Name: In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a induzir células-tronco de polpa dentária humana em direção a linhagens pancreáticas usando protocolos integrativo e não integrativo. Este método compara a eficiência na geração de células produtoras de insulina funcionais para terapias do diabetes.

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SK, WR e QDL foram apoiados pela Unidade veterinária de pesquisa de células-tronco e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO e PP foram apoiados pelo Avanço Acadêmico de Chulalongkorn em seu projeto do séculoII. CS foi apoiado por uma pesquisa apoiando a bolsa da Faculdade de Ciência Veterinária, o Avanço Acadêmico chulalongkorn em seu projeto do século2, unidade de pesquisa de células-tronco veterinárias e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University e Government Research Fund.

Este trabalho foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana, Faculdade de Odontologia da Universidade chulalongkorn. Os DPSCs humanos (hDPSCs) foram isolados de tecidos de polpa dentária humana extraídos tanto de pré-molares quanto de molares devido a problemas de dentes do siso. O consentimento informado foi obtido dos pacientes sob protocolo aprovado (HREC-DCU 2018/054).
1. Protocolo de indução integrativa
<ol><li>Preparação do vetor lentiviral que carrega PDX1
	<ol>
<li>Use células de rim embrionário humano (HEK) 293FT para embalagem viral. Cultura e manutenção dessas células no Médio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina e 1% Antibiótico-Antimycotic.</li>
		<li>Gerar vetores PDX1-lentivírus por co-transfecção de 10 μg cada uma das embalagens e plasmídeos de envelope e 20 μg do plasmídeo genético alvo em células HEK293FT usando sistema de transfecção fosfato de cálcio, por exemplo, psPAX2, pMD2. G, e humano pWPT-PDX111. Certifique-se de que as células são 80%-90% confluentes durante o tempo de infecção.</li>
		<li>Colete o meio contendo partículas lentivirais em 48 e 72 h após a transfecção.</li>
		<li>Filtrar o meio coletado através de um filtro de 0,45 μm; concentrar os vírus com um filtro centrífuga a 100 kDa nominais de peso molecular (NMWCO).</li>
	</ol></li>
	<li>Superexpressão PDX1 <ol>
<li>Use a passagem 3-5 hDPSC que seja 70-80% confluente. Tentepsinizar e contar as células usando um contador de células. Semente 1 x 106 hDPSCs em um prato tratado de cultura de tecido de 60 mm e incubar durante a noite.</li>
		<li>24 h depois, adicione partículas de vírus frescos obtidas da etapa 1.1.4 para transduzir células pré-tratadas de polibreno (4 μg/mL de polibrene, 30 min abaixo de 37 °C e 5% de CO2) na multiplicidade desejada de infecção (MOI). Por exemplo, neste caso, o MOI usado é 20. Manter as células na incubadora de cultura celular por 24 h a 37 °C com 5% de CO2.</li>
		<li>Após o período de infecção de 24 horas, descarte o meio contendo partículas virais. Adicione novas mídias culturais e continue crescendo as células por 48 h. Todas as culturas são mantidas a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Verifique a morfologia agregada das células transfeinadas antes de prosseguir para a etapa de indução. A transdução PDX1 é confirmada pela análise de expressão genética(Figura Suplementar 1). NOTA: Verifique a morfologia celular sob um microscópio antes de prosseguir para os próximos passos.</li>
		<li>Colher e proceder a um protocolo de indução de três etapas (etapa 1.3) como uma abordagem de indução microambiental.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocolo de indução de três etapas NOTA: O protocolo de indução de três etapas resultou na série de diferenciação pancreática de hDPSCs para endoderme definitivo, endoderme/endócrina pancreática e beta-células/IPCs pancreáticos usando meio sem soro (SFM)-A, SFM-B e SFM-C, respectivamente.<ol>
<li>Descarte o meio de cultura e, em seguida, lave os fdpscs transduturados com solução tamponada de fosfato 1x (PBS).</li>
		<li>Adicione 0,25% de solução trypsin-EDTA às células e incubar por 1 min a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		<li>Adicione o meio de cultura para parar a atividade de trippsina e lave suavemente as células para obter a suspensão de célula única. Conte as células e alíquotas 1 x 106 células em cada tubo coletor.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão celular a 468 x g (Força Centrífuga Relativa: RCF), 4 °C, por 5 min. Descarte o supernatante e salve a pelota da célula.</li>
		<li>Resuspenque a pelota em 3 mL do primeiro meio de indução pancreática, ou seja, meio sem soro (SFM)-A. Semente as células em uma placa de cultura de baixa fixação (60 mm). Mantenha as células a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias. NOTA: Observe a morfologia das células sob um microscópio invertido antes de prosseguir para o próximo passo.</li>
		<li>Remova o SFM-A e adicione 3 mL do segundo meio de indução, ou seja, SFM-B. Mantenha as células pelos próximos 2 dias a 37 °C, 5% DE CO2. NOTA: Observe a morfologia das células sob um microscópio invertido antes de prosseguir para o próximo passo.</li>
		<li>Remova o SFM-B e adicione 3 mL do terceiro meio de indução, ou seja, SFM-C. Manter as células pelos próximos 5 dias em uma incubadora de cultura celular mantida a 37 °C com 5% de CO2. Troque o meio a cada 48 horas. Observe sua morfologia depois de 5 dias. NOTA: Cada meio de indução é complementado com reagentes diferentes como descrito; SFM-A: 1% de albumina de soro bovino (BSA), 1x insulina-transferrina-selênio (ITS), 4 nM de ativação A, 1 nM de butirato de sódio e 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de peptídeo semelhante a glucagon (GLP)-1, 1 mM de nicotinamida e 1x aminoácidos não essenciais (NEAAs).</li>
		<li>Certifique-se de verificar a morfologia celular sob um microscópio invertido após cada passo. As células se tornarão mais agregadas e flutuarão como colônias.</li>
		<li>Colete colônias de células para análise suplementar. Verifique se há morfologia e tamanho da colônia. Realize a análise de expressão de marcador genético pancreático e a análise funcional (ensaio de secreção de C-peptídeo estimulado por glicose).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Protocolo de indução não integrativo
NOTA: O protocolo não integrativo é o protocolo backbone para a entrega dos IPCs com o processo de indução de três etapas como abordagem de indução microambiental8,9.
<ol><li>Use a passagem 3-5 hDPSCs a 70%-80% de confluência.</li>
	<li>Descarte o meio de cultura e lave os hDPSCs com 1x PBS.</li>
	<li>Adicione 0,25% de solução trypsin-EDTA nas células e incubar por 1 min a 37 °C, 5% DE CO2.</li>
	<li>Adicione o meio de cultura para parar a atividade de trippsina e pipeta suavemente as células para obter a suspensão de célula única. Conte células e alíquotas 1 x 106 células em cada tubo de coleta.<ol>
<li>Centrifugar a suspensão celular a 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Descarte o supernatante.</li>
		<li>Resuspend a pelota em SFM-A e semente em uma placa de cultura de baixa fixação (60 mm). Cultume as células a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias. Verifique a morfologia celular sob um microscópio invertido.</li>
