Name: Análise constante da mola molecular por espectroscopia da sonda de força biomembrana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a medir constantes de mola molecular em células vivas usando a Sonda de Força Biomembrana. Esta técnica de espectroscopia de força dinâmica fornece dados mecânicos sobre interações moleculares e mecânica celular.

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Agradecemos a Guillaume Troadec pela discussão útil, Zihao Wang pela consulta de hardware, e o Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning e Simon Ringer pelo apoio à nossa startup de laboratório. Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), e The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju é um membro do Conselho de Pesquisa Australiano (DE190100609).

1. Obter eventos de DFS analisáveis
<ol><li>Inicie o experimento no software (por exemplo, LabVIEW VI) para a configuração de controle e parâmetro BFP(Figura S1A).</li>
	<li>Observe os toques de esferas/células de esferas de esferas de teste repetitivo no software para Monitor BFP(Figura S1B).</li>
	<li>Teste e alcance a frequência de adesão ≤ 20% dentro dos primeiros 50 toques, ajustando a força de impacto e o tempo de contato, pelo qual garante que ≥ 89% do evento de adesão do DFS sejam mediados por ligações únicas12,13,14. NOTA: Para cada par de células de contas/contas, realizamos 200 ciclos de toque repetitivos. Para obter qualidade de dados publicáveis, geralmente executamos n ≥ 3 pares De Contas ou Contas-Célula.<ol>
<li>Salve os dados, na forma de Força vs. Tempo, à pasta dirigida pelo usuário até o final de cada par, solicitado pelo software para o controle bfp e configuração do parâmetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colete os dados brutos force vs. Time dos eventos bond, conforme exemplificado na Figura 2A,utilizando a plataforma de aquisição BFP(Figura S1C).<ol>
<li>Abra o software de análise de dados BFP. Clique no ícone da pasta amarela e selecione o arquivo de dados brutos correspondente clicando neles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute o programa e clique no botão para cima e para baixo para alternar entre os eventos. Use os critérios de exclusão outlier(Figura S2) para selecionar eventos inválidos. Selecione o tipo de dados de exportação como formato Força vs. Tempo e clique no botão Exportar dados de gráficos.</li>
</ol>2. Converta a curva força vs. tempo para a curva força vs. deslocamento
<ol><li>Exporte o segmento de dados correspondente ao estágio Retractção para uma planilha (Figura 2A, letreiro quadrado), que é relevante para a análise constante da mola.</li>
	<li>Plote a Curva Força vs. Tempo usando o software de planilha. Para obter a curva Força vs. Deslocamento, converta os valores de tempo(Figura 2A, x-eixo) para os valores de deslocamento totais (Δxtot) multiplicando os valores do tempo com a velocidade de movimento piezo (ou seja, 4.000 nm/s por predefinição).</li>
	<li>Zero o primeiro ponto de dados subtraindo o menor valor de deslocamento de cada valor de deslocamento adquirido. Essa transformação horizontal não afeta as encostas ascendentes do estágio Retractção nem o cálculo constante de mola subsequente.</li>
