Name: Análise da Restrição de SAMHD1 por Citometria de Fluxo em Células U937 Mieloides Humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a analisar a restrição de SAMHD1 contra HIV-1 em células U937 usando citometria de fluxo bicolor. Este método quantifica a atividade de restrição viral e caracteriza variantes proteicas em células mieloides humanas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Francis Crick Institute, que recebe seu financiamento principal da Cancer Research UK (FC001042 e FC001162), do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido (FC001042 e FC001162) e do Wellcome Trust (FC001042 e FC001162) e por um Wellcome Trust Investigator Award para JPS (108012/Z/15/Z). O trabalho na Universidade de Cambridge foi co-financiado pelo NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) e pelo Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido (MR / S009752/1). Este último prémio financiado pelo Reino Unido faz parte do programa EDCTP-2 apoiado pela União Europeia.

<ol><li>Sundström, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+%28U-937%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li>
<li>Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+transient+assay+for+studying+the+genetic+determinants+of+Fv1+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).</li>
<li>Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trim5alpha+protein+restricts+both+HIV-1+and+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).</li>
<li>Arnold, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-dependent+regulation+of+SAMHD1+oligomerisation+couples+catalysis+and+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction.</a> PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194(2015).</li>
<li>Groom, H. C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+xenotropic+murine+leukaemia+virus-related+virus+in+UK+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome.</a> Retrovirology. 7, 10(2010).</li>
<li>Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+entry+mediated+by+receptor+priming+and+low+pH+triggering+of+an+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein.</a> Cell. 103 (4), 679-689 (2000).</li>
<li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foamy+virus+capsids+require+the+cognate+envelope+protein+for+particle+export%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export.</a> Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
<li>Bainbridge, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+to+the+mouse+eye+using+an+HIV-based+lentiviral+vector%3B+efficient+long-term+transduction+of+corneal+endothelium+and+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium.</a> Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).</li>
<li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+interferon-stimulated+genes+with+antiretroviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity.</a> Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculating+HIV-1+infectious+titre+using+a+virtual+TCID50+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method.</a> Methods in Molecular Biology. 485, Clifton, N.J. 27-35 (2009).</li>
<li>Ordonez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+enhances+nucleoside-analogue+efficacy+against+HIV-1+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells.</a> Scientific Reports. 7, 42824(2017).</li>
<li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+specifically+affects+the+antiviral+potency+of+thymidine+analog+HIV+reverse+transcriptase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).</li>
<li>Huber, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+has+differential+impact+on+the+efficacies+of+HIV+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).</li>
<li>Amie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-HIV+host+factor+SAMHD1+regulates+viral+sensitivity+to+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors+via+modulation+of+cellular+deoxyribonucleoside+triphosphate+%28dNTP%29+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).</li>
<li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).</li>
</ol>

Para fins de Acesso Aberto, os autores aplicaram uma licença de direitos autorais públicos CC BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão. As opiniões expressas são as do(s) autor(es) e não necessariamente as do NIHR ou do Departamento de Saúde e Assistência Social.

