Name: Manchando o Ca2+ Citoplasmado com Fluo-4/AM em Celulose de Maçã (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a isolar protoplastos viáveis de celulose de maçã e detectar dinâmica de Ca²⁺ citoplasmático usando Fluo-4/AM. Este método não invasivo permite imagens de cálcio em células vegetais para estudos de desenvolvimento de frutas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Melhoria da Variedade Agrícola da Província de Shandong (2019LZGC0007) e equipe de inovação de árvores frutíferas do moderno sistema de tecnologia da indústria agrícola de Shandong (SDAIT-06-05).

1. Extração de protoplastia
<ol><li>Prepare a solução básica: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-morpholino)ácido estilesullfônico e 0,4 M D-sorbitol. NOTA: O pH da solução básica foi ajustado para 5,8 com tampão tris de 0,1 M, filtrado através de filtros solúveis em água de 0,22 μm e armazenado a 4 °C.</li>
	<li>Prepare a solução enzimática: Misture 0,3%(w/v) Macerozyme R-10 e 0,5%(w/v) cellulase R-10 com a solução básica.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de solução enzimática em um tubo centrífuga de 1,5 mL. Escolha uma maçã saudável e madura. Em seguida, corte a polpa em tamanho de 10 x 5 x 1 mm3 (Figura 1A-1C).</li>
	<li>Coloque as peças de polpa de frutas de maçã em um tubo centrífuga de 1,5 mL contendo solução enzimática e, em seguida, feche o tubo(Figura 1D).</li>
	<li>Incubar o tubo a 28 °C por 1h, tremendo a 70 rpm/min em um agitador no escuro.</li>
	<li>Lave os pedaços de polpa. Aspire toda a solução enzimática e adicione 0,5 mL da solução básica.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g por 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para obter uma suspensão protoplasta, aspire a solução a partir da parte inferior do tubo de centrífuga(Figura 1E).</li>
</ol>2. Coloração de fluorescência de íons de cálcio de pequena molécula
<ol><li>Prepare a solução de carregamento Fluo-4/AM com Fluo-4/AM de 2 mM, 20% F-127, e 10x salina tamponada com fosfato (PBS:80 mM Na2HPO4, 1,36 M NaCI, 20 mM KH2PO4e 26 mM KCI) em uma proporção de 1:1:2.</li>
	<li>Adicione 1 μL de solução de carregamento Fluo-4/AM a 99 μL da suspensão protoplasta presente nos tubos de centrífugas de 1,5 mL. Certifique-se de que a concentração final do corante fluorescente é de 5 μM. Misture a solução e feche o tubo.</li>
	<li>TratamentoLa 3+: Prepare a solução 100 μM La3+ com 98 μL da suspensão protoplasta, 1 μL de 10 mM La3+e 1 μL de solução de carregamento Fluo-4/AM. Misture a solução e feche o tubo.</li>
	<li>Incubar por 30 min a 37 °C no escuro.</li>
	<li>Lave os protoplastos por centrifugação a 300 x g por 2 min a temperatura ambiente. Aspire 70 μL da solução e adicione 70 μL da solução básica.</li>
	<li>Incubar a suspensão do protoplasto a 37 °C por 30 min para desestárrio completamente.</li>
	<li>Aspire 15 μL da suspensão protoplasta e gotejamento em um slide.</li>
	<li>Observar sob um microscópio de fluorescência(Figura Suplementar S1). NOTA: Use uma câmera colorida com alta sensibilidade, ou seja, sensor CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) com resolução de pixels de 3,45 μm.</li>
	<li>Selecione o canal GFP para imagem (20x). Coloque o brilho em 0,5. NOTA:A iluminação é de cubos de luz LED de intensidade ajustável com um conjunto integrado de filtro revestido de força. O comprimento de onda de excitação do Fluo-4/AM é de 490 nm.</li>
</ol>3. Ensaio de viabilidade protoplasta
<ol><li>Prepare a solução de estoque fluoresceína (FDA): Dissolver a FDA em acetona até que a concentração final seja de 1 mg/mL.</li>
	<li>Prepare a solução de trabalho da FDA com 1 μL da solução de estoque e 99 μL de acetona.</li>
	<li>Adicione 1 μL de solução de trabalho fda a 99 μL de suspensão protoplasta. Misture a solução pipetando para cima e para baixo e, em seguida, feche o tubo. NOTA: A concentração final da FDA é de 100 μg/L.</li>
	<li>Mancha à temperatura ambiente por 5 minutos no escuro.</li>
	<li>Prepare os slides e observe sob um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Selecione o canal GFP para imagem(Figura 1F).</li>
</ol>4. Análise de imagem
<ol><li>Analise as imagens adquiridas utilizando análise de imagens e software de planilha (por exemplo, Image-Pro Plus e Excel 2010).</li>
	<li>Selecione dois diâmetros verticais dos protoplastos para calcular a intensidade da fluorescência(Figura Suplementar S2). Medida a intensidade de fluorescência de todos os protoplastos em diferentes tratamentos foi medida. Para processamento final, use software de edição de fotos.</li>
</ol>5. Análise estatística
<ol><li>Realizar análise estatística utilizando software estatístico(Figura Suplementar S3). Os dados são apresentados em Média ± SD. O teste tdo aluno foi utilizado para analisar as diferenças entre os grupos experimentais.</li>
</ol>

