Name: Três métodos diferenciais de análise de expressão para sequenciamento de RNA: limma, EdgeR, DESeq2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a realizar análise de expressão diferencial em dados de RNA-seq usando limma, EdgeR e DESeq2 no RStudio. Este protocolo compara três métodos amplamente utilizados em bioinformática para identificar genes diferencialmente expressos em colangiocarcinoma.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860276) e key Special Fund Projects of National Key P&D Program (Grant No. 2018YFC1003200).

NOTA: Abra o programa R-studio e carregue o arquivo R "DEGs.R", o arquivo pode ser adquirido a partir de arquivos suplementares/Scripts.
1. Download e pré-processamento de dados
<ol><li>Baixe os dados da contagem de colhidos (HTSeq) de cholangiocarcinoma (CHOL) do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA). Esta etapa pode ser facilmente alcançada pelo seguinte código R.<ol>
<li>Clique em Executar para instalar pacotes R.</li>
		<li>Clique em Executar para carregar pacotes R. se(!requeroospace("BiocManager", silenciosamente=TRUE)) + install.packages("BiocManager") BiocManager::install(c("TCGAbiolinks", "SummarizedExperiment"))</li>
		<li>Defina o diretório de trabalho. biblioteca (TCGAbiolinks) biblioteca (SummarizedExperiment) setwd ("C:/Users/LIUSHIYI/Desktop")</li>
		<li>Escolha o tipo de câncer. câncer <- "TCGA-CHOL"</li>
		<li>Execute o código R do arquivo "GDCquery.R" para baixar os dados. O arquivo "GDCquery.R" pode ser adquirido a partir de arquivos suplementares/Scripts: fonte ("Arquivos suplementares/Scripts/GDCquery.R") cabeça(cnt) ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##ENSG00000000003 4262 ##ENSG00000000005 1 ##ENSG00000000419 1254 ##ENSG00000000457 699 ##ENSG00000000460 239 ##ENSG00000000938 334 NOTA: Após a execução, os dados da contagem de CHOLHTSeq serão baixados e nomeados "cnt", onde as linhas representam IDs e colunas genéticas do conjunto representam IDs de amostra. Observe os números nas posições 14-15 nos IDs da amostra; números que variam de 01 a 09 indicam tumores e variando de 10 a 19 indicam tecidos normais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Converta os genes do conjunto em símbolos genéticos.<ol>
<li>Importe o arquivo de anotação em R de acordo com seu caminho de armazenamento. O arquivo de anotação (gencode.v22.anotação.gtf) pode ser adquirido a partir de arquivos suplementares. gtf_v22 <-rtracklayer::import('Arquivos suplementares/gencode.v22.anotação.gtf')</li>
		<li>Execute o código R do "gtf_v22. Arquivo R", que pode ser adquirido a partir de arquivos suplementares/Scripts: fonte ("Arquivos suplementares/Scripts/gtf_v22. R")</li>
		<li>Aplique a função "ann" para converter os IDs genéticos do conjunto em símbolos genéticos. cnt=ann(cnt,gtf_v22)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtrando genes de baixa expressa<ol>
<li>Clique em Executar para instalar o pacote R "edgeR". BiocManager::install("edgeR")</li>
		<li>Clique em Executar para carregar o pacote R "edgeR". biblioteca (edgeR)</li>
		<li>Execute o seguinte código R para manter os genes com valores de contagem por milhão (CPM) maiores que um em pelo menos duas amostras. manter <-rowSums(cpm(cnt)>1)>=2 cnt <- as.matrix(cnt[keep,]) NOTA: O valor de contagem por milhão (CPM) é usado em vez da contagem de leitura para eliminar o desvio causado por diferentes profundidades de sequenciamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análise de expressão diferencial através de "limma"
<ol><li>Clique em Executar para instalar o pacote R "limma". BiocManager::install("limma")</li>
	<li>Clique em Executar para carregar os pacotes R "limma", "edgeR". biblioteca (limma) biblioteca (edgeR)</li>
	<li>Execute o seguinte código R para criar a matriz de design. grupo <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information grupo [grupo %em% "01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue grupo [grupo %em% "11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue grupo <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))
	<ol><li>Crie a matriz de design. design <-model.matrix (~grupo) nomes de linha (design) <-colnames(cnt)</li>
		<li>Crie o objeto DGEList. dge <- DGEList(contagens = cnt, grupo = grupo)</li>
		<li>Normalize os dados. dge <-calcNormFactors(dge, método = "TMM")</li>
		<li>Execute o seguinte código R para executar a análise de expressão diferencial baseada no método limma-trend. dge ##An objeto da classe "DGEList" ##$counts ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##TSPAN6 4262 ##DPM1 1254 ##SCYL3 699 ##C1orf112 239 ##FGR 334</li>
