Name: Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda técnicas cirúrgicas refinadas para transplante de ilhotas intraportais em camundongos, minimizando sangramento e mortalidade. Este método avança pesquisas em doenças hepáticas e câncer de fígado.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado pelo Departamento de Assuntos dos Veteranos (VA-ORD BLR&D Mérito I01BX004536), e pelo Instituto Nacional de Saúde concede # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, à HW. Gostaríamos de agradecer ao Sr. Michael Lee e à Sra. Lindsay Swaby pela edição de linguagem

Todos os procedimentos foram conduzidos com a aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais na Universidade Médica da Carolina do Sul e do Ralph H Johnson Medical Center em Charleston.
1. Indução de diabetes usando estreptozotocina (STZ)
<ol><li>Preparação de ratos receptores:<ol>
<li>Pesar todos os ratos individualmente.</li>
		<li>Verifique os níveis de glicose no sangue de uma amostra de sangue da veia da cauda usando um glucometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinação da dose STZ para três cenários diferentes:<ol>
<li>Para camundongos com doença hepática gordurosa, injete uma dose de STZ [40 mg/kg/dia, injeção intraperitoneal (i.p.) por 5 dias consecutivos.</li>
		<li>Para ratos NOD-SCID injetar 125 mg/kg de STZ, injeção única, i.p. após o jejum durante a noite.</li>
		<li>Para C57BL/6 camundongos injetam 225 mg/kg de STZ, injeção única, i.p.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cálculos para STZ (13,5 mg/mL): NOTA: Este cálculo é para cinco camundongos C57BL/6 com pesos corporais de 30 g:<ol>
<li>Peso corporal total: 5 ratos x 30 g/mouse = 150g</li>
		<li>STZ necessário: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mgs</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação stz:<ol>
<li>Pese o STZ seguindo a dose pré-calculada.</li>
		<li>Transfira o pó STZ pesado para um béquer de 10 mL no gelo.</li>
		<li>Adicione 3 mL de solução de citrato de sódio ao béquer para dissolver o STZ.</li>
		<li>Misture bem, filtre esterilizar através de um poro de 0,22 μm e use a solução STZ dentro de 10 minutos de preparação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injeção de STZ:<ol>
<li>Carregue a quantidade desejada de solução STZ (suficiente para um mouse) em seringa de 1 mL.</li>
		<li>Realize a injeção intraperitoneal no quadrante inferior direito do abdômen do rato.</li>
		<li>Observe os camundongos por 5 minutos após a injeção e verifique se há sinais de desconforto durante este período de tempo antes de colocá-los de volta nas gaiolas.</li>
		<li>Monitore o nível de glicose no sangue de uma amostra de sangue da veia da cauda usando um glucometer diariamente após a injeção de STZ. NOTA: Neste experimento, os camundongos são considerados diabéticos quando a glicemia não em jejum é > 350 mg/dL por dois dias consecutivos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de ilhotas
NOTA: As ilhotas humanas foram cultivadas em mídia CMRL-1066 suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S) a uma densidade de 10.000 ilhotas equivalente (IEQ) por 100 mm de cultura celular dish9. As ilhotas do rato foram cultivadas em DMEM com 10% de FBS e 1% P/S com a mesma densidade13. Os camundongos NOD-SCID masculinos e C57BL/7 entre 6 e 10 semanas de idade foram obtidos de fontes comerciais.
<ol><li>Desprender ilhotas cultivadas do prato de cultura celular por arranhões suaves.</li>
	<li>Escolha a dedo números desejados de ilhotas (por exemplo, 300-350 ilhotas) usando uma seringa de 1cc e coloque-as em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL estéreis no gelo.</li>
	<li>Gire o tubo por 10 segundos usando o microcentrifuuge.</li>
	<li>Remova o supernasce, deixando algum líquido para evitar perder a pelota.</li>
	<li>Resuspense a pelota em 200 μL de HBSS com albumina de soro bovino de 0,5% (BSA).</li>
	<li>Aspire as ilhotas resuspended em uma seringa de insulina de 0,5 mL.</li>
	<li>Coloque a seringa na posição vertical. Deixe as ilhotas afundarem por 1 min.</li>
	<li>Empurre a seringa para remover todas as bolhas, deixando cerca de 100-150 μL de líquido contendo ilhotas.</li>
	<li>Coloque a cabeça da seringa para baixo e bata suavemente no lado da seringa para deixar as ilhotas distribuirem igualmente por todo o líquido. Ilhotas estão prontas para injeção.</li>
</ol>3. Transplante de ilhotas
<ol><li>Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 2% de isoflurane. Verifique a falta de reflexos do pedal para garantir a anestesia adequada do animal.</li>
	<li>Raspe e remova a pele na área do abdômen do rato.</li>
	<li>Administrar uma única dose pré-operatória de Buprenorfina (0,1 mg/kg i.p.).</li>
	<li>Desinfete a área cirúrgica com três lenços alternados de 2% de iodo e 75% de álcool.</li>
	<li>Faça uma laparotomia com micro tesoura para gerar uma incisão de 1-1,5 cm.</li>
	<li>Abra a cavidade peritoneal com um retrátil. Siga com o método A ou o método B conforme detalhado abaixo.</li>
</ol>4. Método A: (pare de sangrar com espuma de gel, Figura 1A)14,15,16
<ol><li>Preparação do rato<ol>
<li>Coloque uma gaze estéril ao redor da incisão.</li>
		<li>Puxe suavemente o intestino usando um fórceps e mantenha-o na gaze.</li>
		<li>Identifique a veia do portal por sua localização e exponha-a bem.</li>
		<li>Cubra o intestino com uma gaze salina quente durante toda a cirurgia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insira a ilhota agulha de seringa de insulina pré-carregada através da veia portal perto do duodeno (Figura 1B). Para isso, segure a agulha com o orifício (bisel) voltado para baixo e posicione o ângulo da superfície de abertura paralela à parede da veia do portal antes de penetrar através da parede.<ol>
<li>Puxe o êmbolo para extrair um pouco de sangue (20-50 μL) na seringa para misturar as ilhotas primeiro.</li>
		<li>Infunda as ilhotas na veia do portal lentamente enquanto puxa e empurra repetidamente o mergulho.</li>
		<li>Coloque um pedaço de espuma de gel (cerca de 0,5 cm x 0,5 cm de tamanho) para cobrir o local da injeção.</li>
		<li>Pressione a espuma de gel para baixo com uma ponta de algodão enquanto puxa a agulha da veia do portal.</li>
		<li>Continue pressionando o gel por cerca de 2 minutos para confirmar que não há sangramento ativo.</li>
