Name: Modelando os efeitos do estresse hemodinâmico em células tumorais circulantes usando uma seringa e agulha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprenda a modelar efeitos de estresse hemodinâmico em células tumorais circulantes usando seringa e agulha. Este método simples permite estudar viabilidade celular e resistência mecânica na metástase.

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O desenvolvimento do modelo demonstrado aqui foi apoiado pela concessão do DOD W81XWH-12-1-0163, o NIH concede R21 CA179981 e R21 CA196202, e o Fundo de Pesquisa de Metástase Sato.

1. Preparação celular
<ol><li>Libere células do prato de cultura tecidual quando 70-90% confluentes seguindo as diretrizes recomendadas para a linha celular em uso.<ol>
<li>Por exemplo, aspire o meio de crescimento para células PC-3, e lave o prato de 10 cm de células com 5 mL de soro fisco sem fosfato e 5 mL de salina tamponada sem cálcio e magnésio (PBS).</li>
		<li>Aspire o PBS antes de adicionar 1 mL de trippsina de 0,25% usando o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Após observar o descolamento das células sob um microscópio invertido, adicione 5 mL de DMEM:F12 médio contendo 10% de soro bovino fetal para inibir a trippsina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a suspensão da célula em um tubo cônico.</li>
	<li>Determine a concentração celular e o número total da célula.</li>
	<li>As células de pelotas por centrifugação (300 × g por 3 min), aspiram o supernasce, e resuspendam células em cultura tecidual livre de soro para 5 × 105 células/mL. NOTA: É fundamental que o meio de ensaio contenha pelo menos 1,17 mM Ca++ como ca++ extracelular foi demonstrado ser necessário para resistência celular ao FSS15.</li>
</ol>2. Exposição de estresse de calha de fluidos
<ol><li>Antes de expor células ao FSS, corte um tubo de poliestireno de 14 mL na linha de 7 mL. Misture a suspensão celular, coloque 5 mL da suspensão no tubo de corte e colete amostras de controle estático. NOTA: O volume necessário para coletar para a amostra estática depende do ensaio de viabilidade utilizado (ver etapa 3).</li>
	<li>Desenhe a suspensão da célula em uma seringa de 5 mL e conecte uma agulha de 30 G 1/2". Despreste a agulha, coloque a seringa sobre uma bomba de seringa, proteja a seringa e defina a taxa de fluxo para atingir o nível desejado de FSS. NOTA: A Tabela 1 mostra o estresse máximo da cisalhamento da parede para diferentes agulhas e taxas de fluxo, bem como o nível mínimo de FSS dependendo do tamanho da célula (10, 15 e 20 μm). Inspecione a agulha antes de ser usada para garantir que ela não esteja dobrada; se incerto, substitua a agulha por uma nova. A integridade da agulha pode ter um impacto significativo no nível de FSS aplicado.</li>
	<li>Execute a bomba de seringa e colete a amostra de corte no tubo de corte em um ângulo aproximado de 45° para reduzir a espuma. Colete uma amostra dependendo do tipo de ensaio de viabilidade ou das necessidades de ensaio a jusante.<ol>
<li>Remova cuidadosamente a seringa e a agulha da bomba de seringa e use um alicate para remover a agulha da seringa, tomando o cuidado de não tocar na agulha. NOTA: Agulhas não chanfradas podem ser usadas intercambiavelmente com agulhas chanfradas como medida de segurança adicional.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desenhe a suspensão de corte de volta para a seringa, recoloque cuidadosamente a agulha usando alicate e coloque-a de volta na bomba de seringa.</li>
	<li>Repita as etapas 2.3 e 2.4 até que a suspensão da célula tenha sido exposta ao número desejado de pulsos de FSS. NOTA: Para avaliar a capacidade das células de resistir à destruição mecânica da exposição ao FSS, a suspensão celular é tipicamente submetida a 10 pulsos de FSS. No entanto, foi demonstrado que as células começam a se submeter a adaptações biológicas em resposta ao FSS após 2 pulsos24.</li>
</ol>3. Medição de viabilidade
NOTA: A viabilidade pode ser avaliada utilizando ensaios enzimáticos (luciferase, resazurina e WST-1), contando células intactas, citometria de fluxo ou por ensaios clonogênicos.
<ol><li>Para todas as medidas de viabilidade, colete uma amostra antes de expor células à FSS.<ol>
<li>Para ensaios enzimáticos, pegue alíquotas duplicadas de 100 μL e coloque-as em uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Para citometria de fluxo, pegue uma alíquota de 500 μL e coloque-a em um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Para ensaio clonogênico, colete uma alíquota de 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensaio enzimático<ol>
<li>Colete 100 amostras de μL após 1, 2, 4, 6, 8 e 10 pulsos de exposição fss e coloque-as em uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Adicione o substrato desejado e siga o protocolo para o ensaio utilizado:<ol>
<li>Para resazurina, adicione 20 μL de uma solução de 0,15 mg/mL para cada poço. Adicione 20 μL de solução de resazurina de 0,15 mg/mL a poços que contenham 100 μL de meio sozinho. Incubar por 2 h em uma incubadora de cultura de tecido de 37 °C. Meça a absorvância utilizando um leitor de placas capaz de ler fluorescência (579 excitação/ 584 emissão).</li>