	<li>Notavelmente, o BFP é considerado como um sistema de mola serial no qual Δxtot (Tabela 1) somam deformações do RBC, ΔxRBC (Tabela 1),a ligação molecular, Δxmol (Tabela 1),e a célula Alvo, Δxcélula (Tabela 1),como o Eq. 2: <img alt="Equação de equilíbrio estático Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell, fórmula matemática." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> (Eq. 2)</li>
	<li>Plote a Força (F) vs. Deslocamento (Δxtot) curva como mostrado na Figura 2B.</li>
</ol>3. Análise cnstante de mola do modo de célula de contas
<ol><li>Na curva Força vs. Deslocamento, pode-se identificar dois slop distintos, onde cada um pode representar a fase compressiva e a fase de tração. Encaixe uma linha de regressão em cada grupo de dados(Figura 2B),onde a inclinação de ajuste linear maior representa a constante total da mola na fase compressiva(Figura 2B, vermelha),denotada como k1 (Tabela 1); e a inclinação de ajuste linear menor representa a constante total da mola na fase detração (Figura 2B, azul),denotada como k2 (Tabela 1).</li>
	<li>Para molas conectadas em séries por descrição passo 2.2, expresse a recíproca da constante total da mola, ktot (Tabela 1),como a soma dos inversos constantes da mola de RBC, kRBC (Tabela 1),a ligação molecular, kmol (Tabela 1),e a célula Alvo,célula K(Tabela 1). Durante a fase compressiva do modo Célula de Contas, a ligação molecular não é esticada, portanto kmol não é levado em consideração. A recíproca do ktot neste cenário (1/k1) é expressa como <img alt="Equação representando a cinética celular em biologia; diagrama de constantes cinéticas: k1, kRBC, kcell." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"> (Eq. 3). Nos dados de exemplo, kRBC é pré-determinado (0,25 pN/nm por padrão). kcélula pode ser derivada do Eq. 3 com os adquiridos k1 e kRBC ( Figura3B).</li>
	<li>Durante a fase de tração, a adesão é formada entre o par ligante-receptor. Expresse a recíproca do ktot neste cenário (1/k2) como <img alt="Equação de resistência em série, mostrando 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcell, utilizada no estudo cinético." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> (Eq. 4) onde k2 (Tabela 1) representa a constante total da mola durante a fase de tração.</li>
	<li>Deriva kmol de subtração 1/k1 de 1/k2 (compare Eq. 3 vs. Eq. 4).</li>
</ol>4. Análise constante da mola do modo contas-contas
<ol><li>Encaixe uma linha de regressão nos dados da fase compressiva para obter k1 (semelhante à Figura 2B, vermelho). Note-se que, no modo Bead-Bead, a célula Target é substituída por uma conta de vidro revestida com o receptor de interesse(Figura 1C). Uma vez que a deformação das contas é insignificante, o termode célula de 1/kpode ser removido do Eq. 3 e Eq. 4 em conformidade. O ktot recíproco da fase compressiva (1/k1) pode ser expresso como: <img alt="Equação mostrando relação: 1/k1 = 1/kRBC; chave para constantes de taxa cinética em análises bioquímicas." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> (Eq. 5)</li>
	<li>Encaixe uma linha de regressão nos dados da fase de tração para obter k2 (semelhante à Figura 2B, azul). O ktot recíproco da fase de tração (1/k2) pode ser expresso como: <img alt="Equação de taxa de reação, diagrama de constantes de taxa inversa; k2, kRBC, termos kmol para análise cinética." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> (Eq. 6)</li>
	<li>Deriva kmol de subtrair 1/k1 de 1/k2 (compare Eq. 5 vs. Eq. 6).</li>
</ol>

