Análise do volume do nódulo linfático por ultra-alta frequência ultrassom no modelo de camundongos geneticamente modificado braf/pten de melanoma

Nosso método permite monitorar o aumento do envolvimento metastático de linfonodos inguinais medindo o aumento de seu volume. Este método não invasivo é muito bem tolerado, portanto, várias sessões de imagem podem ser agendadas no mesmo animal experimental ao longo de duas semanas. Este método é ideal para avaliar o impacto do tratamento farmacológico sobre a doença metastática.

Aplicamos este método ao modelo de melanoma Braf/Pten, mas, em princípio, pode ser adaptado para avaliar a eficácia de várias drogas em uma variedade de modelos de camundongos pré-clínicos de câncer metastático. O procedimento será a Dra. Para indução de melanoma, aplique três microlitres de cinco milimonas 4-hidroxitamoxifen em aproximadamente um centímetro quadrado de pele raspada da parte superior das costas por três dias seguidos.

Seis semanas após a pintura da pele, use pinças para medir o volume do tumor primário e, eventualmente, de metástases subcutâneas. Em seguida, use imagens de ultrassom para medir o volume dos linfonodos inguinais. Depois de analisar o tumor primário e os linfonodos por inspeção visual, extirvo-os para estudos histológicos.

Após confirmar a anestesia, transfira o animal para uma placa aquecida da estação de ultrassom de ultra-alta frequência, segurando o animal em uma posição supina. Ajuste a temperatura da placa usando uma sonda retal lubrificada com geleia de petróleo para manter a temperatura corporal do camundongo na faixa fisiológica. Cubra as patas dianteiras e traseiras com pasta condutora e grave-as nos eletrodos da placa ECG embutidos na placa.

Verifique se os parâmetros fisiológicos são corretamente adquiridos e exibidos. Remova o cabelo de ambas as áreas inguinais aplicando um agente depilatório e cubra-os com um meio de acoplamento acústico. Em seguida, fixar a sonda linear de ultra-alta frequência em um motor 3D especializado embutido na estação de imagem, permitindo o movimento automatizado e stepwise da sonda.

Oriente corretamente e ajuste a posição da sonda de ultrassom para obter imagens de curto acesso do linfonodo inguinal e coloque a região de interesse da zona focal. Defina a distância de varredura entre dois e cinco milímetros, tamanho do passo para 44 micrômetros com um resultado de 46 a 114 passos de varredura por fatia de linfonodo, e um tempo de aquisição de um a três minutos por animal. Escaneie todo o volume do linfonodo inguinal como uma sequência de imagens do modo B 2D, adquirindo imagens em vários níveis por movimento linear do transdutor com tamanhos de passo em uma escala de micrômetro para gerar dados 3D em termos de respiração e laços de cine com porta cardíaca.

Após a imagem, armazene digitalmente as imagens adquiridas em formato bruto para novas análises offline. Para pós-processamento de imagens de ultrassom, abra o conjunto de dados das imagens linfonodas inguinais 3D, selecione o método multi-fatia e pressione o botão Iniciar para visualizar os quadros atuais e miniaturas de todos os quadros correspondentes a cada imagem capturada durante a aquisição 3D. Selecione a miniatura do primeiro quadro onde o linfonodo é evidente para carregá-lo na visão de contorno.

Na visão de contorno, clique à esquerda no mouse para soltar pontos ao longo da borda do linfonodo. Uma vez definido o número desejado de pontos, lamba direito para completar o contorno. Após o primeiro contorno ser concluído, use a exibição da miniatura para selecionar a próxima imagem para contorno.

Se necessário, pule várias imagens entre contornos para reduzir o número de traços manuais necessários para cada volume 3D. Repita este processo até que todo o volume tenha sido delineado e clique em Concluir. Enquanto estiver no espaço de trabalho da janela do modo 3D, clique no ícone de medição de volume abaixo da área de exibição da imagem para visualizar o valor numérico do volume do linfonodo e ative a visão da superfície com a renderização 3D do volume do linfonodo.

Tratar camundongos com 4-hidroxytamoxifen induz a atividade enzimática creer, causando um interruptor no nível genômico de Braf tipo selvagem para Braf V600E mutado, enquanto Pten está perdido. Quatro semanas após o tratamento de 4-hidroxytamoxifen, os tumores primários atingem um volume de 50 a 100 milímetros cúbicos e seu crescimento pode ser medido por pinças por mais duas semanas, mostrando assim um aumento gradual da pigmentação observada nos linfonodos inguinais. Os depósitos de melanina são invariavelmente devido à presença de células de melanoma metástase, como confirmado pela coloração imunohistoquímica do antígeno melanoma MelanA e Braf V600E.

Ao final da fase de segmentação, todas as seções apresentaram a sobreposição do contorno externo do linfonodo. As renderizações 3D de um linfonodo inguinal direito, analisadas às quatro, cinco e seis semanas após o tratamento 4-HT são mostradas aqui. O aumento do volume dos linfonodos inguinais esquerdo e direito do mesmo animal ao longo do tempo também foi quantificado.

Recomenda-se acoplar imagens de ultrassom com coloração imunohistoquímica apropriada, para que a presença de células cancerígenas seja confirmada a nível molecular. Além dos linfonodos, o volume de metástase subcutânea também pode ser monitorado ao longo do tempo usando imagens de ultrassom. Se o prazo de duas semanas for muito curto para apreciar os efeitos da droga em estudo, selecione um local de indução mais periférico ou um genótipo menos propenso a tumores.