		<li>Calcule o valor do CPM. logdge <-cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)</li>
		<li>Clique em Executar para encaixar em um modelo linear para prever os dados ou inferir a relação entre variáveis. caber <-lmFit (logdge, design)</li>
		<li>Calcule o valor T, o valor F e as probabilidades de log com base no Bayesian. ajuste <-eBayes (fit, trend=TRUE)</li>
		<li>Extrair a tabela de resultados. res_limma<-as.data.frame (topTable(fit,n=Inf)) cabeça (res_limma) ## logFC AveExpr t P.Value adj. P.Val B ##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823 ##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656 ##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001 ##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056 ##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704 ##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543 #The resultado da análise de expressão diferencial é salvo em "res_limma", que inclui o id genético, o valor de alteração do fold log2 (logFC), o nível médio de expressão log2 do gene no experimento (AveExpr), a estatística t modificada (t), o valor de relavent p (P.Value), a taxa de descoberta falsa (FDR) corrigida p valor (adj). P.Val) e as probabilidades de log de genes expressos diferencialmente (B) NOTA: A função "calcNormFactors()" do "edgeR" foi usada para normalizar os dados para eliminar a influência causada pela preparação da amostra ou construção e sequenciamento da biblioteca. Na construção da matriz de design, é necessário combinar o design experimental (por exemplo, tipo de tecido: tecidos normais ou tumorais) para amostrar IDs da matriz. limma-trend é adequado para dados cuja profundidade de sequenciamento é a mesma, enquanto limma-voom é adequado: (i) quando o tamanho da biblioteca de amostras é diferente; (ii) dados não normalizados pela TMM; (iii) há muito "ruído" nos dados. Um logFC positivo significa que o gene é regulado no experimento, enquanto o número negativo significa que o gene é regulado.</li>
		<li>Identifique os DEGs. res_limma$sig <- como.factor( ifelse (res_limma$adj. P.Val < 0,05 & abs (res_limma$logFC) > 2, ifelse (res_limma$logFC > 2 'up'',''down'),''')) # O valor adj.p < 0,05 e o |log2FC| >= 2 são limiares para identificar os DEGs resumo (res_limma$sig) ##down não para cima ##1880 ​17341 1443</li>
		<li>Saída a tabela de resultados para um arquivo. escrever.csv(res_limma, arquivo = 'result_limma.csv')</li>
		<li>Clique em Executar para instalar o pacote R "ggplot2". install.packages("ggplot2")</li>
		<li>Clique em Executar para carregar o pacote R "ggplot2". biblioteca(ggplot2)</li>
		<li>Execute o código R do vulcão. R" para criar o enredo do vulcão. O arquivo "vulcão. R" pode ser adquirido a partir de arquivos complementares. fonte ("Arquivos suplementares/Scripts/volcano. R") vulcão (res_limma,"logFC","adj. P.Val",2,0,05) NOTA: Os genes podem ser mapeados para diferentes posições de acordo com seus valores log2FC e adj-p, os DEGs regulamentados para cima são coloridos em vermelho e os DEGs regulamentados são coloridos em verde.</li>
		<li>Clique em Exportar para salvar o enredo do vulcão. NOTA: As parcelas do vulcão podem ser geradas e baixadas em diferentes formatos (por exemplo, pdf, TIFF, PNG, formato JPEG). Os genes podem ser mapeados para diferentes posições de acordo com seus valores log2FC e adj p, os DEGs up-regulated (log2FC > 2, adj p < 0,05) são coloridos em vermelho, e os DEGs não regulamentados (log2FC < -2, adj p < 0,05) são coloridos em verde, não-DEGs são coloridos em cor cinza.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise diferencial da expressão através do "edgeR"
<ol><li>Clique em Executar para carregar o pacote R "edgeR". biblioteca (edgeR)</li>
	<li>Execute o seguinte código R para criar matriz de design. grupo <-substring (colnames(cnt),14,15) grupo [grupo %em% "01"] <- "Câncer" grupo [grupo %em% "11"] <- "Normal" group=fator (grupo, níveis = c("Normal","Câncer")) design <-model.matrix(~grupo) nomes de linha (design) = colnames(cnt)</li>
	<li>Clique em Executar para criar o objeto DGEList. dge <-DGEList (counts=cnt)</li>
	<li>Normalize os dados. dge <-calcNormFactors(dge, método = "TMM")</li>
	<li>Clique em Executar para estimar a dispersão dos valores de expressão genética. dge <- estimativaDisp(dge, design, robusto = T)</li>
	<li>Clique em Executar para ajustar o modelo para contar dados. caber <-glmQLFit(dge, design)</li>
	<li>Faça um teste estatístico. caber <-glmQLFTest (fit)</li>