Como discutido nas notas acima, os aspectos críticos do protocolo giram em torno da retenção do fenótipo celular correto para a produção de VLP e para a criação do ambiente apropriado para observar a restrição SAMHD1. Em primeiro lugar, a análise precisa da restrição por citometria de fluxo de duas cores depende de alcançar proporções apropriadas de células transduzidas e infectadas para que haja células suficientes em cada área do gráfico para análise. Como tal, o investigador deve visar um MOI inferior a 1 (ver Protocolo). As taxas de transdução e infecção que são muito altas ou muito baixas levam a problemas com a análise devido à falta de células não infectadas ou duplamente infectadas. Da mesma forma, uma taxa de transdução semelhante para vetores SAMHD1 a serem comparados é fundamental para permitir que a mesma matriz de compensação e gating sejam aplicados a todo o experimento, aumentando a confiança na análise subsequente.
Em segundo lugar, a idade das células U937 usadas é um fator-chave para saber se elas se diferenciam com sucesso. A diferenciação bem-sucedida pode ser monitorada através da observação da adesão, uma acidificação reduzida do meio ao longo do tempo após a diferenciação e restrição adequada pelo tipo selvagem de controle positivo no ensaio. A diferenciação de até 5 dias foi bem sucedida.
Uma das principais vantagens deste ensaio é a sua flexibilidade. Uma variedade de versões modificadas do SAMHD1 (domínios, aminoácidos, sequências de espécies) pode ser testada através de mutagênese simples dirigida ao local do vetor ou clonagem. Da mesma forma, variantes do vírus testador podem ser exploradas. O ensaio foi usado anteriormente para demonstrar que os mutantes da transcriptase reversa do HIV-1 com capacidade reduzida de se ligar ao dNTP são mais sensíveis à restrição da SAMHD1. O mesmo princípio pode ser usado para testar a restrição de outros vírus pelo SAMHD1. Além disso, condições de diferenciação variadas ou manipulação artificial das concentrações intracelulares de dNTP podem ser usadas para investigar ainda mais a interação entre as condições intracelulares e a atividade da SAMHD1, uma área de pesquisa ativa no laboratório Bishop. A interação da SAMHD1 com vários inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeos também foi descrita, e o efeito da SAMHD1 demonstrado usando este ensaio modificado para uso em células primárias12,13,14,15.
A adaptação do protocolo para uso em células primárias supera a limitação colocada pelo exame de fenótipos metabólicos em células transformadas. No entanto, o formato existente permite um protocolo conveniente e menos tecnicamente desafiador para análise de alto rendimento, especialmente com o uso de um citômetro de fluxo com um amostrador de alto rendimento. Ao adaptar o protocolo, a suscetibilidade das células internamente não transduzidas a efeitos de espectador (por exemplo, sinalização imunológica) deve ser considerada.
Tal como acontece com muitos aspectos da biologia celular, é essencial que tais ensaios sejam usados como parte de uma abordagem holística para a compreensão de um determinado fenômeno. O uso paralelo de ensaios bioquímicos para a atividadeSAMHD1 16, a quantificação de pools intracelulares de dNTP e a observação de fenótipos mutantes SAMHD1 em humanos, ex vivo e em modelos animais (sendo realizados por laboratórios de todo o mundo, alguns descritos nesta edição) são fundamentais para a evolução da compreensão dessa proteína complexa.