<ol><li>Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+calcium%3A+Transport+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Fruit calcium: Transport and physiology.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).</li>
<li>Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+indole+butyric+acid+on+the+transportation+of+stored+calcium+in+Malus+hupehensis+rhed.+Seedling%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+Sciences+in+China%22%5BJournal%5D)">Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling.</a> Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).</li>
<li>Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+calcium+sensors+in+fruit+development+and+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening.</a> Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).</li>
<li>Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color%2C+flavor%2C+texture%2C+and+nutritional+quality+of+fresh-cut+fruits+and+vegetables%3A+desirable+levels%2C+instrumental+and+sensory+measurement%2C+and+the+effects+of+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).</li>
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<li>Miqueloto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+fruit+calcium+content+and+susceptibility+to+bitter+pit+in+cultivars+of+apple%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+horticulturae%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple.</a> Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).</li>
<li>Kou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CaCl2+dipping+and+pullulan+coating+on+the+development+of+brown+spot+on+%27Huangguan%27+pears+during+cold+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage.</a> Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).</li>
<li>Vinh, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+on+blossom-end+rot+incidence+in+two+tomato+cultivars+in+relation+to+calcium+nutrition+and+fruit+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Horticulture+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth.</a> The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).</li>
<li>Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foliar+calcium+applications+for+controlling+fruit+disorders+and+storage+life+in+deciduous+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Japan+Agricultural+Research+Quarterly%22%5BJournal%5D)">Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees.</a> Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.

Neste estudo, protoplastos viáveis foram obtidos por hidrólise enzimática. Observe que este método requer maçãs frescas. O presente protocolo permite o rápido isolamento de um grande número de protoplastos da polpa de frutas para uso em estudos de pesquisa. A aplicabilidade deste método não se limita a 'Fuji'; os protoplastos da polpa de maçã de 'Dounan' e 'Honey Crisp' também podem ser extraídos através do mesmo protocolo(Figura Suplementar S4). A solução protoplasta após a enzima contém detritos celula...

O Ca2+ desempenha um papel importante na transdução de sinal vegetal e no metabolismo1,2. Além disso, regula os traços de qualidade da fruta3,4, incluindo dureza, teor de açúcar e suscetibilidade a distúrbios fisiológicos durante o armazenamento5,6. O Ca2+ citoplasmado desempenha um papel importante na transdução de sinais e regula o crescimento e o desenvolvimento das plantas7. A perturbação da homeostase de cálcio celular pode induzir o poço amargo nas maçãs8, doença da mancha marrom nas peras9e podridão umbilical no tomate10, afetando a qualidade da fruta e causando severas perdas econômicas3,11. A imagem de cálcio tem resolução espacial e temporal suficiente e é um método importante para observar a dinâmica ca2+ em células vivas12,13.
Atualmente, existem dois métodos principais para a imagem intracelular de cálcio em células vivas: um emprega sondas fluorescentes químicas de pequeno porte molecular14, e o outro é o sensor de codificação genética (GECI)15,16. Dada a dificuldade de estabelecer um sistema transgênico estável em árvores frutíferas e desenvolvimento de frutas mais longas, o GECIS é inadequado para a imagem de fluorescência ca2+ frutífera.
Sondas fluorescentes de pequenas moléculas como o Fluo-4/AM têm uma vantagem particular: sua forma de éster AM (derivado de éster acetoximetila permeável celular) pode ser prontamente carregada em massa em células vivas sem a necessidade de transfecção, o que a torna flexível, rápida e não citotóxica17. Fluo-4/AM poderia ser carregado com sucesso no tubo de pólen de Pyrus pyrifolia18 e Petúnia,19, bem como em células de guarda20 e cabelo raiz de Arabidopsis21.
Atualmente, há poucos relatos sobre a coloração da fluorescência de cálcio das célulasde polpa 22. Como elemento mineral importante, o cálcio desempenha um papel fundamental no crescimento e controle de qualidade de frutos das árvores, como maçãs. As macieiras são reconhecidas mundialmente como uma espécie econômica importante, e as maçãs são consideradas um alimento saudável23. Neste estudo, obtivemos protoplastos viáveis da polpa de frutas de maçã através da hidrólise enzimática e, em seguida, carregamos reagentes fluorescentes de pequenas moléculas no citoplasma para detectar Ca2+.