			<li>Para células que expressam luciferase, adicione 100 μL de 15 mg/mL D-luciferin a 5 mL de médio. Adicione 100 μL dessa solução a cada poço que contenha células. Aguarde 5 minutos e leia a placa usando um leitor compatível com luminescência.</li>
			<li>Para WST-1, adicione 10 μL de WST-1 a cada poço, incluindo poços contendo apenas meio. Incubar por 4h e, em seguida, ler a absorvância entre 420 e 480 nm usando um leitor de placas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Compare o sinal médio de cada uma das amostras expostas ao FSS com a amostra média de controle estático para obter a porcentagem de células viáveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Citometria de fluxo24<ol>
<li>Colete 500 amostras de μL e coloque-as em tubos de centrífugas de 1,5 mL após 1, 2, 5 e 10 pulsos de FSS.</li>
		<li>Amostras centrífugas (500 × g por 3 min) e descartam os sobrenantes.</li>
		<li>Resuspengue as pelotas com 1 mL de PBS livre de cálcio e magnésio e centrífugue as amostras (300 × g por 3 min).</li>
		<li>Suspenda as pelotas com 500 μL de tampão de triagem celular ativado por fluorescência (FACS) (PBS com albumina de soro bovino de 0,5% e 0,1% de azida de sódio) com a contagem de contas e corantes de membrana impermeáveis ou viáveis, como iodeto de propidium (1,75 μg/mL).</li>
		<li>Determinar a viabilidade comparando a razão de células viáveis, normalizadas à contagem de contas, em amostras desarmadas com a da amostra estática.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensaio clonogênico<ol>
<li>Pegue 100 μL da amostra estática e adicione 900 μL de meio de crescimento para fazer uma diluição de 1:10.</li>
		<li>Pegue 100 μL da amostra diluída de 1:10 e adicione 900 μL de meio de crescimento para fazer uma diluição final de 1:100.</li>
		<li>Adicione 100 μL da amostra de diluição de 1:100 em cada um dos 3 poços de um prato de 6 poços contendo 2 mL de meio de crescimento.</li>
		<li>Repetição de passos 3.4.1-3.4.3 com amostras que foram submetidas a 10 pulsos de FSS.</li>
		<li>Deixe as células crescerem por 7-10 dias sem alterar o meio, e verifique se há formação de colônia. Uma vez formadas colônias de ≥50 células, aspirem o meio de crescimento, enxáguem cada poço com 1 mL de PBS, aspirem o PBS e fixem por 5 min usando 1 mL de etanol gelado de 70% (EtOH). Importante, fixar amostras de tesoura e estática ao mesmo tempo</li>
		<li>Depois de fixar as amostras, aspire o EtOH e adicione 1 a 2 mL de solução violeta cristalina (0,1% violeta cristalina em 90% H2O, 10% EtOH) por 5 min.</li>
		<li>Enxágüe com um excesso de água, e deixe a placa secar</li>
		<li>Conte as colônias (aglomerados de ≥50 células) para as amostras estáticas e desarquivadas. Compare a razão do número médio de colônias da amostra de tesoura com o número médio de colônias da amostra estática para determinar a viabilidade.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+90%25+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+medicine%22%5BJournal%5D)">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+survival+and+extravasation+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravascular survival and extravasation of tumor cells.</a> Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).</li>
<li>Labelle, M., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+hours+of+metastasis%3A+the+importance+of+cooperative+host-tumor+cell+interactions+during+hematogenous+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).</li>
<li>Krog, B. L., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+the+circulating+tumor+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).</li>
<li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+inefficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metastatic inefficiency.</a> Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).</li>
<li>Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+number+of+tumor+metastases%3B+experiments+with+a+transplantable+mouse+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor.</a> Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+quantitative+analysis+of+distribution+and+fate+of+tumor+embolilabeled+with+125+I-5-iodo-2%27-deoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine.</a> Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).</li>
<li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+metastasis+in+lung%3A+cell+survival%2C+dormancy%2C+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li>
<li>Luzzi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+nature+of+metastatic+inefficiency%3A+dormancy+of+solitary+cells+after+successful+extravasation+and+limited+survival+of+early+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases.</a> American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).</li>
<li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li>
<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+circulating+tumor+cell+capture+ability+of+a+slit+filter-based+method+in+comparison+to+a+selection-free+method+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types.</a> International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031(2020).</li>
<li>Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unifying+metastasis--integrating+intravasation%2C+circulation+and+end-organ+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).</li>
<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
