Análise constante da mola molecular por espectroscopia da sonda de força biomembrana
20 de novembro de 2021
Uma sonda de força biomembrana (BFP) é uma técnica in situ dynamic force spectroscopy (DFS). O BFP pode ser usado para medir a constante de mola das interações moleculares em células vivas. Este protocolo apresenta análises constantes de mola para ligações moleculares detectadas pela BFP.
Este vídeo descreve procedimentos passo a passo sobre o uso da Sonda de Força Biomembrana, ou BFP para medir a constante da mola molecular. Em sonda de força, o BFP surgiu recentemente na superfície celular nativa ou na análise de espectroscopia da Força Dinâmica SITU. O principal objetivo desta técnica é medir a genética de ligação de molécula única.
Este procedimento de análise de dados é uma mensagem simples, mas poderosa, e fornece informações mecânicas, especificamente a força dinâmica e inflamação da membrana celular expressando moléculas. Durante o ciclo de experimentos da BFP, o microbioma da sonda apostou com a célula vermelha e o probatório, a célula-alvo e a ligação molecular do receptor de ligante entre a sonda e o alvo podem ser considerados como uma série de sistema cerebral conectado. Com base na lei de Hooke, a recíproca da constante total da primavera de uma série de sistemas de molas conectados é igual à soma da constante de mola inversa de cada componente, como mostra a equação.
A constante de mola das células vermelhas é calculada com base no movimento de eventos, que depende da radial da micropipette da sonda no orifício. O glóbulo vermelho, a área de contato circular entre o glóbulo vermelho e o probatório e a micro-pipeta aspirando pression. Os dados rodoviários de BFP são obtidos por um instrumento virtual de visão esquerda caseiro, que controla o movimento da micro-pipeta alvo por um Tradutor de PAs.
Um ciclo completo de toque PFP consiste em cinco estágios. Abordagem.Impinge.Contato. Retraia e dissocia. No início, enfatiza que a posição robusto APICS é denotada como X é igual a 0 em deshine preto.
O alvo é então conduzido por uma peça ou tradutor para implicar e comprimir o robusto para causar movimento de probatório negativo. Você nota como X menor que zero na linha de traço vermelho. Na fase de retração, o busto apex vermelho move-se do X menor que zero posição de volta para a posição X igual a zero referida como a fase compressiva.
Se uma ligação for formada entre o complexo da molécula do receptor de ligante, o glóbulo vermelho seria ainda diferente de outra direção positiva. Este período X maior que zero é referido como a fase de tração da fase de retração. O estágio de retração é a parte mais crítica para determinar a constante de mola da molécula de ligação.
Coletar dados de força versus estrada de tempo usando a plataforma de aquisição de dados BSP. Cada experimento geralmente registra de 50 a 200 ciclos de toque, abra o software de análise de dados PFP. Clique no ícone da pasta amarela e selecione o arquivo de dados de linha correspondente clicando duas vezes neles.
Estamos no programa. Em seguida, clique nos botões de seta para cima e para baixo para alternar entre os eventos. Usando os critérios de exclusão outlier para selecionar eventos inválidos.
Selecione o tipo de dados de exportação que é forçado a cronometrar o formato e escolha a faixa de tempo de estado apropriada. Clique no botão de dados do plot de exportação. Os dados exportados são salvos como arquivo de texto em padrão.
Este arquivo de texto contém duas colunas de dados. É a primeira coluna representando o tempo daddies e a segunda coluna representando a força correspondente em cada ponto de tempo. Plote a curva força versus tempo usando o software de planilhas para obter a curva forçada versus deslocamento.
Multiplique o valor de tempo de cada ponto de dados pelo movimento Willow Steel PSO. Zero o primeiro ponto de dados subtraindo o menor valor de deslocamento de cada ponto de dados. Essa transformação horizontal não afeta o cálculo constante da primavera subsequente.
Na curva força versus deslocamento, dois atores distintos eram diferentes se a nova inclinação de força pudesse ser identificada. Cada um representando a fase compressiva e a fase de 10 estilos. Encaixe uma linha de regressão em cada grupo de dados.
