Modificações do Método Langendorff para Isolamento Simultâneo de Miócitos Atrial e Ventricular de Camundongos Adultos

Este protocolo poderia ajudar a melhorar o rendimento atrial de um coração de rato perfumado. A principal vantagem deste método é que o miócito atrial e ventricular pode ser isolado simultaneamente sob a mesma condição de digestão. Este método poderia fornecer insights sobre os mecanismos de doenças cardíacas no nível celular e subcelular.

Depois de eutanásia um macho C57 preto de oito a 10 semanas de idade, use fórceps de tecido para levantar a pele do xiphoide. Em seguida, usando uma tesoura de tecido, faça uma pequena incisão lateral através da pele. Faça uma dissecção contundente entre a pele e a fáscia.

Estenda a incisão da pele em direção à axila em forma de V em ambos os lados e continue a incisão através da caixa torácica. Em seguida, usando fórceps teciduais, fixar o esterno e desviar a caixa torácica para cima para expor totalmente o coração e os pulmões. Usando fórceps curvos, retire o pericárdio.

Se a glândula timo cobrir os grandes vasos, use dois fórceps curvos para rasgar a glândula timo em direção a ambos os lados, em seguida, puxe suavemente a base do coração em direção à cauda até que a aorta e suas artérias ramificadas sejam visíveis como um vaso sanguíneo em forma de Y. Transectar a aorta na artéria carótida comum esquerda, em seguida, cortar a artéria braquiocefálica. Extirua o coração e mergulhe-o imediatamente em uma placa de Petri contendo a solução de Tyrode para lavar e bombear o sangue residual.

Em seguida, transfira o coração para outra placa de Petri contendo solução um. Sob um microscópio estéreo, usando uma tesoura iris fina, corte qualquer tecido excedente. Expulse bolhas de ar da seringa.

Em seguida, com o auxílio de dois fórceps de amarração reta, realize a canulação aórtica retrógrada, tomando cuidado para que todo o processo de cannulação seja realizado sob a superfície líquida. Ajuste a profundidade de canulação de modo que a ponta da cânula esteja na aorta ascendente, tomando cuidado para não penetrar nas válvulas aórticas. Em seguida, com uma sutura pré-nó 3-O, ligar a aorta ao entalhe de cânula.

Injete suavemente a solução 1 da seringa para eliminar o sangue residual. Em seguida, conecte o coração cânulado ao aparelho Langendorff, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar no coração. Depois de conectar o coração cânulado ao aparelho Langendorff, perfunda o coração com a solução um por aproximadamente dois minutos.

Usando uma pipeta de polietileno estéril de uso único, elabote cerca de 2,5 mililitros da solução três e pré-ataque no banho de água para uso posterior. Em seguida, para digerir os tecidos, perfundir o coração com a solução restante três por aproximadamente 11 a 12 minutos. Após os primeiros dois minutos de perfusão com a solução três, recicle a solução perfusada para os reservatórios perfusados pela bomba peristáltica para reutilização até que a digestão seja concluída.

Quando o coração fica inchado, ficando levemente pálido e flácido, usando fórceps dentados, belisque suavemente o miocárdio. Se uma impressão for visível, termine a digestão e retire o coração do aparelho. Para isolar os miócitos arterial e ventricular, use fórceps para remover ventrículos e atria e colocá-los em diferentes pratos de Petri.

Em seguida, adicione a solução pré-aquecida três para ambos os pratos. Usando força-tarefa contundente, triturar os tecidos em uma textura turva, em seguida, gentilmente pipeta o tecido para mesmo a digestão sem introduzir bolhas de ar. Para prender a atividade enzimápica restante, usando uma pipeta, transfira o tecido digerido turvo para a solução quatro, depois centrífuga por 20 segundos a 192 vezes G.Depois de remover o supernaspecido, resuspense o sedimento celular na solução cinco.

Para evitar o paradoxo do cálcio e a sobrecarga de cálcio, reintroduzir o cálcio de forma gradual, adicionando gradualmente um total de 50 microlitres de 100 milimilas por litro de cloreto de cálcio à suspensão celular. Uma vez adicionado todo o cloreto de cálcio, armazene as células da solução de Tyrode para o estudo do grampo de remendo. A profundidade da canulação está associada à perfusão do atria e seus apêndices.

Quando a ponta da cânula está na aorta ascendente, ambos os apêndices atrial são inflados indicando perfusão de atria suficiente. No entanto, quando a ponta da cânula está na raiz aórtica, ambos os apêndices atrial são enrugados, indicando perfusão insuficiente. Miócitos atrial isolados pela cannulação na aorta ascendente apresentaram taxas de sobrevivência mais altas do que aquelas isoladas pela canulação na raiz aórtica antes e depois da reintrodução do cálcio.

Em contraste, não houve diferença nas taxas de sobrevivência dos miócitos ventriculares isolados pela cannulação na aorta ascendente ou na raiz aórtica antes e depois da reintrodução do cálcio. O registro de grampo de remendo de células inteiras da corrente de sódio nos miócitos atrial e ventricular isolados, bem como as densidades atuais confirmam que a qualidade das células isoladas atende aos requisitos para experimentos eletrofisiológicos. Ao transectar a aorta, certifique-se de reter uma glândula suficiente para a ligadura.

Caso contrário, a cânula pode penetrar na válvula aórtica após a ligadura.