A proteína 1 contendo domínio de α motivo/histidina-aspartato estéril (SAMHD1) impede a replicação do Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) em células quiescentes da linhagem mielóide. SAMHD1 bloqueia a replicação através de sua atividade enzimática como uma dNTP trifosfohidrolase, o que resulta em diminuição dos níveis de dNTPs intracelulares. Como resultado, o HIV-1 não pode realizar o processo de transcrição reversa de forma eficiente. Muito progresso foi feito nos poucos anos desde esta observação inicial, particularmente no que diz respeito à contribuição de domínios específicos e aminoácidos para a atividade antiviral do SAMHD1. Esses insights foram feitos usando ensaios bioquímicos, bem como sistemas celulares que imitam o ambiente mieloide quiescente fisiologicamente relevante. As células U9371 são amplamente utilizadas como um sistema de células mieloides conveniente para analisar a atividade SAMHD1. Isto é devido à falta de expressão endógena de SAMHD1, pensado para ser devido a baixos níveis de RNA em comparação com as células que expressam SAMHD1 (uma área de pesquisa em andamento). Aqui, o protocolo descreve a transdução transitória de células U937 com partículas semelhantes a vírus co-expressando SAMHD1 e um repórter de proteína fluorescente amarela (YFP) para examinar o mecanismo de restrição SAMHD1 do HIV-1. Esses ensaios transitórios de citometria de fluxo de duas cores para examinar restrições retrovirais foram desenvolvidos pela primeira vez no laboratório Stoye2 e, desde então, foram adaptados para investigar outros fatores de restrição, incluindo as proteínas do motivo tripartido (TRIM)3. Inspirado por esses ensaios, o laboratório Bishop desenvolveu um ensaio de duas cores para analisar a restrição de SAMHD1 em células U937.
O fluxo de trabalho do experimento é mostrado na Figura 1. Partículas semelhantes ao Vírus da Leucemia Murina (MLV) contendo uma mensagem bi-cistrônica codificando SAMHD1 ao lado de YFP expressa a partir de um IRES são usadas para transduzir células U937. As células são então tratadas com acetato de miristato de forbol (PMA) para induzir a diferenciação a um fenótipo quiescente. As células são infectadas em seguida com partículas semelhantes ao vírus HIV-1 que expressam proteína fluorescente vermelha (RFP). Após 48 h, as células são colhidas e analisadas por citometria de fluxo de duas cores. Este ensaio também é usado com YFP e proteína fluorescente verde (GFP), exigindo menos combinações de filtros padrão para análise de citometria de fluxo. O uso do HIV-RFP permite uma compensação mais direta e, portanto, o ensaio é mais facilmente acessível a usuários de citometria de fluxo menos experientes e alcançável com a maioria dos citômetros.
Durante a análise, a proporção de células infectadas pelo HIV é comparada entre as células que expressam SAMHD1 e aquelas que não possuem SAMHD1 dentro do mesmo poço de células. Isso proporciona um controle interno no tubo de citometria de poço/fluxo, que é uma característica fundamental. A comparação dos níveis de infecção em células transduzidas e não transduzidas revela uma razão de restrição. Uma razão de 1,0 indica que o fator transduzido não tem efeito sobre a infectividade. A expressão de SAMHD1 do tipo selvagem leva a uma redução de cinco vezes na infecção pelo HIV neste ensaio, correspondendo a uma razão de restrição de 0,2. Embora esse efeito seja modesto em comparação com fatores de restrição mais clássicos, como o TRIM5, o efeito é, no entanto, reprodutível e permite a classificação de expressores SAMHD1 modificados naqueles que se restringem de maneira equivalente à proteína do tipo selvagem, aqueles que não conseguem restringir e aqueles com um fenótipo intermediário.
Este ensaio tem sido usado com sucesso para caracterizar os fenótipos de restrição do domínio SAMHD1 e dos mutantes de aminoácidos, transduzindo com vírus codificando sequências SAMHD1 mutantes. Por exemplo, as substituições de local catalítico HD206-7AA não conseguem restringir neste ensaio. Da mesma forma, a suscetibilidade de diferentes vírus testadores pode ser determinada. Por exemplo, os mutantes da transcriptase reversa do HIV-1 são mais suscetíveis à restrição mediada pela SAMHD1 (por exemplo, 151V4). Este protocolo descreve os detalhes da produção de partículas semelhantes a vírus (VLP), transdução de U937 com vetores de expressão SAMHD1, infecção por HIV portando um repórter fluorescente e a análise subsequente por citometria de fluxo. Este artigo discute quais dados esperar e como evitar resultados abaixo do ideal. Finalmente, usos alternativos para o ensaio são delineados, além de examinar diferentes variantes de SAMHD1 para entender a interação entre SAMHD1, níveis de dNTP e infecção viral mais profundamente. Dado o papel do SAMHD1 no centro do metabolismo celular, com ligações adicionais ao câncer, esta continua a ser uma área de intenso interesse.