	<li>Extrair a tabela de resultados. O resultado é salvo em "res_edgeR", que inclui o valor de alteração do fold de log, o cpm de registro, f, valor p e valor p corrigido fdr. res_edgeR=as.data.frame(topTags(fit, n=Inf)) cabeça (res_edgeR) ## logFC logCPM F PValue FDR ##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21 ##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R ##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20 ##ADI1 -3,533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20 ##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20 ##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19 #The resultado é salvo em "res_edgeR", que inclui o valor de alteração da dobra de log (logFC), cpm de registro, F, valor p e valor p corrigido por FDR</li>
	<li>Identifique os DEGs. res_edgeR$sig = as.factor( ifelse (res_edgeR$FDR < 0,05 & abs (res_edgeR$logFC) > 2, ifelse (res_edgeR$logFC > 2 'up','down'),''')) resumo (res_edgeR$sig) ##down não para cima ##1578 15965 3121</li>
	<li>Saída a tabela de resultados para um arquivo. escrever.csv(res_edgeR, arquivo = 'res_edgeR.csv')</li>
	<li>Crie o enredo do vulcão. vulcão (res_edgeR,"logFC","FDR",2,0,05)</li>
	<li>Clique em Exportar para salvar o enredo do vulcão.</li>
</ol>4. Análise de expressão diferencial através do "DESeq2"
<ol><li>Clique em Executar para instalar pacotes R "DESeq2". BiocManager::install("DESeq2")</li>
	<li>Clique em Executar para carregar pacotes R "DESeq2". biblioteca (DESeq2)</li>
	<li>Execute o seguinte código R para determinar o fator de agrupamento. grupo <-substring (colnames(cnt),14,15) grupo [grupo %em% "01"] <- "Câncer" grupo [grupo %em% "11"] <- "Normal" group=fator (grupo, níveis = c("Normal","Câncer"))</li>
	<li>Crie o objeto DESeqDataSet. dds <-DESeqDataSetFromMatrix (cnt, DataFrame(grupo), design = ~grupo) Dds ##class: DESeqDataSet ##dim: 20664 45 ##metadata(1): versão ##assays(1): conta ##rownames(20664): TSPAN6 DPM1 ... RP11-274B21.13 LINC01144 ##rowData nomes(0): ##colnames(45): TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ... ##colData nomes(1): grupo</li>
	<li>Faça a análise. dds <-DESeq(dds)</li>
	<li>Gere a tabela de resultados. res_DESeq2 <-data.frame(resultados(dds)) cabeça (res_DESeq2) ## baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj ##TSPAN6 4704.9243 -0,8204515 0,3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02 ##DPM1 1205.9087 -0,3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03 ##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01 ##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03 ##FGR 345.8789 -0,6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01 ##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11 NOTA: O resultado é salvo em "res_DESeq2", que inclui a média da contagem de leitura normalizada (baseMean), valor de alteração do fold de log (log2FoldChange), erro padrão de alteração de dobra de log (lfcSE), a estatística de Wald (stat), valor p original (pvalue) e valor p corrigido (padj)</li>
	<li>Identifique deGs. res_DESeq2$sig = as.factor( ifelse (res_DESeq2$padj < 0,05 & abs (res_DESeq2$log2FoldChange) > 2, ifelse (res_DESeq2$log2FoldChange > 2 'up','down'),''')) resumo (res_DESeq2$sig) ##down não para cima ##1616 16110 2938</li>
	<li>Saída a tabela de resultados para um arquivo. escrever.csv(res_DESeq2, arquivo = 'res_DESeq2.csv')</li>
	<li>Crie o enredo do vulcão. vulcão (res_DESeq2,"log2FoldChange","padj",2,0,05)</li>
	<li>Clique em Exportar para salvar o enredo do vulcão.</li>
</ol>5. Diagrama de Venn
<ol><li>Clique em Executar para instalar o pacote R "VennDiagram". install.packages("VennDiagram")</li>
	<li>Clique em Executar para carregar o pacote R "VennDiagram". biblioteca (VennDiagram)</li>
	<li>Faça um diagrama de Venn de DEGs regulamentados. grid.newpage() grid.draw (venn.diagram(lista(Limma=rownames(res_ limma[res_limma$sig=="up",]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig=="up",]), DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig== "para cima",])), NULO, altura = 3,largura = 3,unidades = "in", col="preto",lwd=0,3,fill=c ("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), alfa=c (0,5, 0,5, 0,5), principal = "DEGs regulados"))</li>
	<li>Clique em Exportar para salvar o diagrama de Venn.</li>
	<li>Faça um diagrama de Venn de DEGs regulamentados. grid.newpage() grid.draw (venn.diagram(lista(Limma=rownames(res_ limma[res_limma$sig=="down",]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig== "para baixo",]), DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig="down",]), NULO, altura = 3,largura = 3,unidades = "in", col="preto",lwd=0,3,fill=c ("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), alfa=c (0,5, 0,5, 0,5), principal = "DEGs não regulados"))</li>
	<li>Clique em Exportar para salvar o diagrama de Venn.</li>
</ol>

