Estabelecendo Culturas Binárias Estáveis de Saccharibacterias simbióticas da Cavidade Oral
13 de abril de 2021
Demonstramos um método para isolar membros difíceis de crescer do novo filo bacteriano, Saccharibacteria, filtrando placas dentárias e co-culminando com bactérias hospedeiras.
Sacaribacterias são parasitas obrigatórios que requerem co-cultura com bactérias hospedeiras apropriadas. Como sacaribacterias orais humanas podem ser facilmente isoladas para a maioria dos indivíduos usando espécies bacterianas hospedeiras conhecidas. Este protocolo permitirá que qualquer investigador ou laboratório isole suas próprias cepas na cocultura binária.
Esta técnica utiliza dispositivos e equipamentos simples presentes na maioria dos laboratórios microbiológicos e tem sido usada com sucesso para cultivar mais de 30 isolados representando seis espécies de sacaricidades. Este protocolo pode ser útil para o isolamento de outras espécies de radiação seguidas por candidatos, bem como sacaribactérias de diferentes ambientes e outros mamíferos, se os hospedeiros actinobacterianos apropriados puderem ser identificados e isolados. Demonstrando o procedimento estará Andrew Collins, um ex-pós-doutorando do meu laboratório.
Para começar, inicie culturas de bactérias hospedeiras, como a aracnia propionica, com tempo suficiente para que elas cresçam até a fase estacionária precoce. Para iniciar a cultura, inocular de dois a cinco mililitros de caldo de soja tripptic contendo extrato de levedura de 0,1% com propionica de aracnia, e incuba-lo a 37 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, monte os suportes do filtro com membranas de filtro de 0,2 micrômetros gravadas.
Enrole-os em papel alumínio e esterilize por autoclaving, juntamente com tubos de centrífugas e conjuntos de tampas. Esterilize suprimentos extras em caso de contato acidental com superfícies não estéreis. Colete placa dentária raspando ao longo da linha de goma, usando um ponto de papel estéril, curette graciosa ou uma ponta de palito ou pipeta estéril, e transfira-a para um tampão adequado, como MRD ou PBS.
Mantenha a amostra no gelo até que esteja pronto para continuar. Resuspend a placa dentária vigorosamente usando uma combinação de vórtice e pipetação com uma pequena ponta de pipeta, em seguida, adicione a amostra de placa resuspended a um tubo contendo nove mililitros de buffer MRD. Desembrulhe cuidadosamente um conjunto de filtro estéril usando técnica asséptica.
Desembrulhar uma volta de quarto e apertar o suporte do filtro para garantir que os fios estejam bem engatilhados e que o aparelho esteja devidamente fechado. Lave a membrana passando 10 mililitros de tampão MRD através do aparelho, usando uma seringa. Para aplicar a amostra no filtro lavado, remova o êmbolo de uma seringa e conecte-a ao aparelho do filtro.
Coloque um tubo de centrífuga estéril sob o aparelho do filtro para pegar o filtrado, em seguida, despeje a amostra dentária dispersa na seringa e carregue-a no filtro. Em seguida, aplique pressão leve no êmbolo para empurrar a amostra através do filtro. Lave a membrana com mais 10 mililitros de tampão MRD e colete o fluxo através do mesmo tubo da amostra filtrada.
Em seguida, tampar o tubo asepticamente, e manter no gelo. Faça uma marca de orientação no tubo e na tampa para identificar a localização da pelota celular após a centrifugação. Coloque o tubo em uma centrífuga de alta velocidade com a marca na parte superior e centrifugar as amostras a 60.000 G por uma hora a quatro graus Celsius.
Após a centrifugação, despeje cuidadosamente o sobrenante, mantendo a pelota na parte superior do tubo. Em seguida, resuspense a pelota em um a dois mililitros de buffer MRD, vigorosamente vórtice. Prepare tubos de cultura aliquoting dois mililitros de mídia de crescimento apropriada para os tubos.
Em seguida, adicione 200 microliters de cultura noturna de organismos hospedeiros e 100 a 200 microliters de amostra filtrada resuspended a cada tubo. Incubar as amostras combinadas em condições apropriadas para o organismo hospedeiro. Transfira as células a cada dois ou três dias transferindo 200 microliters da cultura binária para dois mililitros de meio de crescimento fresco em um novo tubo.