<ol><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe%3A+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).</li>
<li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li>
<li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li>
<li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li>
<li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+cell+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li>
<li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580(1995).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li>
<li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+regulated+conformational+change+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Force regulated conformational change of integrin αVβ3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+force+spectroscopy+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447(2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes a relatar em relação ao presente estudo.

Em resumo, fornecemos um protocolo detalhado de análise de dados para pré-processamento dos dados brutos do DFS e que deriva constantes de mola molecular nos modos de análise BFP Bead-Bead e Bead-Cell. São apresentados modelos biomecânicos e equações necessárias para determinar as constantes moleculares e celulares da mola. Embora sejam estudadas integrins diferentes, o kmol medido pelo modo Bead-Bead e pelo modo Bead-Cell possui diferenças significativas de alcance(Figura 3A</str...

Como técnica de DFS de células vivas, a BFP projeta um glóbulo vermelho humano (RBC; Figura 1) em um transdutor de força ultrasensível e tunable com uma faixa de constante de mola compatível em 0,1-3 pN/nm1,2,3. Para sondar a interação ligante-receptor, o BFP permite medições de DFS em ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) e ~0,5 ms (10-3 s) em vigor, resolução espacial e temporal4,5. Sua configuração experimental consiste em dois micropipettos opostos, ou seja, a Sonda e o alvo. A micropipette sonda aspira um RBC e uma conta é colada em seu ápice através de uma interação biotina-streptavidina. A conta é revestida com o ligante de interesse(Figura 1A). O micropipette target aspira uma célula ou uma esfera com o receptor de interesse, correspondendo aos modos De célula de contas(Figura 1B) e Bead-Bead(Figura 1C),respectivamente 5.
A construção, montagem e os protocolos experimentais DFS foram descritos em detalhes anteriormente1,6. Resumidamente, um ciclo de toque BFP consiste em 5 estágios: Abordagem, Impinge, Contato, Retraímento e Dissociado(Figura 1D). A posição de ápice RBC horizontal é denotada como ΔxRBC. No início, a deformação RBC não-apoiada (com força zero) ΔxRBC é 0 (Tabela 1). O Alvo é então conduzido por um piezotranslator para impingir e retrair da conta da sonda(Figura 1D). A sonda RBC é primeiramente compactada pelo Target com deformação RBC negativa ΔxRBC &lt; 0. Em um evento de Bond, a fase Retract passa de uma fase compressiva para uma fase de tração com deformação RBC positiva ΔxRBC &gt; 0 (Figura 2C e D). De acordo com a lei de Hooke, a força de rolamento BFP é capaz de ser medida como F = kRBC × ΔxRBC, onde kRBC ( Tabela1) é a constante de mola RBC do BFP. Após a ruptura da ligação e a conclusão de um ciclo de toque, a conta da sonda retorna à posição de força zero com ΔxRBC = 0 (Figura 1D).
Para determinar o kRBC,medimos e registramos os raios do orifício interno da sonda(Rp),a RBC (R0) e a área de contato circular(Rc)entre a RBC e a placa da sonda(Figura 1A). Em seguida, a KRBC é calculada de acordo com o modelo do Evan (Eq.1) 7,8 utilizando um programa LabVIEW que atua como um instrumento virtual (VI) para operar o BFP (Figura S1A)8,9.
<img alt="Equação de equilíbrio estático para kRBC em dinâmica de fluidos, mostrando variáveis e termos logarítmicos." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> (Eq. 1)
Com um BFP estabelecido e dados brutos DFS obtidos, apresentamos como analisar a constante de mola do par ou células do receptor de ligantes. Os dados brutos do DFS sobre a interação da proteína glicosilada Thy-1 e K562 rolam integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; Figuras 3A e 3B)10 e a do fibrinogênio e da integrin revestida de contas αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figura 3C) 11,12 foram usados para demonstrar os modos de análise de Células de Contas e Contas de Contas, respectivamente.
Preparação Experimental BFP Para obter detalhes sobre a preparação experimental e instrumentação da BFP, consulte os protocolos publicados anteriormente3. Resumindo, a RBC humana foi biotinilada usando o Biotin-PEG3500-NHS no buffer de carbono/bicarbonato. Proteínas de interesse foram covalentemente acoplado às contas de vidro borossilicato usando MAL-PEG3500-NHS no tampão fosfato. Para anexar ao RBC biotinilado, a conta da sonda também é revestida com streptavidina (SA) usando o MAL-SA. Consulte a Tabela de Materiais e Tabela 2.
Para montar o BFP (Figura 1, à esquerda),a terceira micropipette denominada 'Ajudante' será usada para entregar a conta da sonda e colá-la ao ápice da RBC1,3. A interação covalente entre a conta da sonda revestida SA e a RBC biotinilada é muito mais forte do que a ligação ligante-receptor de interesse. Assim, o estágio Dissociado pode ser interpretado como a ruptura da ligação ligante-receptor em vez do desprendimento da conta da sonda da RBC.