<ol><li>Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Expression+Analysis+in+RNA-seq+Data+Using+a+Geometric+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach.</a> Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count-based+differential+expression+analysis+of+RNA+sequencing+data+using+R+and+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Count-based differential expression analysis of RNA sequencing data using R and Bioconductor.</a> Nature Protocols. 8, 1765-1786 (2013).</li>
<li>McDermaid, A., Monier, B., Zhao, J., Liu, B., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+differential+gene+expression+results+of+RNA-seq+data%3A+review+and+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Interpretation of differential gene expression results of RNA-seq data: review and integration.</a> Briefings in Bioinformatics. 20, 2044-2054 (2019).</li>
<li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+differential+expression+analysis%3A+An+extended+review+and+a+software+tool%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12, 0190152(2017).</li>
<li>Law, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+is+easy+as+1-2-3+with+limma%2C+Glimma+and+edgeR%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis is easy as 1-2-3 with limma, Glimma and edgeR.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Varet, H., Brillet-Guéguen, L., Coppée, J. Y., Dillies, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARTools%3A+A+DESeq2-+and+EdgeR-Based+R+Pipeline+for+Comprehensive+Differential+Analysis+of+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SARTools: A DESeq2- and EdgeR-Based R Pipeline for Comprehensive Differential Analysis of RNA-Seq Data.</a> PloS One. 11, 0157022(2016).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43, 47(2015).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26, Oxford, England. 139-140 (2010).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550(2014).</li>
<li>Gentleman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconductor%3A+open+software+development+for+computational+biology+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics.</a> Genome Biology. 5, 80(2004).</li>
<li>Law, C. W., Chen, Y., Shi, W., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((voom%3A+Precision+weights+unlock+linear+model+analysis+tools+for+RNA-seq+read+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts.</a> Genome Biology. 15, 29(2014).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Applications+in+Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 3, (2004).</li>
<li>Lund, S. P., Nettleton, D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+differential+expression+in+RNA-sequence+data+using+quasi-likelihood+with+shrunken+dispersion+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Applications+in+Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting differential expression in RNA-sequence data using quasi-likelihood with shrunken dispersion estimates.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 11, (2012).</li>
<li>Reeb, P. D., Steibel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+statistical+analysis+models+for+RNA+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating statistical analysis models for RNA sequencing experiments.</a> Frontiers in Genetics. 4, 178(2013).</li>
<li>Rocke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+False+Positive+Rates+in+Methods+for+Differential+Gene+Expression+Analysis+using+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC genomics. 11, 383(2010).</li>
<li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBSeq%3A+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, Oxford, England. 1035-1043 (2013).</li>
</ol>