		<li>Enrole a ponta de algodão para cima e para longe da espuma de gel para ter certeza de que a espuma de gel cobre bem a veia do portal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Método B: (pare de sangrar com almofada de gordura, Figura 1C)17
<ol><li>Exponha bem a veia do portal.<ol>
<li>Use duas pontas de algodão para segurar a veia do portal exposto tanto do lado esquerdo quanto do direito.</li>
		<li>Identifique a almofada de tecido adiposo entre o duodeno e a veia portal.</li>
		<li>Penetre através da almofada de gordura antes de inserir a agulha na veia portal (Figura 1D).</li>
		<li>Infundir as ilhotas, seguindo o procedimento semelhante descrito acima nas partes 4.2.1 e 4.2.2 do Método A.</li>
		<li>Puxe a agulha enquanto pressiona a gordura com uma ponta de algodão.</li>
		<li>Continue pressionando a almofada de gordura por 1 minuto depois de remover a agulha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após confirmar que não há sangramento da veia portal, retorne suavemente o intestino à cavidade peritoneal em sua posição original.</li>
	<li>Deixe 0,5 mL de soro fisiológico quente (36-37 °C) na cavidade abdominal antes do fechamento. NOTA: O soro fisiológico quente facilita o movimento e a recuperação do intestino pós-cirurgia e previne a necrose intestinal.</li>
	<li>Feche a camada muscular com uma sutura 5-0.</li>
	<li>Feche a camada de pele com uma sutura 4-0.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento até que esteja totalmente recuperado da anestesia.</li>
	<li>Continue fornecendo um analgésico (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) a cada 12h e calor suplementar para 48 h pós-cirurgia. NOTA: O procedimento de transplante de ilhotas leva aproximadamente 15-20 minutos para ser concluído.</li>
</ol>6. Mancha h&E e fotografia de toda a seção hepática
<ol><li>Perfusão hepática<ol>
<li>Coloque o rato sob anestesia como descrito acima na parte 3.1.</li>
		<li>Exponha cuidadosamente a veia do portal e corte a veia cava inferior.</li>
		<li>Perfumar manualmente o fígado usando 20 mL de 10% de paraformaldeído através da veia portal por cerca de 5 minutos, utilizando uma seringa de 20 mL com agulha 25G18. NOTA: A perfusão hepática pode remover sangue do tecido hepático e melhorar a fixação hepática sem perturbar os enxertos de ilhotas.</li>
		<li>Dissecar o fígado inteiro perfumado de outros órgãos.</li>
		<li>Fixar o tecido hepático perfumado em 10% paraformaldeído por 24 h.</li>
		<li>Incorpore o tecido em parafina.</li>
		<li>Corte seções de tecido de 5 μm de espessura cada e coloque-as em uma lâmina de vidro para coloração.</li>
		<li>Realize a coloração de H&E, insulina, fibrina e nêutrons polimorfonuclear (PMN) utilizando métodos padrão15,16.</li>
		<li>Escaneie a seção hepática inteira sob um microscópio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+islet+transplantation+and+cell+therapy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes.</a> Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).</li>
<li>Ballinger, W. F., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+intact+pancreatic+islets+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of intact pancreatic islets in rats.</a> Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).</li>
<li>Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Ia+antigen+expression+on+murine+islet+parenchymal+cells+does+not+diminish+islet+allograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival.</a> American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).</li>
<li>Toyofuku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+T-cells+participate+in+rejection+of+islet+allografts+in+the+liver+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice.</a> Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).</li>
<li>Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+to+islet+xenografts+in+a+concordant+rat-to-mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model.</a> Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+studying+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation.</a> Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+enhances+islet+engraftment+by+suppression+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction.</a> Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).</li>
<li>Gou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+suppresses+macrophage+activation+and+promotes+islet+graft+survival+after+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. , (2020).</li>
<li>Contreras, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+preserves+functional+islet+mass+after+intraportal+transplantation%3A+A+novel+link+between+endothelial+cell+activation%2C+thrombosis%2C+inflammation%2C+and+islet+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death.</a> Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+islet+transplant+in+the+mouse%3A+functional+and+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization.</a> Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+treatment+with+carbon+monoxide+can+yield+islet+allograft+survival+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance.</a> Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).</li>
<li>Desai, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liver+histopathology+on+islet+cell+engraftment+in+the+model+mimicking+autologous+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation.</a> Islets. 9 (6), 140-149 (2017).</li>
<li>Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+formulations+of+thrombomodulin+increase+engraftment+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).</li>
<li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+improves+early+outcomes+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).</li>
<li>Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatoparenchymal+clearance+of+indocyanine+green+in+infectious+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Giornale+di+Malattie+Infettive+e+Parassitarie%22%5BJournal%5D)">Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis.</a> Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+transplantation+of+pancreatic+islets+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stem+cell+and+islet+cotransplantation%3A+Safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).</li>
</ol>