<li>Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+fluid+shear+stress+is+a+conserved+biophysical+property+of+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells.</a> PLoS One. 7 (12), 50973(2012).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>Brass, L. F., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+physics+and+biorheology+in+the+setting+of+hemostasis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).</li>
<li>Stein, P. D., Sabbah, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulent+blood+flow+in+the+ascending+aorta+of+humans+with+normal+and+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).</li>
<li>Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+shear+stress+and+hemodynamic+factors+in+a+model+of+coronary+artery+stenosis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis.</a> The American Journal of Physiology. 265 (5), Pt 2 1787-1796 (1993).</li>
<li>Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixing%2C+aeration+and+cell+damage%2C+30%2B+years+later%3A+what+we+learned%2C+how+it+affected+the+cell+culture+industry+and+what+we+would+like+to+know+more+about%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).</li>
<li>Vennin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trsient+tissue+priming+via+ROCK+inhibition+uncouples+pancreatic+cancer+progression%2C+sensitivity+to+chemotherapy%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis.</a> Science Translational Medicine. 9 (384), 126(2017).</li>
<li>Mitchell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+reduces+circulating+tumor+cell+resistance+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).</li>
<li>Ortiz-Otero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+confer+shear+resistance+to+circulating+tumor+cells+during+prostate+cancer+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression.</a> Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).</li>
<li>Moose, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+resist+mechanical+destruction+in+circulation+via+RhoA%2Factomyosin-dependent+mechano-adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation.</a> Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).</li>
<li>Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+tumour+cell+composition+in+tumours+composed+of+paired+mixtures+of+mammary+tumour+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines.</a> British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).</li>
<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399(1992).</li>
<li>Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cancer+cell+mechanical+properties+after+fluid+shear+stress+exposure%3A+a+micropipette+aspiration+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Health+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study.</a> Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).</li>
<li>Gensbittel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+adaptability+of+tumor+cells+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis.</a> Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).</li>
<li>O'Leary, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+ascorbate+inhibits+pancreatic+cancer+metastases+via+a+peroxide-mediated+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17649(2020).</li>
<li>Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolysis+near+a+transversely+oscillating+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemolysis near a transversely oscillating wire.</a> Science. 169 (3948), 871-873 (1970).</li>
<li>Rooney, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolysis+near+an+ultrasonically+pulsating+gas+bubble%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble.</a> Science. 169 (3948), 869-871 (1970).</li>
<li>Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+inertial+positions+and+viability+of+cells+in+suspension+under+different+in+vivo+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1711(2020).</li>
<li>Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biorheology+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">The biorheology of tumor cells.</a> Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).</li>
<li>Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+cancer+stem+cell-like+phenotype+in+MCF7+breast+cancer+cell+line+without+inducing+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition.</a> Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).</li>
<li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulatory+shear+flow+alters+the+viability+and+proliferation+of+circulating+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 27073(2016).</li>
<li>Fu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+MnSOD+promotes+survival+of+circulating+breast+cancer+cells+and+increases+their+resistance+to+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin.</a> Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+promotes+anoikis+resistance+of+cancer+cells+via+caveolin-1-dependent+extrinsic+and+intrinsic+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+actomyosin-dependent+survival%2Fchemoresistance+of+suspended+tumor+cells+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow.</a> Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).</li>
</ol>