O manuscrito não foi publicado antes e não está sendo considerado para publicação em outros lugares. Todos os autores contribuíram para a criação deste manuscrito para conteúdo intelectual importante e leram e aprovaram o manuscrito final. Declaramos que não há conflito de interesses.

Transcrições abundantes de aberrate em cânceres podem ser facilmente identificadas pela análise diferencial RNA-seq5. No entanto, a aplicação da análise de expressão diferencial RNA-seq é muitas vezes restrita, pois requer certas habilidades com linguagem R e a capacidade de escolher métodos apropriados. Para resolver esse problema, fornecemos uma introdução detalhada aos três métodos mais conhecidos (limma, EdgeR e DESeq2) e tutoriais para a aplicação da análise de expressão diferencial RNA-seq. ...

O RNA-sequenciamento (RNA-seq) é uma das tecnologias mais utilizadas em transcriptômicas com muitas vantagens (por exemplo, reprodutibilidade de dados elevados), e aumentou drasticamente nossa compreensão das funções e dinâmicas dos processos biológicos complexos1,2. A identificação de transcrições aberratas em diferentes contextos biológicos, também conhecidos como genes expressos diferencialmente (DEGs), é um passo fundamental na análise do RNA-seq. O RNA-seq torna possível obter uma compreensão profunda dos mecanismos moleculares relacionados à patogênese e funções biológicas. Portanto, a análise diferencial tem sido considerada valiosa para diagnósticos, prognósticos e terapêuticas de tumores3,4,5. Atualmente, mais pacotes de R/Bioconductor de código aberto foram desenvolvidos para análise de expressão diferencial RNA-seq, particularmente limma, DESeq2 e EdgeR1,6,7. No entanto, a análise diferencial requer certas habilidades com linguagem R e a capacidade de escolher o método adequado, que está faltando no currículo da educação médica.
Neste protocolo, com base nos dados da contagem de RNA-seq de cholangiocarcinoma (CHOL) extraídos do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA), três dos métodos mais conhecidos (limma8, EdgeR9 e DESeq210) foram realizados, respectivamente, pelo programa R11 para identificar os DEGs entre CHOL e tecidos normais. Os três protocolos de limma, EdgeR e DESeq2 são semelhantes, mas têm etapas diferentes entre os processos de análise. Por exemplo, os dados de contagem de RNA-seq normalizados são necessários para EdgeR e limma8,9, enquanto o DESeq2 usa suas próprias discrepâncias de biblioteca para corrigir dados em vez de normalização10. Além disso, edgeR é especificamente adequado para dados RNA-seq, enquanto o limma é usado para microarrays e RNA-seq. Um modelo linear é adotado pela limma para avaliar os DEGs12,enquanto as estatísticas em edgeR são baseadas nas distribuições binomiais negativas, incluindo estimativa empírica de Bayes, testes exatos, modelos lineares generalizados e testes de quase-probabilidade9.
Em resumo, fornecemos os protocolos detalhados da análise de expressão diferencial RNA-seq utilizando limma, DESeq2 e EdgeR, respectivamente. Ao se referir a este artigo, os usuários podem facilmente realizar a análise diferencial do RNA-seq e escolher os métodos de análise diferencial adequados para seus dados.

<table><tbody><tr><td>R</td><td></td><td>versão 3.6.2</td><td>software livre</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td>software livre</td></tr></tbody></table>

três métodos diferenciais de análise de expressão para sequenciamento de rna: limma, edger, deseq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