<table><tbody><tr><td>293T células</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; Filtros de seringa</td><td>Sartorius</td><td>FCT122</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de 10 cm</td> As preparações <td>para vírus 430167</td> da <td>Corning</td><td>podem ser ampliadas por meio da transfecção em placas/frascos de maior capacidade - consulte a orientação do reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Placas de 12 poços</td><td>Greiner</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa cell analyzer</td><td>BD Bioscience</td><td>649225</td><td>analisadores alternativos podem ser usados desde que possam ler RFP e fluorescência YFP</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>A ATCC recomenda que o Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco seja modificado para conter 4 mM de L-glutamina, 4500 mg/L de glicose, 1 mM de piruvato de sódio e 1500 mg/L de bicarbonato de sódio.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP-231-100</td><td></td></tr><tr><td>soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>BD Bioscience-software</td> <td>de</td> <td>análise alternativa pode ser usado</td></tr><tr><td>microscópio de luz</td> <td>-</td><td></td> <td>Qualquer microscópio de luz de campo brilhante</td></tr><tr><td>p8.91</td> <td>-</td><td></td> <td>Expresso HIV GagPol (PMID: 8602510)</td></tr> <tr><td>paraformaldeído (4% em PBS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61889</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td></td><td>Sigma TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>pKB4</td><td>--</td><td></td><td>Expresso GagPol do vírus da leucemia murina (PMID: 23035841)</td></tr> <tr><td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td> <td>-</td><td></td> <td>plasmídeo de empacotamento MLV que codifica a sequência humana do tipo selvagem. Detalhes e procedimentos de clonagem Arnold et al 2015 (Ref 1).</td></tr><tr><td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP</td><td>-</td><td>-</td><td>Como acima, codifica substituições de aminoácidos em resíduos de sítios ativos cruciais</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad-https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td><td></td> <td>Outros softwares de representação de dados também são adequados</td></tr><tr><td>pVSV-G</td><td>-</td><td>-</td><td>VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternativa: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>ThermoFisher</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>tubos com tampa de rosca</td><td>StarLab</td><td>E1415-2231</td><td></td></tr><tr><td>SCRPSY</td> <td>-</td> <td>codificação de plasmídeo de embalagem de HIV RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td><td></td></tr> <tr><td>stripettes 10 mL</td><td></td><td>Corning 10084450</td><td></td></tr><tr><td>stripettes 5 mL</td><td>Corning</td><td>10420201</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Trypsin também serão adequados</td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>ThermoFisher</td><td>R0531</td><td>reagentes de transfecção alternativos também funcionarão bem</td></tr><tr><td>Células U937</td><td>ATCC</td><td>CRL-1593.2</td><td></td></tr></tbody></table>

análise da restrição de samhd1 por citometria de fluxo em células u937 mieloides humanas

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

A proteína 1 contendo domínio α motivo/histidina-aspartato (SAMHD1) inibe a replicação do HIV-1 em células mieloides quiescentes. As células U937 são amplamente utilizadas como um sistema celular conveniente para analisar a atividade SAMHD1 devido a um baixo nível de expressão de RNA SAMHD1, levando à expressão indetectável de proteínas endógenas. Com base em ensaios semelhantes desenvolvidos no laboratório Stoye para caracterizar outros fatores de restrição retroviral, o laboratório Bishop desenvolveu um ensaio de restrição de duas cores para analisar SAMHD1 em células U937. Leucemia murina Partículas semelhantes a vírus expressando SAMHD1, juntamente com YFP expresso a partir de um IRES, são usadas para transduzir células U937. As células são então tratadas com acetato de miristato de forbol para induzir a diferenciação a um fenótipo quiescente. Após a diferenciação, as células são infectadas com partículas semelhantes ao vírus HIV-1 que expressam um repórter fluorescente. Após 48 h, as células são colhidas e analisadas por citometria de fluxo. A proporção de células infectadas pelo HIV na população que expressa SAMHD1 é comparada com a de células de controle interno sem SAMHD1. Essa comparação revela uma taxa de restrição. A expressão de SAMHD1 leva a uma redução de cinco vezes na infecção pelo HIV, correspondendo a uma razão de restrição de 0,2. Nossa recente substituição da RFP pela GFP original como o gene repórter da infecção pelo HIV facilitou a análise da citometria de fluxo.
Este ensaio tem sido utilizado com sucesso para caracterizar o efeito das substituições de aminoácidos na restrição de SAMHD1 por meio da transdução com vírus que codificam proteínas SAMHD1 alteradas, derivadas da mutagênese sítio-dirigida do vetor de expressão. Por exemplo, as substituições de sítio catalítico HD206-7AA mostram um fenótipo de restrição de 1, indicando uma perda de atividade de restrição. Da mesma forma, a suscetibilidade de diferentes vírus testadores pode ser determinada. O ensaio pode ser adaptado para incorporar o efeito do status de diferenciação, estado metabólico e modificadores SAMHD1 para entender melhor a relação entre SAMHD1, estado metabólico celular e restrição viral.