		<li>Remova o SFM-A, adicione SFM-B (Dia 3) e, em seguida, mantenha as células pelos próximos 2 dias abaixo de 37 °C, 5% DE CO2.</li>
		<li>Remova o SFM-B, adicione SFM-C (Dia 5) e, em seguida, mantenha as células pelos próximos 5 dias abaixo de 37 °C, 5% DE CO2. O SFM-C é alterado a cada 48 horas. NOTA: Cada meio de indução é complementado com reagentes diferentes como descrito; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM de ativação A, 1 nM de butirato de sódio e 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de GLP-1, 1 mM de nicotinamida e 1x NEAAs.</li>
		<li>Certifique-se de verificar a morfologia celular sob o microscópio invertido após cada passo e no dia 10. NOTA: As células se tornarão mais agregadas e flutuarão como colônias.</li>
		<li>Colete colônias de células para análise suplementar. Verifique se há morfologia e tamanho da colônia. Realize a análise de expressão de marcador genético pancreático e a análise funcional (ensaio de secreção de C-peptídeo estimulado por glicose).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDF+diabetes+atlas%3A+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li>
<li>Danaei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National%2C+regional%2C+and+global+trends+in+fasting+plasma+glucose+and+diabetes+prevalence+since+1980%3A+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+370+country-years+and+2.7+million+participants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants.</a> Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).</li>
<li>Diabetes Care. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+hypoglycemia+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Minimizing hypoglycemia in diabetes.</a> Diabetes Care. 38 (8), 1583(2015).</li>
<li>Health Quality Ontario. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation%3A+an+evidence-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ontario+Health+Technology+Assessment+Series%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation: an evidence-based analysis.</a> Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).</li>
<li>Brennan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+the+Edmonton+protocol+of+islet+transplantation+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States.</a> American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).</li>
<li>Korsgren, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+encapsulation%3A+Physiological+possibilities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations.</a> Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).</li>
<li>Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Producing+Cell+Transplantation+Platform+for+Veterinary+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice.</a> Frontiers in Veterinary Science. 7, 4(2020).</li>
<li>Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feasibility+study+of+an+in+vitro+differentiation+potential+toward+insulin-producing+cells+by+dental+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).</li>
<li>Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+protocols+for+an+in+vitro+generation+of+pancreatic+progenitors+from+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).</li>
<li>Kuncorojakti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%2FPluronic+F127-based+encapsulation+supports+viability+and+functionality+of+human+dental+pulp+stem+cell-derived+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells.</a> Journal of Biological Engineering. 14, 23(2020).</li>
<li>Ritz-Laser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+the+beta-cell+specific+transcription+factor+Pdx1+inhibits+glucagon+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription.</a> Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).</li>
<li>Pampusch, M. S., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+and+expansion+of+primary+T+cells+in+nine+days+with+maintenance+of+central+memory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).</li>
<li>Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+transfection+efficiency+of+pIDUA%2Fnanoemulsion+complexes+in+a+mucopolysaccharidosis+type+I+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).</li>
<li>Balak, J. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+ex+vivo+lentiviral+transduction+of+primary+human+pancreatic+exocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15870(2019).</li>
<li>Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinations+of+Activin+A+or+nicotinamide+with+the+pancreatic+transcription+factor+PDX1+support+differentiation+of+human+amnion+epithelial+cells+toward+a+pancreatic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage.</a> Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).</li>
<li>Spaeth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+novel+role+for+the+Pdx1+transcription+factor+in+islet+%CE%B2-Cell+maturation+and+proliferation+during+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning.</a> Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).</li>
<li>Bastidas-Ponce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+and+Pdx1+cooperatively+regulate+postnatal+maturation+of+pancreatic+%CE%B2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells.</a> Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).</li>
<li>Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX1%2C+Neurogenin-3%2C+and+MAFA%3A+critical+transcription+regulators+for+beta+cell+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240(2017).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+transcriptome+profiling+of+progenitor-like+colonies+derived+from+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172(2017).</li>
<li>Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hrabe+de+Angelis%2C+M.+Modeling+coexistence+of+oscillation+and+Delta%2FNotch-mediated+lateral+inhibition+in+pancreas+development+and+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis.</a> Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).</li>
<li>Xu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+promotes+the+differentiation+of+human+dental+pulp+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells+for+improving+the+diabetes+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1576(2019).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+under+microgravity+conditions-use+of+stem+cells+and+specialized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).</li>
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<li>Chmielowiec, J., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+and+expansion+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+Diabetic+Studies%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors.</a> The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Alcançar maior produção de IPCs de MSCs desempenha um papel essencial na terapia do diabetes. As etapas críticas do protocolo integrativo dependem da qualidade das células a serem utilizadas para a transdução e a qualidade das células transduzidas. Alguns requisitos celulares que devem ser verificados para uma transdução bem-sucedida estão garantindo a saúde celular, o gerenciamento de bancos celulares e as células estão em um estado mitoticamente ativo. Além disso, o monitoramento da viabilidade das células transduzidas...