O sequenciamento de RNA (RNA-seq) é uma das tecnologias mais utilizadas em transcriptômica, pois pode revelar a relação entre a alteração genética e os processos biológicos complexos e tem grande valor em diagnósticos, prognósticos e terapêuticas de tumores. A análise diferencial dos dados do RNA-seq é crucial para identificar transcrições aberrantes, e limma, EdgeR e DESeq2 são ferramentas eficientes para análise diferencial. No entanto, a análise diferencial do RNA-seq requer certas habilidades com linguagem R e a capacidade de escolher um método adequado, que está faltando no currículo da educação médica.
Aqui, fornecemos o protocolo detalhado para identificar genes expressos diferencialmente (DEGs) entre o cholangiocarcinoma (CHOL) e os tecidos normais através de limma, DESeq2 e EdgeR, respectivamente, e os resultados são mostrados em parcelas vulcânicas e diagramas de Venn. Os três protocolos de limma, DESeq2 e EdgeR são semelhantes, mas têm etapas diferentes entre os processos da análise. Por exemplo, um modelo linear é usado para estatísticas em limma, enquanto a distribuição binomial negativa é usada em edgeR e DESeq2. Além disso, os dados de contagem de RNA-seq normalizados são necessários para EdgeR e limma, mas não é necessário para o DESeq2.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para três métodos de análise diferencial: limma, EdgeR e DESeq2. Os resultados dos três métodos são parcialmente sobrepostos. Todos os três métodos têm suas próprias vantagens, e a escolha do método depende apenas dos dados.

Existem várias abordagens para visualizar o resultado da análise de expressão diferencial, entre as quais o enredo do vulcão e o diagrama de Venn são particularmente utilizados. limma identificou 3323 DEGs entre o CHOL e tecidos normais com o |logFC|≥2 e adj. P.Val &lt;0,05 como limiares, entre os quais 1880 foram regulados em tecidos CHOL e 1443 foram regulados(Figura 1a). Enquanto isso, o edgeR identificou os 1578 DEGs para baixo regulados e 3121 DEGs up-regulated(Figu...

Foi fornecido um protocolo detalhado de métodos de análise de expressão diferencial para sequenciamento de RNA: limma, EdgeR, DESeq2.

Três métodos diferenciais de análise de expressão para sequenciamento de RNA: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