A linha com inclinação mais íngreme representa a constante total da mola em uma fase compressora denotada como K1. E a linha que era menor top representa a linha nesta fase de 10 estilos denotada como K2.As eu mencionei, a constante total da primavera é a recíproca do filho da série mola constante de cada componente. Durante a fase compressiva da batida ao modo celular, a ligação molecular não é esticada, portanto, a constante de mola de ligação molecular não é levada em consideração. A constante de mola da célula alvo é descrita como a equação exibida onde K1 representa a constante total da mola durante a fase do compressor.
Na fase de 10 estilos da batida para vender o modo, a constante total da mola é o sol da constante de mola úversa da ligação molecular da célula de sangue vermelha. E a célula alvo, use a equação exibida para calcular a constante de mola de ligação de molécular, que K2 representa a constante total da mola. Você leu a fase de 10 paradas.
No modo batida para bater, uma vez que a deformação B é insignificante, o termo que descreve o inverso da aproximação constante da mola da célula alvo zero, portanto a constante total de mola na fase do compressor é equivalente à constante da mola do sangue vermelho mostrando-se como a equação seguinte. Na fase de tração, a constante de mola da ligação molecular pode ser calculada subtraindo o efeito da célula vermelha do sangue mostrando como a seguinte equação. Colete as constantes de mola da atitude de integração do vento lateral B, complexo Beta 3, a célula K562 e a febrifugina integrando a atitude B Beta três complexo, calcule o desvio médio e padrão das constantes de mola derivadas na escala de Newton ou nanômetros.
Agora você deve ter uma melhor compreensão de quais são os requisitos para medir e mola constante fora dos dados VFD. As diferenças entre a batida para o modo celular e o modo batida para bater devem ser notadas. Diferentes moléculas que apresentam serviço terão diferentes defesas para a medida da constante da mola.
Em conclusão, este procedimento passo-a-passo descreve como realizar análises constantes de mola molecular usando BFP. Prevemos que esforços futuros serão feitos para automatizar e integrar a aquisição de dados BFP e a análise do DFS em um programa de descanso de computador. Tornando toda a análise de dados de operação BFP mais amigável e alta durante todo o tempo.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
O sonda de força de biomembranas (BFP) é uma técnica de espectroscopia de força dinâmica utilizada para medir a constante elástica de interações moleculares em células vivas. Este protocolo descreve a análise das constantes elásticas de ligações moleculares detectadas por BFP.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Espectroscopia de força dinâmica
- Interações moleculares
- Mecânica da membrana celular
Contexto
- A técnica de BFP mede a ligação de moléculas individuais.
- Ela fornece informações mecânicas sobre membranas celulares.
- A análise é baseada na lei de Hooke.
- Envolve interações entre sondas e células-alvo.
Objetivo do Estudo
- Medir constantes elásticas moleculares.
- Analisar a dinâmica de ligação molecular.
- Aprimorar a compreensão das interações da membrana celular.
Métodos Utilizados
- Uso da sonda de força de biomembrana (BFP).
- Análise espectroscópica de força dinâmica in situ.
- Análise de dados de interações moleculares.
- Aplicação da lei de Hooke para o cálculo da constante elástica.
Resultados Principais
- Medição bem-sucedida de constantes elásticas moleculares.
- Compreensão da dinâmica das ligações moleculares.
- Demonstração da eficácia da BFP na análise de células vivas.
- Validação de modelos teóricos por meio de dados experimentais.
Conclusões
- O BFP é uma ferramenta poderosa para o estudo de interações moleculares.
- A técnica aprimora nossa compreensão da mecânica celular.
- Aplicações futuras podem incluir estudos biológicos mais amplos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição de constantes elásticas moleculares por meio da espectroscopia de sonda de força em biomembranas fornece informações mecânicas quantitativas sobre as interações entre ligante e receptor, auxiliando na validação de alvos ao caracterizar a estabilidade das ligações e a dinâmica conformacional. Esta abordagem permite a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta ao associar a mecânica molecular à sinalização funcional, orientando decisões de avançar ou não antes da triagem de compostos. O método aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos ao revelar comportamentos de ligação dependentes da força, que se correlacionam com vias fisiológicas de mecanossensibilidade.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor científico: Analisa hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da rigidez da ligação e das forças de ruptura sob taxas de carregamento fisiológicas.