Os resultados da análise acima devem produzir uma razão de restrição de 0,25 ou menor para o controle positivo SAMHD1 do tipo selvagem e 1,0 para o controle negativo. Se essas duas verificações de controle de qualidade forem válidas, considere a significância estatística dos resultados. As variantes SAMHD1 que não mostram diferença significativa do tipo selvagem, portanto, carregam substituições que não afetam a restrição SAMHD1 neste contexto. Aqueles significativamente diferentes do tipo selvagem mostram restrição prejudicada. Se estes não forem significativamente diferentes do controle negativo, então eles não têm a capacidade de restringir nesse contexto (Figura 4 painéis à esquerda).
Se o valor de restrição SAMHD1 do tipo selvagem for maior que 0,3, os resultados para vírus de teste podem ser indicativos, mas não podem ser confiáveis. A restrição ineficaz por proteína do tipo selvagem pode resultar do uso de células U937 muito cedo após a recuperação da reconstituição (dentro de 2 semanas) ou quando estiverem muito velhas (&gt;2-3 meses). Esses parâmetros podem precisar ser determinados empiricamente para um determinado estoque de células. Normalmente, quanto menor a passagem, mais confiáveis as células se diferenciam e, portanto, fornecem o ambiente apropriado para a restrição SAMHD1. O nível de infecção inadequado com SAMHD1-YFP ou HIV-RFP também pode resultar em dificuldades com a compensação e a determinação a jusante da razão de restrição. Um exemplo é ilustrado nos painéis à direita da Figura 4.
Se o controle negativo se desviar de 1,0 (fora da faixa de 0,9-1,2), isso pode indicar um problema com a análise, seja a proporção de células infectadas, a estratégia de bloqueio ou a saúde das células estão afetando o ensaio. Consulte as NOTAS acima.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg"> Figura 1: Protocolo de estrutura de tópicos esquemáticos. VLP, partículas semelhantes a vírus, PMA, acetato de miristato de phorbol. Os estágios numerados correspondem aos estágios do protocolo. Figura produzida usando BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg"> Figura 2: Esquema dos plasmídeos retrovirais . (A) Vetores de empacotamento (B) Vetores de transferência (C) Expresso de envelope VSV-G. A codificação chave e os elementos regulatórios são mostrados. Para obter detalhes, consulte a Tabela de Materiais. CMV IE: citomegalovírus promotor imediato-precoce, BGH: hormônio do crescimento bovino, pA: poliA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: promotor composto CMV-HIV-1 LTR, Psi: sinal de embalagem HIV-1, cPPT/CTS: trato polipurino central/sequência de terminação central, SV40: vírus vacuolizante símio 40. Figura produzida usando BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg"> Figura 3: Estratégia de bloqueio para análise de citometria de fluxo. (A) Controles de compensação: o painel esquerdo mostra o controle FSC-A/SSC-A em células de tato para o controle não transduzido e não infectado. Os painéis central e direito mostram capturas de tela de controles de compensação de cor única para YFP (médio) e RFP (direita) com dados não compensados em preto e compensados em azul. (B) Matriz de compensação correspondente e gráficos para controles de compensação acima. (C) Estratégia de confinamento. Os detritos são eliminados através da análise de todas as células pelo FSC-A/SSC-A (painel esquerdo). Os dubletos são excluídos por gating na altura do FSC versus área (painel central). O painel direito mostra um exemplo de restrição do HIV-1 por SAMHD1 do tipo selvagem. Os eixos mostram fluorescência a laser azul e amarela compensada correspondente às células positivas para YFP (SAMHD1) e RFP (HIV), respectivamente. As portas do quadrante são desenhadas através da comparação de controles negativos e de cor única para RFP e YFP. Os números indicam a porcentagem da população dos pais. Os valores de compensação para YFP com GFP serão muito mais altos, mas é possível discriminar usando conjuntos de filtros apropriados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg"> Figura 4: Resultados esperados: dados ideais versus subótimos. (A) Gráficos YFP/RFP representativos para dados ótimos (à esquerda) e subótimos (à direita). Os números indicam a porcentagem da população dos pais. No painel direito, a infecção pelo HIV é muito baixa, criando dificuldades com compensação e gating. A taxa de restrição é maior do que o esperado em 0,5. (B) Gráficos de razão de restrição para variantes de SAMHD1 em relação ao tipo selvagem (WT, vermelho) ou ao controle negativo (HD206-7AA, preto) gerado usando software estatístico. Cada ponto representa um valor replicado. A média e o desvio padrão são mostrados. Os testes t pareados entre cada grupo foram significativos em todos os casos esperados quando mostrados. Esquerda: Dados ideais - WT mostra a restrição esperada de aproximadamente 0,2, negativo mostra 1,0. A variante R372D (cinza) é significativamente diferente do WT, mas não significativa do controle negativo e, portanto, perdeu a capacidade de restringir. Direita: Dados subótimos. Aqui, o negativo se comporta como esperado, mas em todas as seis repetições o WT mostra apenas uma razão de restrição de 0,5, devido à baixa taxa de infecção. A baixa variância dentro dos grupos significa que R143H mostra um fenótipo intermediário estatisticamente diferente do WT e do negativo, enquanto o G209S não restringe; no entanto, isso deve ser repetido com células frescas, pois o controle positivo não deu a razão de restrição esperada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Descrito aqui é um método estabelecido para determinar a extensão da restrição do HIV-1 pela proteína inibitória celular SAMHD1. As células U937 da linhagem mieloide humana são transduzidas com um vetor de expressão SAMHD1 co-expressando YFP, diferenciadas e, em seguida, desafiadas com HIV-RFP. O nível de restrição é determinado pela análise de citometria de fluxo.