Três métodos diferenciais de análise de expressão para sequenciamento de RNA:limma, EdgeR e DESeq2. Abra o programa RStudio e, em seguida, carregue arquivo R, DEGs. O arquivo pode ser adquirido a partir de arquivos suplementares. Um.Download e pré-processamento de dados.1.1. Baixe os dados de contagem de sequenciamento de alta produtividade de Cholangiocarcinoma do Atlas do Genoma do Câncer. Esta guia pode ser facilmente alcançada pelo seguinte código.Clique em executar para instalar o pacote R. Clique em executar para carregar o pacote R. Definir diretório de trabalho.Escolha o tipo de câncer. Execute o código R do arquivo GDCquery para baixar os dados. O GDCquery do arquivo pode ser adquirido a partir de arquivos/scripts complementares.Após a execução, os dados de contagem de sequenciamento de RNA de Cholangiocarcinoma podem ser baixados e chamados CNT, onde as linhas representam IDs e colunas genéticas do conjunto representam IDs de símbolos. Observe os números na posição 14 a 15 nos IDs dos símbolos. Os números variam de 01 a 09 indicam tumores e 10 a 19 indicam tecidos normais.1.2.Conversa de conjuntos de genes com símbolos genéticos. Importe o arquivo de anotação em R, de acordo com o seu caminho de armazenamento. O arquivo de anotação pode ser adquirido a partir de arquivos complementares.Execute o código R a partir do arquivo GTF V22. Que podem ser adquiridos a partir de arquivos/scripts complementares. Aplique a função da pousada e converta os IDs genéticos do conjunto em símbolos genéticos.1.3.Filtrar genes baixos expressos. Clique em executar para instalar o edgeR do pacote "Clique em executar para carregar o edgeR do pacote R"Execute seguindo o código R para manter os genes com contagens por milhão de valores maiores que um em pelo menos duas amostras. Dois. Análise de expressão diferencial através do limma"Clique em Executar para instalar o pacote R limma"Clique em Executar para carregar o pacote R limma"edgeR"Executar o seguinte código R para criar matriz de design.Extrair informações do grupo. Coloque 01"como tecido tumoral. Coloque 11"como tecido normal.Criar matriz de design. Crie o objeto DGEList. Normalize os dados.Execute o seguinte código R para executar a análise de expressão diferencial baseada no método limma-trend. Calcule o valor do CPM. Clique em Executar para encaixar em um modelo linear para prever os dados ou inferir a relação entre variáveis.Calcule o valor T, o valor F e as probabilidades de log com base no Bayesian. Extrair a tabela de resultados. Os resultados da análise de expressão diferencial são salvos em res_limma", o que inclui o valor de alteração da dobra log2.O nível médio de expressão log2 do gene no experimento. A estatística T modificada, o valor P, a taxa de descoberta falsa corrigiu o valor p e as chances de log de genes expressos diferencialmente. Identifique os genes expressos diferencialmente.Assim, o valor P ajustado inferior a 0,05, e o valor absoluto de log falsa mudança maior ou igual a dois são limiares para tela dos genes expressos diferencialmente. Os resultados res limma mostra que comparando com os tecidos normais, 1.443 genes são regulados, e 1.880 genes são regulados em tecidos cholangiocarcinoma. Saída a tabela de resultados para um arquivo.Clique em Executar para instalar o pacote R ggplot2"Clique em Executar para carregar o pacote R ggplot2"Executar código R do arquivo vulcão para criar o enredo do vulcão e o vulcão de arquivos pode ser adquirido a partir de arquivos suplementares. Os genes podem ser mapeados para diferentes posições de acordo com a alteração de dobra log2 e valores P ajustados. Assim, genes expressos diferencialmente regulados são coloridos em vermelho.e os genes expressos diferencialmente regulados são coloridos em verde. Clique em exportar"para salvar o enredo do vulcão. Três. Análise de expressão diferencial através do edgeR"Clique em Executar para carregar borda do pacote R"Execute o seguinte código R para criar matriz de design.Clique em Executar para criar o objeto DGEList e normalizar os dados. Clique em Executar para estimar a dispersão do valor da expressão genética. Clique em Executar para ajustar o modelo para contar dados.Realizar teste estatístico. Extrair a tabela de resultados. O resultado é salvo em res edgeR", que inclui o valor de alteração do fold de log, logCPM, F, p valor e a taxa de detecção falsa corrigida p valor.Identifique os genes expressos diferencialmente. O resultado res edgeR" mostra que comparando com os tecidos normais, 3.121 genes são regulados, e 1.578 genes são regulados em tecidos cholangiocarcinoma. Saída a tabela de resultados para um arquivo.Crie o enredo do vulcão. Clique em exportar para salvar o enredo do vulcão. Quatro. Análise de expressão diferencial através do DESeq2.Clique em Executar para instalar o pacote R DESeq2"Clique em Executar para carregar o pacote R DESeq2"Execute o seguinte código R para determinar o fator tateamento. Crie o objeto de conjunto de dados DESeq2. Faça análises.Gere a tabela de resultados. O resultado é salvo em res DESeq2, que inclui a média da contagem de leitura normalizada, valor de alteração de dobra de log, seta padrão de alteração de dobra de log, a estatística de solda, o valor P original e o valor P corrigido. Identifique deGs.O resultado res DESeq2 mostra que comparando com os tecidos normais, dois mil novecentos e trinta e oito genes são regulados, e mil seiscentos e dezesseis genes são regulados em tecidos cholangiocarcinoma. Saída a tabela de resultados para um arquivo. Crie o enredo do vulcão.Clique em exportar para salvar o enredo do vulcão. Cinco. Diagrama de Venn. Clique em Executar para instalar o diagrama de venn do pacote R.Clique em Executar para carregar o diagrama de venn do pacote R. Faça um diagrama de venn de genes expressos diferencialmente regulados. Clique em exportar para salvar o diagrama da van, Faça um diagrama de venn de genes expressos diferencialmente regulados.Clique em exportar para salvar o diagrama de venn. Seis. Resultados representativos. A figura um mostra as parcelas vulcânicas de todos os genes adquiridos por limma, edgeR e DESeq2.O valor p de log negativo é plotado contra a alteração da dobra de log. Os pontos vermelhos representam os genes expressos diferencialmente regulados, e os pontos verdes representam os genes expressos diferencialmente regulados. Limma identifica os mil oitocentos e oitenta genes regulados diferencialmente expressos, e os mil quatrocentos e quarenta e três genes expressos diferencialmente nos tecidos cholangiocarcinoma.EdgeR identifica os mil quinhentos e setenta e oito genes expressos diferencialmente regulados, e três mil cento e vinte e um genes expressos diferencialmente. O DESeq2 identifica mil seiscentos e dezesseis genes expressos diferencialmente regulados, e dois mil novecentos e trinta e oito genes expressos diferencialmente. Figura dois, os diagramas de venn mostram sobreposição entre os resultados divididos de limma edgeR e DESeq2.Compare os resultados desses três métodos, mil quatrocentos e trinta e um genes expressos diferencialmente regulados, e mil quinhentos e trinta e um genes expressos diferencialmente regulados estão sobrepostos. Seven.Conclusion. Neste protocolo, fornecemos aqui um protocolo detalhado de diferentes tipos de análise de medidas para uma alta sequência de dados de contagem usando pacotes R, limma, edgeR e DESeq2. Três métodos têm equipes semelhantes e equipes entre seu processo de análise.E então os seus desses três medicamentos estão parcialmente sobrepostos. Todos os três medicamentos têm suas próprias vantagens. E a escolha depende apenas do tempo de seus dados.Se houver meus dados atuais, limma deve ser dado com prioridade, mas dados de sequenciamento de geração, no edgeR e DESeq2 são preferidos.