MDH é co-fundador, Presidente e acionista da SynderBio, Inc. DLM é consultor da SynderBio, Inc.

Este artigo demonstra a aplicação de FSS às células cancerígenas em suspensão usando uma seringa e agulha. Usando este modelo, as células cancerígenas têm se mostrado mais resistentes a pulsos breves de FSS de alto nível em relação às células epiteliais não transformadas15,22,24. Além disso, a exposição ao FSS usando este modelo resulta em um rápido aumento da rigidez celular, ativação de RhoA e aumento da contractilidade basead...

A metástase, ou a disseminação do câncer para além do local inicial do tumor, é um fator importante na mortalidade por câncer1. Durante a metástase, as células cancerígenas utilizam o sistema circulatório como uma rodovia para disseminar para locais distantes em todo o corpo2,3. Enquanto estão a caminho desses locais, as células tumorais circulantes (CTCs) existem dentro de um microambiente dinâmico de fluidos diferente do tumor primário original3,4,5. Foi proposto que esse microambiente fluido é uma das muitas barreiras à metástase4. Há ampla concordância no conceito de ineficiência metastática, ou seja, que a maioria dos CTCs que entram na circulação perecem ou não formem colônias metastáticas produtivas6,7,8. No entanto, por que a metástase é ineficiente na perspectiva de um CTC individual é menos certa e continua sendo uma área ativa de investigação. Os CTCs são separados da matriz extracelular, privados de fatores solúveis de crescimento e sobrevivência que podem estar presentes no tumor primário, e expostos ao sistema imunológico e às forças hemodinâmicas de uma maneira muito diferente do tumor primário4. Cada um desses fatores pode contribuir para a má sobrevivência dos CTCs, mas suas contribuições relativas não são claras. Este artigo aborda a questão de como as forças hemodinâmicas afetam os CTCs.
Estudar os efeitos das forças hemodinâmicas nos CTCs é bastante desafiador. Atualmente, não existem sistemas in vitro projetados que possam replicar toda a dinâmica espostetemporal (coração para capilares) e propriedades reológicas do sistema vascular humano. Além disso, a forma como os CTCs experimentam o sistema circulatório não é totalmente clara. Evidências experimentais indicam que a maioria das células cancerígenas não circulam continuamente como células sanguíneas. Em vez disso, devido ao seu tamanho relativamente grande (10-20 μm de diâmetro), a maioria dos CTCs ficam presos em leitos capilares (6-8 μm de diâmetro) para períodos variáveis de tempo (s a dias) onde podem morrer, extravasar ou serem deslocados para o próximo leito capilar8,9,10,11. No entanto, há algumas evidências de que o tamanho do CTC pode ser mais heterogêneo in vivo, e que ctcs menores são detectáveis12. Portanto, com base na distância e na velocidade do fluxo sanguíneo, os CTCs só podem circular livremente por uma questão de segundos entre esses períodos de armadilha, embora falta uma descrição quantitativa desse comportamento13.
Além disso, dependendo de onde os CTCs entram na circulação, eles podem passar por vários leitos capilares no pulmão e outros locais periféricos e através do coração direito e esquerdo antes de chegar ao seu destino final. Ao longo do caminho, os CTCs são expostos a vários estresses hemodinâmicos, incluindo o estresse da cisalhamento de fluidos (FSS), forças compressivas durante sua armadilha na microcirculação e, potencialmente, forças de tração sob circunstâncias onde podem exibir rolamento semelhante a leucócitos ao longo das paredes dos vasos sanguíneos14. Assim, tanto a capacidade de modelar a circulação quanto a compreensão do comportamento do CTC a ser modelado é limitada. Por causa dessa incerteza, quaisquer achados de sistemas de modelos in vitro devem ser validados em um organismo experimental de vertebrados e, finalmente, em pacientes com câncer.
Com as ressalvas acima mencionadas, este artigo demonstra um modelo relativamente simples de aplicar FSS às células em suspensão para sondar os efeitos do FSS nos CTCs descritos pela primeira vez em 201215. FSS resulta do atrito do fluxo sanguíneo contra a parede do vaso, que produz um gradiente de velocidade parabólica sob condições de fluxo laminar em vasos maiores. As células experimentam níveis mais altos de FSS perto de paredes de vasos e níveis mais baixos perto do centro do vaso sanguíneo. Viscosidade fluida, taxa de fluxo e dimensões do conduíte através do qual o fluxo ocorre influenciam FSS, como descrito pela equação de Hagen-Poiseuille. Isso se aplica aos fluxos sanguíneos comportando-se como fluidos newtonianos, mas não se sustenta para a microcirculação. O FSS fisiológico abrange várias ordens de magnitude com os níveis mais baixos nos linfáticos (<1 dyn/cm2) e o mais alto em regiões ao redor de válvulas cardíacas e placas ateroscleróticas (>500 dyn/cm2)5. O estresse médio da tesoura de parede nas artérias é de 10-70 dyn/cm2 e 1-6 dyn/cm2 nas veias16,17.
No coração, as células podem ser expostas a fluxos turbulentos ao redor de folhetos de válvulas onde fss de alto nível, mas de curta duração pode ser experimentado18,19. Embora o campo de bioprocessamento tenha estudado há muito tempo os efeitos da FSS sobre células mamíferas em suspensão, essas informações podem ser de valor limitado para entender os efeitos do FSS nos CTCs, pois geralmente se concentra em níveis muito mais baixos de FSS aplicados ao longo de uma longa duraçãode 20. Como descrito abaixo, usando uma seringa e agulha, pode-se aplicar relativamente alto (dezenas a milhares de dyn/cm2) FSS para uma duração relativamente curta (milissegundos) a uma suspensão celular. Desde a descrição inicial deste modelo15,outros o utilizaram para estudar os efeitos da FSS nas células cancerosas21,22,23. Vários "pulsos" de FSS podem ser aplicados em suspensões celulares em um curto período de tempo para facilitar análises experimentais a jusante. Por exemplo, este modelo pode ser usado para medir a capacidade das células de resistir à destruição mecânica por FSS medindo a viabilidade celular em função do número de pulsos aplicados. Alternativamente, os efeitos da exposição da FSS na biologia das células cancerosas podem ser explorados coletando células para uma variedade de análises a jusante. É importante ressaltar que parte da suspensão celular é reservada como um controle estático para comparar os efeitos do FSS daqueles que podem estar associados ao descolamento celular e tempo mantido em suspensão.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo de 14 mL</td><td>Falcon - Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>30 G Seringa de 1/2"</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>placa inferior preta de 96 poços</td><td>Costar - Detector de</td> bioluminescência Corning <td>3915</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AMI</td><td>AMI HTX</td><td></td></tr><tr><td>BSA, Fraction V</td><td>Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Titer Blue</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>cristal violeta</td><td>Sigma</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>GoldBio</td><td>D-LUCK</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td> Leitor <td>de Placas 10010023</td><td></td> <td>Gibco</td></tr><tr><td></td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Seringa</td><td>Aparelho Harvard</td><td>70-3005</td><td></td></tr></tbody></table>