Análise da Restrição de SAMHD1 por Citometria de Fluxo em Células U937 Mieloides Humanas

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Com o crescente interesse no papel dos fatores celulares na infecção pelo HIV de macrófagos, desenvolvemos um sistema flexível de análise, particularmente para o SAM HG, que não é expresso em células U937. A principal vantagem do sistema é a sua flexibilidade. Uma vez configurado, ele pode ser usado para analisar uma variedade de proteínas, células ou vírus alvo.É importante manter a saúde das células e também estar confortável com a citometria de fluxo multicolorida. Ligue o citômetro e o computador 10 minutos antes de iniciar a análise. Certifique-se de que os resíduos estão vazios e o tanque da bainha está cheio.Em seguida, faça o login e abra o software de análise. Depois de mover o braço, tire o tubo de água. Defina a taxa de fluxo como alta e pressione prime.Espere a luz se apagar e repita este processo mais três vezes. Coloque o tubo de água de volta e corra a uma taxa de fluxo alta por três minutos. Em seguida, defina a taxa de fluxo para baixa e pressione o modo de espera até a aquisição.Selecione experimento, novo experimento e pressione OK para selecionar experimento em branco, clique com o botão direito do mouse no experimento e adicione um novo espécime. Pressione OK para o painel em branco. Clique com o botão direito do mouse para renomear com um nome apropriado e abra a amostra clicando no sinal de mais para revelar um novo tubo.Clique duas vezes no tubo para ver as configurações do citômetro no inspetor. No menu de parâmetros, exclua os fluorocromos desnecessários, exceto o laser azul 53030 e o laser amarelo 61020. Na planilha, crie uma área de dispersão direta versus gráfico de pontos de área de dispersão lateral, histograma YFP, histograma RFP e gráfico de pontos RFP versus YFP clicando no ícone correspondente e alterando os eixos clicando no rótulo do eixo.Carregue o controle não infectado e não transduzido e pressione executar na máquina. Em seguida, pressione adquirir no painel de aquisição. Ajuste as tensões de dispersão frontal e lateral no painel para posicionar as células no quadrante inferior esquerdo.Dê a volta a essa população e rotule-a como P um. Clique com o botão direito do mouse nos outros gráficos e selecione mostrar P um para remover os detritos da análise subsequente. Ajuste as tensões RFP e YFP para baixo para que o pico fique à esquerda do histograma.Carregue o controle de cor única para YFP e pressione acquire. Ajuste a tensão YFP no painel para que as células mais fluorescentes estejam dentro da faixa do detector. Em seguida, repita o mesmo para o controle RFP.Selecione o experimento. Vá para a configuração de compensação e selecione criar controles de compensação e ok para alternar para uma planilha normal, em seguida, selecione uma planilha normal não manchada. Pressione na corrida e adquira para o controle não manchado.Desenhe um portão P um ao redor das células intactas e registre. Retire o tubo e coloque a máquina em modo de espera. Clique com o botão direito do mouse em P um.Clique em aplicar a todos os controles de compensação e mude para a planilha normal de RFP. Pressione a execução e registre o controle RFP de cor única e o software ligará automaticamente as células positivas. Coloque a máquina em modo de espera e repita o mesmo para o controle YFP.Selecione experimentar, vá para configuração de compensação, selecione calcular compensação e, em seguida, clique em vincular e salvar. Alterne para a planilha global e retorne ao tubo da amostra. Adquirir as células transduzidas com SAM HD do tipo selvagem infectadas com HIV RFP, e verificar se quatro populações distintas podem ser vistas nos cantos dos quadrantes alinhados vertical e horizontalmente para YFP e RFP.Remova o tubo e pressione standby. Recarregue a amostra não transduzida e não infectada e pressione run. No painel de aquisição, defina o portão de parada como P um e eventos para registrar 30.000 eventos.Registro de imprensa. Repita o mesmo para outras amostras e controles pressionando o próximo tubo entre cada tubo. Renomeie os exemplos durante a execução ou pós-falcão e exporte os dados como arquivos FCS de ponto.Abra o software e arraste todos os arquivos FCS para o painel. Selecione os controles de compensação e arraste-os para a subpasta de compensação. Clique duas vezes no tubo não transduzido e não infectado para abrir o arquivo e encaminhar a dispersão lateral versus uma dispersão lateral de um gráfico.Selecione a ferramenta de polígono e a