three-differential-expression-analysis-methods-for-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo apresenta um procedimento completa e detalhada para aplicar RNA-seq, uma tecnologia de DNA poderoso próxima geração de sequenciação, de transcriptomas de perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares, com ou sem tratamento com trombina. Este protocolo é generalizável a várias células ou tecidos afetados por reagentes ou estados diferentes doenças.

RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Descrevemos um método baseado em sequenciamento de RNA direcionado que inclui a preparação de bibliotecas de cDNA indexadas, hibridização e captura com sondas personalizadas e análise de dados para interrogar transcritos selecionados quanto à expressão gênica, mutações e fusões gênicas. O RNAseq direcionado permite uma avaliação rápida e econômica de transcritos selecionados em um sequenciador de desktop.

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Apresentado aqui é um procedimento stepwise para diferenciação in vitro de queratinócitos primários humanos por inibição de contato seguido de caracterização a nível molecular pela análise de RNA-seq.

Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

Este método descreve as etapas para melhorar a qualidade e a quantidade de dados sequenciais que podem ser obtidos a partir de amostras de RNA incorporadas à parafina fixa-formalina (FFPE). Descrevemos a metodologia para avaliar com mais precisão a qualidade das amostras de FFPE-RNA, preparar bibliotecas de sequenciamento e analisar os dados das amostras de FFPE-RNA.

Otimização para Sequenciamento e Análise de Amostras de RNA FFPE-RNA degradadas

O DiCoExpress é uma ferramenta baseada em script implementada em R para executar uma análise RNA-Seq do controle de qualidade à co-expressão. O DiCoExpress lida com o design completo e desequilibrado de até 2 fatores biológicos. Este tutorial de vídeo guia o usuário através dos diferentes recursos do DiCoExpress.

Analisando experimentos multifatoriais de RNA-Seq com o DiCoExpress

O splicing alternativo (AS) e a poliadenilação alternativa (APA) expandem a diversidade de isoformas de transcritos e seus produtos. Aqui, descrevemos protocolos de bioinformática para analisar ensaios de RNA-seq em massa e sequenciamento final de 3' para detectar e visualizar AS e APA variando entre condições experimentais.

Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

O presente trabalho descreve um protocolo para executar o algoritmo Pathway2Targets, um script R que prevê e prioriza alvos terapêuticos com base no perfil das vias de sinalização intracelular geradas pela comparação de amostras de caso versus controle de um experimento de sequenciamento de RNA em massa.

Usando listas de genes diferencialmente expressos em humanos para realizar análise de enriquecimento de vias a jusante e priorização de alvos

Este protocolo permite o controle de qualidade inicial para experimentos de RNA-seq para biólogos de laboratório úmido com experiência limitada em bioinformática.

Rup (RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - Controle de qualidade para experimentos de RNA-seq em massa em eucariotos

Aprenda a realizar análise de expressão diferencial em dados de RNA-seq usando limma, EdgeR e DESeq2 no RStudio. Este protocolo compara três métodos amplamente utilizados em bioinformática para identificar genes diferencialmente expressos em colangiocarcinoma.

Três métodos diferenciais de análise de expressão para sequenciamento de RNA: limma, EdgeR, DESeq2

Explorar mais vídeos