<table><tbody><tr><td>10 vezes; solução salina tamponada com fosfato</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>PBS (solução tamponada com fosfato) é uma solução tampão de fosfato, que pode fornecer um ambiente iônico relativamente estável e capacidade tampão de pH. É uma solução salina tampão frequentemente usada em biologia para clonagem molecular e cultura de células. O pH é 7,4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico</td><td>Solarbio</td><td>M8010</td><td>Tampão biológico</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8370</td><td>O cloreto de cálcio di-hidratado é um produto químico branco ou cinza, principalmente na forma granular.</td></tr><tr><td>Celulase R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7352</td><td>Degrada as paredes celulares das plantas.</td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Solarbio</td><td>S8090</td><td>Possui boas propriedades hidratantes, evita o ressecamento e evita a cristalização de açúcar, sal, etc.</td></tr><tr><td>F-127</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6867</td><td>Pluronic F-127 é um poliol surfactante não iônico (peso molecular de aproximadamente 12500 Daltons), que foi considerado benéfico para promover a dissolução de corantes insolúveis em água e outros materiais em meios fisiológicos.&nbsp;</td></tr><tr><td>FDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td>FDA é um substrato de esterase permeável por célula que pode servir como uma sonda de viabilidade que mede tanto a atividade enzimática, que é necessária para ativar sua fluorescência, quanto a integridade da membrana celular, que é necessária para a retenção intracelular de seu produto fluorescente.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>O indicador de cálcio fluorescente verde Fluo-4/AM é uma versão melhorada do indicador de cálcio Fluo-3/AM. O Fluo-4/AM carrega mais rápido e é mais brilhante na mesma concentração. Pode ser bem excitado com um laser de íons de argônio de 488 nm.</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Thermo Fisher</td><td>EVOS Auto 2</td><td>Observe a imagem de fluorescência.</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7351</td><td>Degrada o tecido vegetal para separar células individuais.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td>É amplamente utilizado na preparação de tampões em experimentos de bioquímica e biologia molecular.</td></tr></tbody></table>

manchando o ca2+ citoplasmado com fluo-4/am em celulose de maçã

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

O Cítosol Ca2+ desempenha um papel fundamental no desenvolvimento das plantas. A imagem de cálcio é o método mais versátil para detectar alterações dinâmicas no Ca2+ no citoplasma. Neste estudo, obtivemos protoplastos viáveis de células polpais por hidrólise enzimática. Protoplastias isolados foram incubados com o reagente fluorescente de pequenas moléculas (Fluo-4/AM) por 30 min a 37 °C. As sondas fluorescentes mancharam com sucesso o Ca2+ citosol, mas não se acumularam em vacúolos. La3+, um bloqueador de canal Ca2+, diminuiu a intensidade de fluorescência citoplasmática. Esses resultados sugerem que o Fluo-4/AM pode ser usado para detectar alterações no Ca2+ citosolico na carne de fruta. Em resumo, apresentamos um método para isolar efetivamente protoplastos das células carníolas da fruta e detectar o Ca2+ carregando um reagente fluorescente de cálcio de pequenas moléculas no citoplasma das células de polpa.

Seguindo o protocolo descrito acima, utilizou-se o método enzimático para obter protoplastos viáveis da polpa (Figura 1). Alguns protoplastos tinham vacuoles, enquanto outros não. Enquanto os protoplastos não apresentaram fluorescência quando o indicador fluorescente Ca2+ não foi carregado neles. Quando o Fluo-4/AM foi carregado nos protoplastos, o citoplasma, mas não o vacuole, tornou-se fluorescente(Figura 2). Este resultado indicou que o Fluo-4/AM ...