Todos os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Neste estudo, dois procedimentos aprimorados que podem prevenir sangramento e reduzir a mortalidade do rato durante o IIT do camundongo foram demonstrados. Este estudo permite que os pesquisadores visualizem o modelo de transplante de ilhotas que é único no estudo da resposta inflamatória mediada pelo sangue instantâneo após o transplante. O modelo IIT é um modelo distinto para estudar a sobrevivência das células ilhotas e lesões isquêmicas hepáticas em resposta ao transplante de ilhotas19. Aqui, ...

O transplante de ilhotas intraportais (IIT) através da veia portal é o método mais utilizado para transplante de ilhotas humanas em ambientes clínicos. O modelo de IIT do camundongo oferece uma grande oportunidade de estudar transplante de ilhotas e testar abordagens intervencionistas promissoras que podem aumentar a eficácia do transplante de ilhotas1. O IIT foi descrito pela primeira vez na década de 1970 e usado por vários grupos1,2,3,4,5. Recuperou popularidade após o avanço no transplante de ilhotas humanas no ano de 20006,7. No entanto, a maioria dos estudos de transplante de ilhotas usou a cápsula renal como local preferido para transplante experimental de ilhotas devido ao seu fácil sucesso. Pelo contrário, o IIT é mais desafiador tecnicamente e menos frequentemente utilizado para estudos de transplante de ilhotas8,9. Ao contrário do IIT, no entanto, as ilhotas transplantadas sob a cápsula renal não sofrem da reação inflamatória mediada pelo sangue imediata caracterizada por trombose, inflamação e isquemia de tecido hepático, e, portanto, têm melhor função do que as ilhotas transplantadas no fígado. O modelo de cápsula renal, portanto, não pode imitar totalmente as tensões encontradas pelas ilhotas no transplante de ilhotas humanas10,11,12.
Uma das principais complicações do IIT em camundongos é o sangramento do local da injeção após o transplante, o que poderia causar 10-30% de mortalidade entre diferentes cepas de camundongos12. Neste artigo, duas abordagens refinadas foram desenvolvidas para parar o sangramento de forma mais rápida e segura e reduzir a mortalidade de camundongos após uma IIT. A demonstração visual desses detalhes refinados ajudará os pesquisadores a identificar os principais passos deste procedimento tecnicamente desafiador. Além disso, a localização dos enxertos de ilhotas no fígado do receptor foi determinada por exame histológico da Hematoxilina e Eosin (H&E) com ilhotas transplantadas.