Diabetes mellitus é uma preocupação global em curso. Um relatório da Federação Internacional de Diabetes (IDF) estimou que a prevalência global de diabetes aumentaria de 151 milhões em 2000 para 415 milhões em 20151,2. O último estudo baseado em epidemiologia previu que a prevalência estimada mundial de diabetes aumentará de 451 milhões em 2017 para 693 milhões em 20451. O sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas utilizando o protocolo de Edmonton foi demonstrado pela primeira vez em 2000, quando foi demonstrado manter a produção endógena da insulina e estabilizar a condição normóglicêica em pacientes diabéticos tipo I3. No entanto, a aplicação do protocolo de Edmonton ainda enfrenta um problema de gargalo. O número limitado de doadores de pâncreas cadavérico é o principal problema, uma vez que cada paciente com diabetes tipo I requer pelo menos 2-4 doadores de ilhotas. Além disso, o uso a longo prazo de agentes imunossupressores pode causar efeitos colaterais fatais4,5. Para lidar com isso, o desenvolvimento de uma potencial terapia para diabetes na última década tem focado principalmente na geração de células eficazes produtoras de insulina (IPCs) de várias fontes de células-tronco6.
As células-tronco tornaram-se um tratamento alternativo em muitas doenças, incluindo o diabetes tipo I, que é causado pela perda de células beta. O transplante de IPCs é o novo método promissor para o controle da glicemia nesses pacientes7. Neste artigo, estão apresentadas duas abordagens para geração de IPCs, protocolos integrativos e não integrativos de indução. O protocolo de indução imitou o processo natural de desenvolvimento pancreático para obter os IPCs amadurecidos e funcionais8,9.
Para este estudo, os hDPSCs foram caracterizados por citometria de fluxo para detecção de marcadores de superfície MSC, potencial de diferenciação de multilineagem e RT-qPCR para determinar a expressão da propriedade stemness e marcadores genéticos proliferativos (dados não mostrados)8,9,10. hDPSCs foram induzidos em direção ao endoderme definitivo, endóderme pancreático, endócrina pancreática e células beta pancreáticas ou IPCs(Figura 1), respectivamente7. Para induzir as células, uma abordagem de indução de três etapas foi usada como protocolo de espinha dorsal. Este protocolo foi chamado de protocolo não integrativo. No caso do protocolo integrativo, o fator essencial de transcrição pancreática, PDX1,foi superexpresso em hDPSCs seguido pela indução de PDX1 superexpresso em hDPSCs utilizando um protocolo de diferenciação de três etapas. A diferença entre protocolo não integrativo e integrativo é a superexpressão do PDX1 no protocolo integrativo e não no protocolo não integrativo. A diferenciação pancreática foi comparada entre os protocolos integrativos e não integrativos deste estudo.