porta na população de células intactas, excluindo detritos no canto inferior esquerdo, e nomeie-a como células. Mova o rótulo para que ele não obscureça as células. Arraste este portão para toda a população de tubos na barra de todas as amostras.Percorra toda a população usando os botões de seta horizontal para garantir o controle apropriado para cada tubo. Clique duas vezes nas células e ajuste os eixos para altura versus área. Selecione a única grande população usando uma porta retangular para excluir duplicatas e permitir que o software sugira nomeá-la como células únicas automaticamente.Em seguida, arraste essa porta para todas as populações de células e verifique se o bloqueio é apropriado para todas as amostras. Selecione a população de células únicas para a amostra não infectada e não transduzida. Altere o eixo Y para laser azul compensado para YFP e eixo X para laser amarelo compensado para RFP.Selecione a ferramenta de bloqueio do quadrante e clique no extremo superior direito da população de células negativas. Aplique este limite preliminar a todas as populações de células individuais arrastando para a porta pai na barra de todas as amostras. Se as portas do quadrante não separarem a população satisfatoriamente, paguem os quadrantes individuais usando a ferramenta de polígono.Role até o tipo selvagem SAM HD uma única amostra para verificar o controle correto entre as células YFP negativas e positivas YFP não transduzidas. Use a visualização de contorno para discriminar as células negativas das células YFP fracas. Use a melhor divisão entre YFP negativo e positivo que é válida para todas as amostras e percorra as amostras para verificar o gating em relação à positividade do YFP.Role até a amostra infectada por RFP de HIV não transduzida e verifique se o limite entre o RFP negativo não infectado e o RFP positivo infectado está correto. Use a visualização de contorno, se necessário, e percorra as amostras restantes para verificar se o controle é válido para todas as amostras. Cada amostra requer quatro quadrantes.Q1 YFP positivo, Q2 duplo positivo, Q3 RFP positivo e Q4 duplo negativo. Abra o editor de tabelas e arraste as quatro portas do quadrante para o painel. Selecione para arquivar e excel na lista suspensa.Escolha o destino do arquivo e clique em criar tabela. Salve a planilha gerada de acordo com as convenções de nomenclatura de arquivos locais. Clique no ícone do editor de layout para exportar as representações de gráficos e estratégias de gating.Selecione cada população e arraste-a para o editor com os eixos, a rotulagem e o espaçamento necessários. Para criar um layout com os mesmos gráficos mostrados para todas as amostras na seção de lote, insira um na coluna e pressione criar relatório de lote. No menu arquivo, selecione a escala para largura e evite quebras de página.Em seguida, salve no formato de arquivo necessário. Na planilha exportada, gere as colunas conforme descrito no manuscrito do texto. Use o software de análise de dados apropriado para calcular a média dos dados replicados para cada construção SAM HD one e calcular os valores da razão de restrição.Gráficos representativos de YFP versus RFP foram gerados para dados ótimos e subótimos. O gráfico de dados subótimo indica que a infecção pelo HIV foi muito baixa e criou dificuldades com compensação e gating. A razão de restrição foi de 0,5, superior à razão esperada de 0,3.Os gráficos de razão de restrição para variantes de SAM HD um em relação ao tipo selvagem e controle negativo foram gerados para os dados ótimos e subótimos. Nos dados ótimos, o tipo selvagem apresentou a restrição esperada de aproximadamente 0,2 e o controle negativo HD 206 a sete AA apresentou a razão de restrição de 1,0. A variante R372D foi significativamente diferente do tipo selvagem, mas não significativamente diferente do controle negativo e perdeu a capacidade de restringir.Nos dados abaixo do ideal, o controle negativo se comportou como esperado, mas o tipo selvagem apresentou uma razão de restrição de 0,5 devido à baixa taxa de infecção. O R143D apresentou fenótipo intermediário estatisticamente diferente do tipo selvagem e do controle negativo. A variante G209S foi significativamente diferente do tipo selvagem, mas não significativamente diferente do controle negativo e, portanto, perdeu a capacidade de restringir.É importante ter muitas de suas células de controle, especialmente se você é novo na citometria de fluxo. Depois disso ou em paralelo, a análise bioquímica dos mesmos mutantes pode ser realizada para formar uma imagem holística.