Protoplastias isolados de células de celulose de maçã foram carregados com um reagente fluorescente de cálcio para detectar concentração de Ca2+ citoplasmática.

Manchando o Ca2+ Citoplasmado com Fluo-4/AM em Celulose de Maçã

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

Como elemento mineral importante, o cálcio desempenha um papel fundamental no crescimento e no controle de qualidade de frutas como a maçã, pode regular a dureza, o teor de açúcar, o período de armazenamento e a desordem fisiológica durante o armazenamento. A imagem de cálcio é o método mais ocidental para detectar alterações dinâmicas nos íons de cálcio no citoplasma. Indicadores fluorescentes de moléculas pequenas, como o fluo-4/AM, têm seletividade específica de íons de cálcio e podem ser carregados não invasivamente pela incubação de esterificação, que é flexível, rápida e não citotóxica.Este protocolo introduzirá um método para carregar fluo-4/AM de reagente fluorescente químico de pequenas moléculas em protoplastos vegetais. Extração protoplasta Adicione 0,5 mililitro de solução enzimada em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Escolha uma maçã saudável e madura, em seguida, corte a polpa em 10 vezes 5 vezes 1 mililitro cúbico tamanho.Coloque as peças de polpa em solução enzimática e feche o tubo. Incubar tubo a 28 graus por uma hora. Barrado a 70 rpm no escuro.Depois disso, lave as peças de polpa, aspire toda a solução enzimática e adicione 0,5 mililitro de solução básica.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma abordagem robusta para monitorar a entrega de organelas para a luz ácida do vacúolo levedura para a degradação e reciclagem é descrito. O método baseia-se na rotulagem específica de organelas-alvo com uma geneticamente codificado fluorescência dupla emissão de pH biosensor, e visualização de células individuais usando a microscopia de fluorescência.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Atividade espontânea de desenvolvimento de redes neuronais podem ser medidos utilizando-AM éster formas de corantes de cálcio sensível indicador. Alterações de cálcio intracelular, o que indica a ativação neuronal, são detectados como alterações transitórias na fluorescência indicador com um ou dois fótons de imagem. Este protocolo pode ser adaptada para uma série de developmentally dependentes de redes...

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

Neste vídeo, descrevemos um procedimento de coloração para visualizar a deposição de celulose dentro das paredes celulares de Arabidopsis thaliana, uma planta dicotiledônea, usando branco de calcofluor, que se liga especificamente a glucanos ligados à β, exibindo fluorescência sob luz UV.

Coloração branca de calcofluor: um método simples para visualização de fluorescência induzida por UV de depósitos de celulose em paredes celulares de seções de caule de plantas dicotiledôneas

Descreve-se o uso de corantes estiril FM imagem sináptica reciclagem vesícula nos terminais nervosos funcionais. Este protocolo pode ser aplicado não só a evocada, mas também espontânea e actividades sinápticas em miniatura. O protocolo expande a variedade de eventos sinápticos que podem ser eficazmente analisados.

Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

A composição da parede celular vegetal varia entre os tipos de tecido e pode incluir lignina, celulose, hemiceluloses e pectina. Várias técnicas de coloração foram desenvolvidas para visualizar as diferenças no nível do tipo de célula. Este artigo é uma compilação de técnicas de coloração da parede celular comumente usadas.

Coloração histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celular Secundária parede Elements

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

Atualmente, a maioria dos indicadores de cálcio disponíveis são usados para quantificar transientes citoplasmáticos de cálcio como medidas indiretas de cálcio liberado do retículo sarcoplasmático em células musculares lisas cultivadas. Este protocolo descreve o uso de um indicador específico baseado em FRET que permite a medição direta de sinais de cálcio dentro do lúmen do retículo sarcoplasmático.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

Aqui, é descrito um método para tornar os tecidos vegetais transparentes, mantendo a estabilidade das proteínas fluorescentes. Esta técnica facilita a imagem profunda de tecidos vegetais limpos sem seção física.

Limpeza Óptica de Tecidos Vegetais para Imagem de Fluorescência

Aprenda a isolar protoplastos viáveis de celulose de maçã e detectar dinâmica de Ca²⁺ citoplasmático usando Fluo-4/AM. Este método não invasivo permite imagens de cálcio em células vegetais para estudos de desenvolvimento de frutas.

Manchando o Ca²⁺ Citoplasmado com Fluo-4/AM em Celulose de Maçã

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