Se as culturas passagens não mostram crescimento em 200 microliters de cultura hospedeira não infectada, ao passar as células, retornem tubos inoculados para a incubadora. Alíquota de 24 microliters do pcr master mix em um tubo PCR de 0,2 mililitro. Em um microliter de cultura infectada por sacaribacteria, coloque o tubo em um ciclo de thermo.
Defina o programa PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Carregue e execute os produtos PCR em um gel 1%Agros. Uma banda de aproximadamente 600 bases confirmará a presença de sacaribactérias.
Para confirmar a pureza das culturas positivas, realize uma diluição serial de 10 vezes a co-cultura de sacaribacterias em um tampão estéril, e espalhe 100 microliters em uma placa de ágar. Incubar a cultura em condições adequadas de crescimento e observar para contaminar organismos. Uma banda de aproximadamente 600 bases confirmará a presença de sacaribactérias.
A detecção de PCR pode parecer negativa nas culturas iniciais de infecção devido a um baixo número de símbionts de sacaribactérias. No entanto, após algumas passagens, um produto PCR forte deve aparecer, indicando que ocorreu uma infecção estável. Testar várias espécies hospedeiros com o mesmo filtrado de sacaribacteria geralmente terá uma baixa taxa de sucesso.
Como a interação do host simbionte é muito específica. À medida que as culturas infectadas crescem, o crescimento normal do turvo deve aparecer. À medida que a simbiose se estabelece, as culturas infectadas aparecerão menos turvas do que culturas de organismos hospedeiros não infectados.
Uma cultura contaminada pode ser purificada escolhendo colônias infectadas após o revestimento. Colônias infectadas às vezes podem ser identificadas por uma forma irregular de colônia em comparação com colônias não infectadas. A proporção de colônias regulares depende do título de sacaribacterias na cultura binária.
Se o título for baixo, menos colônias parecerão irregulares, facilitando a escolha das colônias infectadas e iniciar uma cultura binária pura. Culturas podem não parecer positivas para várias passagens. Então alguns pacientes serão necessários.
Também é necessário verificar regularmente a contaminação das culturas binárias, pois isso pode desestabilizar a cultura e levar à morte das sacarictérias. A cultura binária pode ser usada para todos os tipos de experimentos de laboratório. DNA e RNA podem ser extraídos para sequenciamento de genoma e análise de transcriptome, respectivamente.
A patogenicidade também pode ser investigada usando modelos animais.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para o isolamento e cultivo de Saccharibacteria, bactérias parasitas obrigatórias do Candidato ao Filo Radiação (CPR), utilizando co-cultivo com bactérias hospedeiras apropriadas. O método permite aos pesquisadores obter culturas binárias de Saccharibacteria e seus hospedeiros a partir de amostras de placa dentária, facilitando estudos fisiológicos e genômicos adicionais desses microrganismos previamente incultiváveis.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Simbiose bacteriana
- Técnicas de cultivo microbiano
Antecedentes
- Muitas espécies bacterianas, incluindo aquelas no CPR, não podem ser cultivadas usando métodos laboratoriais padrão.
- Saccharibacteria são parasitas obrigatórios que requerem cocultivo com bactérias hospedeiras específicas.
- O CPR representa uma porção significativa da diversidade microbiana da Terra.
- Estudar esses organismos em laboratório é essencial para compreender sua fisiologia e papéis ecológicos.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo reprodutível para o isolamento e cultivo de Saccharibacteria a partir de placa dentária.
- Permitir que laboratórios estabeleçam seus próprios cultivos binários de Saccharibacteria e bactérias hospedeiras.
- Facilitar pesquisas futuras sobre a fisiologia, genômica e patogenicidade de Saccharibacteria.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras de placa dentária utilizando instrumentos estéreis.
- Filtração das suspensões de placa através de filtros de 0,2 μm para enriquecer Saccharibacteria.
- Centrifugação para concentrar as células filtradas.
- Cocultivo de Saccharibacteria concentradas com bactérias hospedeiras (por exemplo, Arachnia propionica) em meios de crescimento apropriados.
- Passagens seriadas de culturas binárias para estabelecer infecção estável.