<table><tbody><tr><td>3-Mercaptopropiltrimetoxissilano (MPTMS)</td> <td>Uct, Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Funcionalização de esferas de vidro</td></tr><tr><td>Anhy. Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Preparação de tampão fosfato</td></tr><tr><td>Aquisição de dados BFP VI</td> Controle <td>LabVIEW</td><td></td><td>BFP e parametrização Análise</td></tr><tr><td>de dados BFP VI</td><td>Análise de dados brutos</td><td>LabVIEW</td><td></td> BFP</tr><tr><td>Biotina-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>Biotinilação de hemácias</td></tr><tr><td>Contas de vidro borossilicato</td><td>Distrilab Particle Technology, Holanda</td><td>9002</td><td>Funcionalização de esferas de vidro</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Câmera de funcionalização de ligantes</td></tr><tr><td>VI</td><td>Monitoramento LabVIEW</td><td></td><td>BFP</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>Tyrode' s preparação do tampão</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode' s preparação do tampão</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Funcionalização do grânulo de vidro</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Tyrode' s preparação do tampão</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Preparação do tampão carbonato/bicarbonato; Tyrode' s preparação do</td></tr><tr><td>tampão Carbonato de sódio (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Preparação do tampão carbonato/bicarbonato</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Tyrode» s preparação do tampão</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Monobásico Monohidratado (NaH2PO4&bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Preparação de tampão fosfato</td></tr><tr><td>Streptavidin-Maleimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Funcionalização de esferas de vidro</td></tr></tbody></table>

análise constante da mola molecular por espectroscopia da sonda de força biomembrana

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

Uma sonda de força biomembana (BFP) emergiu recentemente como uma superfície de célula nativa ou no nanotool de espectroscopia de força dinâmica in situ (DFS) que pode medir cinéticas de ligação uni-molecular, avaliar propriedades mecânicas de interações ligantes-receptores, visualizar alterações conformais dinâmicas de proteína e elucidar mecanismos de mecanosensing de células mediadas pelo receptor. Mais recentemente, o BFP tem sido usado para medir a constante de mola de ligações moleculares. Este protocolo descreve o procedimento passo-a-passo para realizar a análise constante de DFS da mola molecular. Especificamente, dois modos de operação BFP são discutidos, ou seja, os modos Bead-Cell e Bead-Bead. Este protocolo se concentra em derivar as constantes de mola da ligação molecular e células a partir de dados brutos do DFS.

Neste trabalho, demonstramos o protocolo da análise constante da mola BFP. Para o modo de análise de células de contas, analisamos o kmol da ligação molecular entre a proteína glicosilácida Thy-1 revestida na conta da sonda e a integrin α5β1 expressas na célula Target K562 (Thy-1-integrin α5β1; Figura 3A) 10. Acélula ktambém é derivada do modo Célula de Contas (Célula K562; <strong cl...

Uma sonda de força biomembrana (BFP) é uma técnica in situ dynamic force spectroscopy (DFS). O BFP pode ser usado para medir a constante de mola das interações moleculares em células vivas. Este protocolo apresenta análises constantes de mola para ligações moleculares detectadas pela BFP.

Análise constante da mola molecular por espectroscopia da sonda de força biomembrana