analysis-samhd1-restriction-flow-cytometry-human-myeloid-u937

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é um ensaio in vitro em que células progenitoras hematopoéticas formar colônias em meio semi-sólido. Uma combinação de morfologia da colônia, morfologia celular e citometria de fluxo são utilizados para avaliar a capacidade dos progenitores a proliferar e se diferenciar ao longo dos diferentes linhagens hematopoiéticas.

Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

Este estudo compara dois métodos diferentes de isolamento de monócitos humanos para obtenção de células dendríticas (DCs) in vitro. Os monócitos são selecionados por aderência ou enriquecidos negativamente por separação magnética. O rendimento e a viabilidade de monócitos, juntamente com a viabilidade, proliferação e expressão de marcadores de superfície CD11c/CD14 do MDDC, serão comparados entre os dois métodos.

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Este protocolo fornece uma análise das subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central do mouse adulto por citometria de fluxo e é útil para o estudo de marcadores múltiplos expressos por essas células.

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.

Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

Aqui nós apresentamos um protocolo para caracterizar subconjuntos de monócitos por citometria de fluxo de sangue total. Isso inclui como portão os subconjuntos e avaliar sua expressão de marcadores de superfície de estrutura de tópicos e dando um exemplo da avaliação da expressão de marcadores M2 (anti-inflamatório) e M1 (inflamatória).

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Aprenda a analisar a restrição de SAMHD1 contra HIV-1 em células U937 usando citometria de fluxo bicolor. Este método quantifica a atividade de restrição viral e caracteriza variantes proteicas em células mieloides humanas.

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