modelando os efeitos do estresse hemodinâmico em células tumorais circulantes usando uma seringa e agulha

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Durante a metástase, as células cancerígenas de tecidos sólidos, incluindo a epitélia, ganham acesso à circulação linfática e hemógena, onde são expostas ao estresse mecânico devido ao fluxo hemodinâmico. Uma delas salienta que a experiência das células tumorais circulantes (CTCs) é o estresse da tesoura de fluidos (FSS). Embora as células cancerígenas possam experimentar baixos níveis de FSS dentro do tumor devido ao fluxo intersticial, os CTCs são expostos, sem apego à matriz extracelular, a níveis muito maiores de FSS. Fisiologicamente, o FSS varia mais de 3-4 ordens de magnitude, com baixos níveis presentes em linfáticos (<1 dyne/cm2) e os níveis mais altos presentes brevemente à medida que as células passam pelo coração e ao redor das válvulas cardíacas (>500 dynes/cm2). Existem alguns modelos in vitro projetados para modelar diferentes faixas de estresse fisiológico de tesoura ao longo de vários períodos de tempo. Este artigo descreve um modelo para investigar as consequências de pulsos breves (milissegundos) de FSS de alto nível na biologia celular do câncer usando um simples sistema de seringa e agulha.

A resistência elevada à destruição mecânica induzida pelo FSS tem sido anteriormente demonstrada como um fenótipo conservado em múltiplas linhas de células cancerosas e células cancerígenas recém-isoladas de tumores relativos aos comparadores de células epiteliais não transformadas15,24. Aqui, linhas adicionais de células cancerígenas de uma variedade de origens teciduais (Tabela 2) foram testadas para demonstrar que a maioria dessas células apre...

Aqui demonstramos um método para aplicar o estresse da tesoura de fluido às células cancerosas em suspensão para modelar os efeitos do estresse hemodinâmico nas células tumorais circulantes.