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Este vídeo descreve procedimentos passo a passo sobre o uso da Sonda de Força Biomembrana, ou BFP para medir a constante da mola molecular. Em sonda de força, o BFP surgiu recentemente na superfície celular nativa ou na análise de espectroscopia da Força Dinâmica SITU. O principal objetivo desta técnica é medir a genética de ligação de molécula única.Este procedimento de análise de dados é uma mensagem simples, mas poderosa, e fornece informações mecânicas, especificamente a força dinâmica e inflamação da membrana celular expressando moléculas. Durante o ciclo de experimentos da BFP, o microbioma da sonda apostou com a célula vermelha e o probatório, a célula-alvo e a ligação molecular do receptor de ligante entre a sonda e o alvo podem ser considerados como uma série de sistema cerebral conectado. Com base na lei de Hooke, a recíproca da constante total da primavera de uma série de sistemas de molas conectados é igual à soma da constante de mola inversa de cada componente, como mostra a equação.A constante de mola das células vermelhas é calculada com base no movimento de eventos, que depende da radial da micropipette da sonda no orifício. O glóbulo vermelho, a área de contato circular entre o glóbulo vermelho e o probatório e a micro-pipeta aspirando pression. Os dados rodoviários de BFP são obtidos por um instrumento virtual de visão esquerda caseiro, que controla o movimento da micro-pipeta alvo por um Tradutor de PAs.Um ciclo completo de toque PFP consiste em cinco estágios. Abordagem.Impinge.Contato. Retraia e dissocia. No início, enfatiza que a posição robusto APICS é denotada como X é igual a 0 em deshine preto.O alvo é então conduzido por uma peça ou tradutor para implicar e comprimir o robusto para causar movimento de probatório negativo. Você nota como X menor que zero na linha de traço vermelho. Na fase de retração, o busto apex vermelho move-se do X menor que zero posição de volta para a posição X igual a zero referida como a fase compressiva.Se uma ligação for formada entre o complexo da molécula do receptor de ligante, o glóbulo vermelho seria ainda diferente de outra direção positiva. Este período X maior que zero é referido como a fase de tração da fase de retração. O estágio de retração é a parte mais crítica para determinar a constante de mola da molécula de ligação.Coletar dados de força versus estrada de tempo usando a plataforma de aquisição de dados BSP. Cada experimento geralmente registra de 50 a 200 ciclos de toque, abra o software de análise de dados PFP. Clique no ícone da pasta amarela e selecione o arquivo de dados de linha correspondente clicando duas vezes neles.Estamos no programa. Em seguida, clique nos botões de seta para cima e para baixo para alternar entre os eventos. Usando os critérios de exclusão outlier para selecionar eventos inválidos.Selecione o tipo de dados de exportação que é forçado a cronometrar o formato e escolha a faixa de tempo de estado apropriada. Clique no botão de dados do plot de exportação. Os dados exportados são salvos como arquivo de texto em padrão.Este arquivo de texto contém duas colunas de dados. É a primeira coluna representando o tempo daddies e a segunda coluna representando a força correspondente em cada ponto de tempo. Plote a curva força versus tempo usando o software de planilhas para obter a curva forçada versus deslocamento.Multiplique o valor de tempo de cada ponto de dados pelo movimento Willow Steel PSO. Zero o primeiro ponto de dados subtraindo o menor valor de deslocamento de cada ponto de dados. Essa transformação horizontal não afeta o cálculo constante da primavera subsequente.Na curva força versus deslocamento, dois atores distintos eram diferentes se a nova inclinação de força pudesse ser identificada. Cada um representando a fase compressiva e a fase de 10 estilos. Encaixe uma linha de regressão em cada grupo de dados.A linha com inclinação mais íngreme representa a constante total da mola em uma fase compressora denotada como K1. E a linha que era menor top representa a linha nesta fase de 10 estilos denotada como K2.As eu mencionei, a constante total da primavera é a recíproca do filho da série mola constante de cada componente. Durante a fase compressiva da batida ao modo celular, a ligação molecular não é esticada, portanto, a constante de mola de ligação molecular não é levada em consideração. A constante de mola da célula alvo é descrita como a equação exibida onde K1 representa a constante total da mola durante a fase do compressor.Na fase de 10 estilos da batida para vender o modo, a constante total da mola é o sol da constante de mola úversa da ligação molecular da célula de sangue vermelha. E a célula alvo, use a equação exibida para calcular a constante de mola de ligação de molécular, que K2 representa a constante total da mola. Você leu a fase de 10 paradas.No modo batida para bater, uma vez que a deformação B é insignificante, o termo que descreve o inverso da aproximação constante da mola da célula alvo zero, portanto a constante total de mola na fase do compressor é equivalente à constante da mola do sangue vermelho mostrando-se como a equação seguinte. Na fase de tração, a constante de mola da ligação molecular pode ser calculada subtraindo o efeito da célula vermelha do sangue mostrando como a seguinte equação. Colete as constantes de mola da atitude de integração do vento lateral B, complexo Beta 3, a célula K562 e a febrifugina integrando a atitude B Beta três complexo, calcule o desvio médio e padrão das constantes de mola derivadas na escala de Newton ou nanômetros.Agora você deve ter uma melhor compreensão de quais são os requisitos para medir e mola constante fora dos dados VFD. As diferenças entre a batida para o modo celular e o modo batida para bater devem ser notadas. Diferentes moléculas que apresentam serviço terão diferentes defesas para a medida da constante da mola.Em conclusão, este procedimento passo-a-passo descreve como realizar análises constantes de mola molecular usando BFP. Prevemos que esforços futuros serão feitos para automatizar e integrar a aquisição de dados BFP e a análise do DFS em um programa de descanso de computador. Tornando toda a análise de dados de operação BFP mais amigável e alta durante todo o tempo.

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Bioengenharia

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