- Confirmação por PCR da presença de Saccharibacteria nas culturas.
- Plaqueamento e triagem de colônias para purificar culturas binárias e verificar contaminações.
Resultados Principais
- O protocolo cultivou com sucesso mais de 30 isolados representando seis espécies de Saccharibacteria.
- Culturas binárias estáveis podem ser estabelecidas e mantidas por meio de repiques seriados.
- A detecção por PCR confirma a presença de Saccharibacteria, com uma banda característica de aproximadamente 600 pb.
- As diferenças na morfologia das colônias podem auxiliar na identificação de colônias infectadas para purificação.
Conclusões
- Este protocolo permite o isolamento e a manutenção rotineiros de Saccharibacteria em laboratório.
- O método é adaptável a outros ambientes e espécies hospedeiras, desde que haja identificação adequada do hospedeiro.
- Culturas binárias podem ser utilizadas em estudos genômicos, transcriptômicos e de patogenicidade.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de culturas binárias estáveis de Saccharibacteria simbióticas supera uma barreira crítica na descoberta de fármacos direcionados ao microbioma, permitindo o acesso em laboratório a táxons microbianos previamente incultiváveis. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva na validação precoce de alvos e apoia a redução de riscos mecanicistas em hipóteses terapêuticas relacionadas ao microbioma. A reprodutibilidade e adaptabilidade do protocolo o posicionam como uma ferramenta fundamental para ampliar a diversidade de modelos microbianos relevantes para doenças nos portfólios de P&D biofarmacêutico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta de interações microbianas simbióticas relevantes para a saúde humana.
- Apóia a validação funcional de alvos microbianos por meio de sistemas de co-cultivo controlados.
- Facilita a redução mecanicista de riscos ao permitir a manipulação e observação de simbiontes obrigatórios.
- Aprimora a confiança preditiva para estratégias terapêuticas baseadas no microbioma.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece culturas binárias padronizadas para o desenvolvimento reprodutível de ensaios.
- Permite a detecção baseada em PCR quantitativa da presença de simbiontes para leitura de ensaios.
- Oferece suporte à escalabilidade e reutilização da plataforma em diversos pares de Saccharibacteria e hospedeiros.
- Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho de triagem de compostos em etapas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Amplia o acesso a sistemas microbianos relevantes para doenças na descoberta translacional de biomarcadores.
- Permite a continuidade de descobertas in vitro para estudos de patogenicidade in vivo utilizando modelos animais.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer modelos microbianos pré-clínicos robustos.
- Alinha-se aos esforços para caracterizar o impacto funcional do microbioma humano sobre doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem inicial de hipóteses até o desenvolvimento de modelos pré-clínicos, permitindo a validação iterativa e estudos mecanicistas de bactérias simbióticas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias em interações microbianas simbióticas.
- Triagem: Fornece resultados reprodutíveis de PCR quantitativa para padronização de ensaios.
- Análises: Oferece confirmação molecular da presença de simbiontes, permitindo análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos in vivo para estudos de biomarcadores e patogenicidade.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o cultivo de diversas espécies CPR em diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa do microbioma.
- Valor Operacional: Padroniza e amplia o cultivo de microrganismos previamente incultiváveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e reduz riscos biológicos em estágios avançados em programas de microbioma.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização e expansão ajustadas ao risco de ativos direcionados ao microbioma.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em co-cultivo microbiano e técnica asséptica.
- Necessita de acesso a instrumentação padrão de microbiologia e infraestrutura analítica de PCR.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para reprodutibilidade e controle de contaminação.
- A adaptação a novos pares hospedeiro-microorganismo pode exigir otimização empírica.
- O risco de contaminação e a especificidade do hospedeiro são limitações práticas que devem ser gerenciadas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
Preparation Initiating Host Cultures and Sterilizing Equipment
1:55
Obtaining Sample of Oral Bacteria
2:30
Preparation of Filtrate from Oral Sample
3:28
Concentration of the Saccharibacteria Cells by Centrifugation
4:02
Infection of Host Cultures with Saccharibacteria-enriched Filtrate
4:47
Confirmation of Infection by PCR and Verification of Purity
5:36
Results: Confirmation of Infection and Purity of Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria
6:54
Conclusion