<table><tbody><tr><td><forte>Cultura de células</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation, EUA</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Corning&reg; Placa de cultura tratada com TC de 60 mm</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td>430166</tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade;</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Pó de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>Um pacote é usado para preparar 1 L de solução PBS com DDI estéril</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; Filtro Centrífugo Ultra-15</td><td>Merck Millipore, EUA</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo Humano pWPT-PDX1</td><td>Addgene</td><td>12256</td><td>Presente de Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256</td></tr><tr><td>Unidade de Filtro de Seringa Millex-HV, 0.45&nbsp; &micro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plasmídeo</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Presente de Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Reagente de</td></tr><tr><td>Infecção / Transfecção de Polibreno</td><td>Addgene_12259 Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 plasmídeo</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Presente de Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260</td></tr><tr><td>Protocolo de indução em três etapas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activin A Proteína humana recombinante</td><td>Merck Millipore</td><td>GF300</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA, fração de Cohn V, livre de ácidos graxos)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo semelhante ao glucagon (GLP)-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3265</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais (NEAAs)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células não tratadas, 60mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701011</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

A partir de 2000, o sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas usando o protocolo de Edmonton para tratar diabetes mellitus tipo I ainda enfrentou alguns obstáculos. Estes incluem o número limitado de doadores cadavéricos do pâncreas e o uso a longo prazo de imunossupressores. As células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido consideradas como um candidato em potencial como uma fonte alternativa de geração celular semelhante a ilhotas. Nossos relatórios anteriores ilustraram com sucesso o estabelecimento de protocolos de indução para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em células produtoras de insulina (IPCs). No entanto, a eficiência da indução variou muito. Neste artigo, demonstramos a comparação da eficiência da indução pancreática do HDPSCs por meio de protocolos integrativos (manipulação microambiental e genética) e não integrativos (manipulação microambiental) para a entrega de IPCs derivados do HDPSC (hDPSC-IPCs). Os resultados sugerem uma eficiência de indução distinta tanto para as abordagens de indução em termos de estrutura de colônia tridimensional, rendimento, marcadores de mRNA pancreático e propriedade funcional no desafio de glicose multidosagem. Esses achados apoiarão o futuro estabelecimento de um IPC clinicamente aplicável e uma plataforma de produção de linhagem pancreática.

