volume hepático foram avaliados.No CHC associado à esteato-hepatite não alcoólica, a área dos hepatócitos, juntamente com a área nuclear, e a relação nuclear-citoplasmática foram aumentadas. Uma diminuição significativa na circularidade nuclear também foi observada no grupo de CHC alimentado com dieta rica em gordura. Utilizando o marcador H2B-mCherry, uma maior incidência de micronúcleos foi detectada nas larvas de CHC alimentadas com HCD.A avaliação da vasculatura hepática mostrou um aumento significativo na densidade dos vasos em larvas de CHC alimentadas com HCD. A infiltração de macrófagos e neutrófilos ocorreu tanto no CHC quanto no HCC alimentados com larvas de HCD. A quantificação de neutrófilos em macrófagos no fígado e suas proximidades mostrou um aumento significativo no número e densidade das células em larvas de CHC alimentadas com HCD.Em contraste, uma diminuição significativa na densidade de células T no número total foi observada em larvas de CHC alimentadas com HCD. A limpeza dos tanques e a alimentação são os passos mais importantes para garantir a viabilidade das larvas e evitar o desenvolvimento de esteatose ou inflamação crônica hepática e sistêmica nos controles devido à má qualidade da água ou alimentação inadequada. Outros métodos, como a microscopia de lapso de tempo e a análise da interação entre as diferentes células que povoam o fígado, podem ser realizados.Além disso, a busca de RNA de célula única de fígados dissecados em diferentes estágios de câncer de fígado pode ser realizada para entender na íntegra como o cenário imunológico do fígado evolui com a progressão da doença.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Para ajudar a avaliar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração hepática impulsionada pela via biliar do peixe-zebra, estabelecemos um modelo de lesão hepática no qual os hepatócitos que expressam nitroredutase são geneticamente ablacionados após o tratamento com metronidazol.  Neste protocolo, descrevemos como manipular, monitorar e analisar habilmente a ablação de hepatócitos e a regeneração hepática conduzida por vias biliares.

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

A fibrose sustentada com deposição de proteínas excessivas da matriz extracelular leva à cirrose. O abuso de álcool é uma das principais causas de doença hepática grave. Estabelecemos um modelo de fígado fibrótico de peixe-zebra induzido por etanol para estudar os mecanismos e estratégias de promoção da regeneração de hepatócitos após lesão induzida por álcool.

Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

O peixe-zebra está emergindo como um modelo valioso de processamento de lipídios na dieta e doenças metabólicas. São descritos protocolos de alimentação de larvas ricas em lipídios, imagens ao vivo de análogos lipídicos fluorescentes da dieta e quantificação da ingestão de alimentos. Essas técnicas podem ser aplicadas a uma variedade de técnicas de triagem, imagem e investigação orientada por hipóteses.

Alto teor de gordura Alimentação Paradigma para larval Zebrafish: Alimentação, Imagens ao vivo, e quantificação da ingestão de alimentos

Este protocolo descreve análises histológicas dos fígados de larvas de peixe-zebra que foram tratadas com etanol a 2% durante 24 h. Tal tratamento com etanol agudo resulta em esteatose hepática e inchaço da vasculatura hepática.

Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

Aqui demonstramos um método para quantificar o tamanho do fígado em zebrafish larval, fornecendo uma maneira de avaliar os efeitos das manipulações genéticas e farmacológicas no crescimento e desenvolvimento do fígado.

Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

A matriz extracelular recelularizada de um fígado de rato descelularizado pode ser usada como um modelo ex vivo tridimensional humanizado para estudar a distribuição e expressão transgênica de um vírus ou vetor viral.

Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2

A capacidade dos clones metastáticos de colonizar locais distantes depende de sua capacidade de proliferação e/ou de sua capacidade de sobreviver no microambiente hospedeiro sem proliferação significativa. Aqui, apresentamos um modelo animal que permite a visualização quantitativa de ambos os tipos de colonização hepática por clones metastáticos.

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Nós descrevemos em detalhe um modelo clinicamente relevante do tumor das metástases do fígado do cancro colorretal (crlm) e a influência do reperfusão da isquemia do fígado (I/R) no crescimento e na metástase do tumor. Este modelo pode ajudar a compreender melhor os mecanismos subjacentes à promoção cirurgia-induzida do crescimento metastático do fígado.

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Modelos ortotópicos de camundongos de melanoma uveal uveal uveal do fígado foram criados usando técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica com esquema tumoral derivado do paciente e técnicas de injeção de agulha com linhas de células de melanoma uveal humana cultivadas.

Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes

Explore a modelagem de carcinoma hepatocelular associado à NASH em larvas de peixe-zebra usando dieta rica em colesterol e microscopia confocal. Este protocolo permite analisar o microambiente hepático e a infiltração de células imunes durante a hepatocarcinogênese precoce de forma não invasiva.

Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra. (Vídeo) | JoVE Journal

Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra.

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