- Valor operacional: Permite a comparação direta de variantes moleculares ou mutantes para identificar mutações estabilizadoras que prolongam a duração da ligação.
- Valor científico: Esclarece alterações conformacionais dependentes da força em receptores, apoiando a validação de mecanismos alostéricos.
- Valor operacional: Fornece dados de referência para o design orientado por estrutura de terapêuticos com resistência mecânica otimizada.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera curvas de força-deslocamento que servem como leituras complementares para a afinidade de ligação no triagem de ensaios.
- Valor Operacional: Padroniza as medições da constante de mola entre réplicas utilizando critérios de exclusão de valores aberrantes e ajuste por regressão.
- Valor Científico: Distingue interações específicas de interações não específicas com base nas características da inclinação na fase de tração no modo de esfera-esfera.
- Valor Operacional: Permite a coleta em alto rendimento de 50 a 200 ciclos de contato por experimento para análise estatística robusta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor científico: Relaciona constantes elásticas moleculares com respostas celulares de mecanossensibilidade, fornecendo relevância fisiopatológica em modelos de doenças.
- Valor operacional: Permite continuidade entre sistemas purificados e superfícies celulares nativas por meio dos modos de ligação célula-esfera e esfera-esfera.
- Valor científico: Mede a contribuição celular à constante elástica total, separando a mecânica molecular específica do alvo de artefatos provenientes da sonda ou da célula.
- Valor operacional: Facilita a comparação entre plataformas distintas da mecânica molecular utilizando análise padronizada baseada na lei de Hooke.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer fenotipagem mecânica de alvos após a confirmação inicial de ligação, mas antes da triagem em larga escala, ajudando a priorizar alvos com perfis favoráveis de estabilidade-força.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses alvo mediante a medição de como ligações moleculares respondem a perturbações mecânicas, revelando comportamento do tipo ligação de retenção ou ligação de deslizamento.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas e reprodutíveis da constante elástica que permitem a classificação hierárquica de variantes de ligantes ou candidatos terapêuticos.
- Análise: Utiliza regressão linear em dados de força-deslocamento para derivar constantes elásticas (K1, K2) a partir das fases compressiva e de tração, permitindo comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona mecânica molecular com respostas em escala celular ao medir a contribuição celular específica no modo de microesfera-célula, apoiando a continuidade mecanicista.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma nanoferramenta reutilizável para fenotipagem mecânica em diversos sistemas receptor-ligante, reduzindo o esforço de revalidação em campanhas subsequentes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer medidas diretas e quantitativas da elasticidade da ligação e da cinética dependente da força.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da aquisição padronizada de dados, filtragem de valores atípicos e conjuntos de dados de força-tempo exportáveis para validação externa.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper ao identificar precocemente alvos mecanicamente frágeis, reduzindo investimentos em vias de alto risco.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em métricas de estabilidade da ligação, complementando dados tradicionais de afinidade e seletividade.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em espectroscopia de força dinâmica, manipulação com micropipeta e calibração de força utilizando padrões de hemácias.
- Depende de um arranjo personalizado de ponta de força com microferramenta (BFP) equipado com tradutores piezoelétricos e instrumentação virtual desenvolvida em casa para controle preciso de deslocamento.
- Necessita padronização conjunta entre equipes dos critérios de valores aberrantes, seleção de intervalos de tempo e protocolos de ajuste por regressão em diferentes locais.
- Envolve considerações de adaptação ao transitar do modo esfera-célula para o modo esfera-esfera, a fim de isolar as contribuições moleculares da mecânica celular.
- É limitado pela necessidade de ancoragem molecular estável e expressão funcional de ligante-receptor nas superfícies da sonda ou do alvo, para evitar sinais artifatos.