Neste artigo, foram comparados os resultados de ambos os protocolos de indução. Os diagramas de ambos os protocolos de indução são ilustrados na Figura 2A,C. Em ambos os protocolos, a avaliação foi realizada sob um microscópio leve, e as imagens foram analisadas com ImageJ. hDPSCs foram capazes de formar estruturas semelhantes a colônias a partir do primeiro dia de indução em ambos os protocolos de indução. A morfologia da colônia era redonda e densa, e todas as colônias flu...

Este protocolo apresenta uma comparação entre dois protocolos de indução diferentes para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em relação a linhagens pancreáticas in vitro: o protocolo integrativo e o protocolo não integrativo. O protocolo integrativo gera mais células produtoras de insulina (IPCs).

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...

Este vídeo está mostrando a indução in vitro de células-tronco de polpa dentária humana em direção a linhagens pancreáticas. As células-tronco dão um tratamento alternativo em muitas doenças, incluindo diabetes tipo I que causam biolaging de células beta. O transplante de células produtoras de insulina será o novo método promissor para causar ao longo da vida.Neste vídeo são descritas duas abordagens para geração de células produtoras de insulina, incluindo o protocolo de indução integrativa e não integrativa. E nesta parte explica-se o protocolo de integração para induzir células produtoras de insulina a partir de células-tronco de polpa dentária humana. Para o protocolo de indução é o para misturar o processo natural de desenvolvimento pancreático.Para obter as células produtoras de insulina natural e funcional. Para a geração de células produtoras de insulina a partir de células-tronco mesenquimais como células-tronco de polpa dentária, o protocolo de indução de várias etapas é empregado. Células-tronco mesenquimais são usadas na palavra endoderme definitivo, endoderme pancreático, endócrina pancreática e, em seguida, células beta-célula pancreáticas ou insulina, respectivamente

in-vitro-induction-human-dental-pulp-stem-cells-toward-pancreatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O presente estudo descreve uma abordagem diferenciada dirigida em induzir a diferenciação de pâncreas de células estaminais embrionárias humanas. De grande importância é a constatação de que células endoteliais co-cultura maturação media de células-tronco embrionárias humanas derivadas progenitores pâncreas em células que expressam insulina.

Células endoteliais em co-cultura Maturação media de células estaminais humanas embrionárias a células pancreáticas produtoras de insulina em uma abordagem diferenciada Direção

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Aqui, descrevemos um método para a purificação de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas que estão comprometidos para a endoderme definitiva para a melhoria das aplicações a jusante e outras diferenciações.

Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

Aqui nós descrevemos um protocolo de 4 estágios para diferenciar as células-tronco embrionárias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de linhas de células estaminais pluripotentes humanas.

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.

Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolamento de células-tronco polpa Dental humana e propagação a fim de avaliar a expressão da proteína príon durante o processo de diferenciação neuronal.

Isolamento, propagação e expressão de proteína príon durante a diferenciação Neuronal de células-tronco humanas polpa Dental

O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

Este artigo fornece um guia passo a passo para estabelecer uma cultura primária de células-tronco de polpa dentária usando o método de cultura de explante e caracterização dessas células com base nas diretrizes do ICSCRT. As células isoladas por este protocolo podem ser consideradas como células-tronco mesenquimais para futuras aplicações.

Cultura Primária de Células-Tronco da Polpa Dentária

Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.

Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Este protocolo enfatiza a extração, cultura e preservação de células-tronco multipotentes da polpa dentária por meio da digestão enzimática. Além disso, demonstra seu potencial de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condrócitos, destacando a importância da precisão e consistência no processo.

Isolamento, Cultura e Caracterização de Células-Tronco da Polpa Dentária de Dentes Humanos Decíduos e Permanentes

Aprenda a induzir células-tronco de polpa dentária humana em direção a linhagens pancreáticas usando protocolos integrativo e não integrativo. Este método compara a eficiência na geração de células produtoras de insulina funcionais para terapias do diabetes.

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

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