Modelando os efeitos do estresse hemodinâmico em células tumorais circulantes usando uma seringa e agulha

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Este protocolo expõe as células cancerígenas em uma suspensão a pulsos breves de estresse de tesoura de fluido para imitar certos aspectos de como as células cancerígenas metastáticas são expostas a forças hemodinâmicas enquanto estão no sistema circulatório. É uma técnica relativamente simples para aplicar pulsos breves de alto nível de estresse de tesoura de fluido. Ao tentar este protocolo, tenha cuidado com agulhas sem tampa e não dobre-as, pois isso mudará o estresse da tesoura de força aplicada.Este procedimento pode produzir aerossóis, por isso use medidas de segurança adequadas. Para começar, solte 70 a 90% de células PC3 confluentes do prato de cultura tecidual aspirando o meio de crescimento e lavando o prato de 10 centímetros com cinco mililitros de PBS livre de cálcio e magnésio. Em seguida, aspire o PBS e adicione um mililitro de 0,25% de trippsina.Pós-trippsinização, observe o desprendimento das células sob um microscópio invertido. Para inibir a trippsina, adicione cinco mililitros de meio DMEM/F12 contendo 10% de FBS. Em seguida, coloque a suspensão celular em um tubo cônico e determine a concentração celular e o número total da célula.Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por três minutos, em seguida, aspirar o supernasal e resuspensar a pelota em um meio de cultura de tecido livre de soro. Corte em torno do fundo do tubo de poliestireno de 14 mililitros na linha de sete mililitros e coloque a suspensão celular mista no tubo de corte. Coletar separadamente amostras de controle estático das células antes da exposição ao estresse da tesoura de fluido para usar para a realização de ensaios.Para expor a amostra restante da suspensão celular ao estresse da tesoura de fluidos, desenhe a suspensão celular em uma seringa de cinco mililitros e conecte uma agulha de meia polegada de calibre 30. Coloque e fixe a seringa com uma agulha sem tampa em uma bomba de seringa e defina a taxa de fluxo para alcançar o nível desejado de estresse de cisalhamento de fluidos. Execute a bomba de seringa e colete a amostra de corte no tubo de corte em um ângulo de aproximadamente 45 graus para reduzir a espuma.Remova cuidadosamente a seringa da bomba de seringa e use alicate para remover a agulha, tomando cuidado para não tocá-la. Repita o procedimento até que a suspensão da célula tenha sido exposta ao número desejado de pulsos de estresse de tesoura de fluido. Realize ensaios de viabilidade com as amostras estáticas antes de expor as células ao estresse da tesoura fluida.Para ensaios enzimáticos, transfira 100 alíquotas de microliter das amostras estáticas em duplicata em uma placa de 96 poços. Em seguida, colete 100 microliters de amostras após a exposição ao estresse da tesoura do fluido e coloque-as em uma placa de 96 poços. Adicione 20 microliters de uma solução de resazurina de 0,15 miligramas por mililitro para cada amostra bem e para poços contendo 100 microliters de médio porte.Incubar as placas do poço na incubadora de cultura tecidual de 37 graus Celsius por duas horas, depois medir a fluorescência e a absorvância usando um leitor de placas e obter a porcentagem de células viáveis comparando o sinal médio de cada uma das amostras expostas ao estresse médio à estática. Da mesma forma, coletar alíquotas de amostras estáticas para realizar citometria de fluxo e ensaios clonogênicos, conforme descrito no manuscrito do texto. Na análise representativa, a viabilidade das células de câncer epitelial da biópsia sinópsica foi avaliada por meio da conversão de resazurina após expor as células a uma série de pulsos de estresse de tesoura fluida.Embora cada linha celular exibisse diferentes perfis de resistência, não houve diferença significativa na viabilidade após 10 pulsos de exposição ao estresse da tesoura fluida. Linhas adicionais de células cancerígenas de uma variedade de origens teciduais demonstraram a viabilidade de mais de 20% após 10 pulsos de estresse de calha de fluidos, com exceção das células MIA PaCa-2, que mostraram uma viabilidade inferior a 10% devido à sensibilidade à destruição mecânica por estresse de calha de fluidos. Ao coletar a amostra estática antes de aplicar o estresse da tesoura dos fluidos, certifique-se de que a suspensão da célula é uma mistura homogênea.Retire cuidadosamente a agulha com alicates e não dobre ou toque na agulha. Além de medir a viabilidade celular, pode-se avaliar mudanças na expressão genética, sinalização celular, proliferação e migração. Usando isso como modelo de exposição ao estresse da tesoura de fluidos, pode-se estudar tanto como as células cancerígenas resistem à destruição pelo estresse da tesoura de fluidos e avaliar os efeitos do estresse da tesoura de fluidos na biologia das células cancerosas.Esta técnica tem sido usada pelo nosso laboratório e outros para explorar os efeitos do estresse da tesoura de fluidos nas células tumorais circulantes. Esses estudos têm demonstrado que o estresse da tesoura de fluido altera rapidamente as propriedades mecânicas das células cancerosas e que isso contribui para a capacidade das células cancerígenas de resistir à destruição pelo estresse da tesoura de fluidos.

modeling-effects-hemodynamic-stress-on-circulating-tumor-cells-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós apresentamos o procedimento para a fabricação e operação de um dispositivo micro que recria heterogêneos microambientes...

Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor<em&gt; In Vitro</em

Fonte: Lim, M., et al. Modelagem de metástases cerebrais por injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2022)Neste vídeo, um camundongo anestesiado é submetido a um procedimento cirúrgico no qual células cancerígenas são injetadas na artéria carótida comum (CCA) para facilitar a entrega direcionada ao cérebro. O procedimento envolve sutura e manipulação precisas das artérias carótidas para direcionar as células injetadas para a artéria carótida interna (ACI),...

Modelagem de metástase de tumor cerebral por meio de injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna

Descrevemos um ensaio de tampão matrigel para ilustrar o potencial angiogênico de um conjunto de fatores secretados por células cancerígenas usando duas modalidades de imagem complementares, ultrassom e endomicroscopia. O matrigel, um gel imitador de matriz extracelular (MEC), é utilizado para introduzir o hospedeiro (camundongo) com fatores angiogênicos secretados para o meio condicionado (CM).

Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido

Este manuscrito descreve o desenvolvimento de um modelo animal que permite testar diretamente os efeitos da hipóxia tumoral na metástase e decifrar os mecanismos de sua ação. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem no sarcoma de Ewing, uma abordagem semelhante pode ser aplicada a outros tipos de tumores.

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Um procedimento cirúrgico foi desenvolvido para entregar células tumorais mamárias ao fígado murino por meio de injeção na veia porta. Este modelo permite a investigação de estágios tardios de metástase hepática em um hospedeiro totalmente imunocompetente, incluindo extravasamento de células tumorais, semeadura, sobrevivência e crescimento metastático no fígado.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

A modelagem da metástase cerebral intracraniana é complicada pela incapacidade de monitorar o tamanho do tumor e a resposta ao tratamento com métodos precisos e oportunos. A metodologia apresentada casais injeção de tumor intracraniano com análise de ressonância magnética, que, quando combinada, cultiva injeções precisas e consistentes, monitoramento animal aprimorado e medições precisas de volume de tumor.

Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Este protocolo apresenta um modelo tumor-on-a-chip fisiologicamente relevante para realizar pesquisa básica e translacional de câncer humano de alto rendimento, rastreamento avançado de drogas, modelagem de doenças e abordagens de medicina personalizada com uma descrição de procedimentos de carregamento, manutenção e avaliação.

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

O artigo descreve um protocolo para simular os perfis de temperatura transiente e a variação espaço-temporal acoplada da pressão do fluido intersticial após o aquecimento fornecido por um sistema de hipertermia por radiofrequência dipolar. O protocolo pode ser utilizado para avaliar a resposta de parâmetros biofísicos que caracterizam o microambiente tumoral a técnicas de hipertermia intervencionista.

Uma abordagem de modelagem computacional para investigar a influência da hipertermia no microambiente tumoral

A técnica de injeção intracraniana estereotáxica permite a implantação precisa e localizada de células tumorais no córtex do camundongo, tornando-se um modelo poderoso para estudar a colonização metastática do cérebro.

Modelagem da Metástase Cerebral: Análise Padronizada da Colonização Metastática e Padrões de Crescimento Histológico por Injeção Intracortical Estereotáxica

Aprenda a modelar efeitos de estresse hemodinâmico em células tumorais circulantes usando seringa e agulha. Este método simples permite estudar viabilidade celular e resistência mecânica na metástase.

Modelando os efeitos do estresse hemodinâmico em células tumorais circulantes usando uma seringa e agulha

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