<table><tbody><tr><td>10% Formalina tamponada neutra v/v</td><td>Fisher Scientific</td><td>23426796</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL com agulha</td><td>AHS</td><td>AH01T</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 20 mL</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>25G x 5/8" agulhas hipodérmicas</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de álcool, estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia Animal sistema</td><td>VetEquip, Inc.</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>Cloridrato de buprenorfina, injeção</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Corning</td><td>15110CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absoluto (200 provas), grau de biologia molecular</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>Tesoura de dissecação micro extra fina 4" reta e afiada</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle&nbsp; Medidor de glicose</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle tiras de teste de glicose no sangue</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (esponja de gelatina absorvível, USP)</td> <td>Pharmacia & Pinça Graefe da Upjohn Company</td><td>34201</td><td></td></tr><tr><td>4" ponta extra delicada</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>Almofada aquecida</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de agulha Hegar-Baumgartner 5,25"</td><td>Roboz Instrumento Cirúrgico Co.</td><td>Seringa de insulina RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>com agulha de calibre 27</td><td>BD</td><td>879588</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de iodo</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (P/S)</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de Polipropileno 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de polipropileno 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, solução intravenosa a 0,9%</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>Estreptozocina (STZ)</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Campo cirúrgico, estéril</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>de tecido</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr></tbody></table>

minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Embora o fígado seja atualmente aceito como o principal local de transplante de ilhotas humanas em ambientes clínicos, as ilhotas são transplantadas sob a cápsula renal na maioria dos estudos de transplante de ilhotas pré-clínicas de roedores. Este modelo é comumente usado porque o transplante de ilhotas intrahpáticas de murina é tecnicamente desafiador, e uma alta porcentagem de camundongos pode morrer de complicações cirúrgicas, especialmente sangrando do local de injeção pós-transplante. Neste estudo, são demonstrados dois procedimentos que podem minimizar a incidência de sangramento venoso do portal pós-infusão. O primeiro método aplica uma esponja de gelatina hemostática absorvível no local da injeção, e o segundo método envolve penetrar a agulha de injeção de ilhotas através do tecido adiposo primeiro e depois na veia portal usando o tecido adiposo como uma barreira física para parar o sangramento. Ambos os métodos poderiam efetivamente prevenir a morte do rato induzido pelo sangramento. Toda a seção hepática que mostra distribuição de ilhotas e evidências de trombose de ilhotas pós-transplante, característica típica do transplante de ilhotas intrahpáticas, foram apresentadas. Esses protocolos aprimorados refinam os procedimentos de transplante de ilhotas intrahpáticas e podem ajudar os laboratórios a configurar o procedimento para estudar a sobrevida de ilhotas e funcionar em ambientes pré-clínicos.

Realizamos transplantes de ilhotas sinténicas e xenogênicas através da veia portal. A função do enxerto de ilhota foi observada de forma dependente de dose em ambos os modelos de transplante de ilhotas. No modelo de transplante de ilhotas sinténicas usando camundongos C57BL/6, o transplante de 250 ilhotas levou à normolicemia transitória antes que os camundongos retornassem à hiperglicemia. Camundongos que receberam 500 ilhotas alcançaram e mantiveram a normolicemia além de 30 dias após o transplante (<strong class="xfig...

Aqui apresentamos procedimentos cirúrgicos refinados na realização com sucesso do transplante de ilhotas intraportais, um procedimento cirúrgico clinicamente relevante, mas tecnicamente desafiador, em camundongos.

Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

O fígado é um local primário para transplante no cenário clínico da ilhota humana. O transplante de ilhotas intrahepticas de camundongos é tecnicamente desafiador, e uma alta porcentagem de camundongos pode morrer de complicações cirúrgicas, especialmente sangramento. Neste estudo, os dois métodos que mostramos ambos poderiam efetivamente prevenir a morte do camundongo induzida por sangramento.Nosso método pode ser aplicado a pesquisas em câncer de fígado e outras doenças hepáticas, permitindo a injeção de células cancerígenas, células-tronco mesenquimais e hepatocitte diretamente no fígado. Para começar, desprende uma cultura de ilhotas humanas com arranhões suaves. Use uma seringa de 1 centímetro cúbico para colher de 300 a 350 ilhotas em tubos de microcentrífugo estéreis de 1,5 mililitro no gelo.Quando todas as ilhotas tiverem sido colhidas, centrifufique os tubos por 10 segundos para sedimentar as células. Descarte todos, exceto um pequeno volume de supernascer para evitar a perda de pelotas e resuspenque as ilhotas em 200 microliters HBSS contendo 5%BSA. Carregue as ilhotas resuspended em uma seringa de insulina de 5 mililitros e gire a agulha da seringa-final por 1 minuto para deixar as ilhotas se instalarem no êmbolo.Deprimir o êmbolo para remover quaisquer bolhas, mantendo aproximadamente 100 a 150 microliters de solução na seringa e inverta a seringa com toques suaves para distribuir uniformemente as ilhotas. Após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, aplique pomada nos olhos para evitar a secagem. Raspe o abdômen do camundongo anestesiado para remover a pele e desinfetar a área cirúrgica com três lenços alternados de 2% de iodo e 75% de álcool.Em seguida, faça uma incisão de 1 a 1,5 centímetros no abdômen e abra a cavidade peritoneal. Coloque um pedaço estéril de gaze ao redor da incisão e use fórceps ou pontas de algodão para transferir suavemente o intestino para a gaze. Em seguida, cubra o intestino com um pedaço de gaze encharcada de soro fisiológico e exponha a veia portal.Para parar o sangramento induzido pela transferência de ilhotas usando espuma de gel, segure a agulha com o bisel virado para baixo e posicione a ponta da agulha com a abertura paralela à parede da veia do portal antes de inserir a agulha na veia do portal. Retraia o êmbolo para atrair 20 a 50 microlitres de sangue na seringa para misturar com as ilhotas antes de infundir as ilhotas na veia do portal enquanto repetidamente deprimida e retraída o êmbolo. Quando todas as ilhotas tiverem sido entregues, coloque um pedaço de espuma de gel de aproximadamente 5 por 5 centímetros sobre o local da injeção.Use uma ponta de algodão para pressionar a espuma de gel para baixo enquanto remove a agulha da veia do portal. Mantenha o gel no lugar por cerca de 2 minutos, rolando a espuma de gel para ter certeza de que cobre a veia do portal. Uma vez que o sangramento é interrompido, retorne suavemente o intestino para a cavidade peritoneal na posição original e injete 500 microliters de soro fisiológico quente na cavidade abdominal.Use suturas para fechar as camadas musculares e de pele. Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recuperação completa da anestesia, administrando analgesia a cada 12 horas e aqueça por 48 horas. Para parar o sangramento induzido pela transferência de ilhotas usando uma almofada de gordura, depois de expor a veia portal como demonstrado, use duas pontas de algodão para segurar a veia exposta nos lados esquerdo e direito e localizar a almofada de tecido adiposo entre o duodeno e a veia portal.Penetre a almofada de gordura com a ponta da agulha antes da inserção na veia portal. Infunda as ilhotas na veia portal como demonstrado. Quando todas as ilhotas tiverem sido entregues, pressione o tecido adiposo com uma ponta de algodão por cerca de 1 minuto enquanto retira a agulha da veia.Em seguida, devolva o intestino à cavidade abdominal e realize o resto dos procedimentos de cuidados pós-cirúrgicos como demonstrado. Os efeitos do transplante de ilhotas são dependentes de dose, uma vez que a glicemia normal é observada 30 dias após o transplante de ilhotas sinéricas quando 500 ilhotas são transferidas, mas apenas a normolicemia transitória é observada quando 250 ilhotas são entregues, com os camundongos retornando à hiperglicemia por 10 dias após o transplante. Um aumento do peso corporal é observado em ambos os grupos e respostas idênticas observadas quando as ilhotas humanas são transplantadas em camundongos diabéticos NOD-SCID, com normogliccemia observada quando maior número de equivalentes de ilhotas são transplantados, mas não números menores.A maioria dos camundongos que sangraram após a transferência morrem após a cirurgia, enquanto os ratos sem sangramento sobrevivem. Aos 28 dias após o transplante, a coloração da insulina revela uma distribuição uniforme da ilhota humana em todo o fígado, principalmente perto dos vasos sanguíneos. Além da filtragem de células de insulina, fibrina e polimorfonuclear também são observadas dentro das ilhotas humanas transplantadas.O transplante de ilhotas intrahápticas vai gerar um grande buraco na veia portal que pode causar sangramento. O uso de nossos dois procedimentos melhorados pode prevenir sangramento e reduzir o transplante pós-ilhota de mortalidade. O modelo de transplante de ilhotas intraportais pode imitar o transplante clínico de ilhotas humanas.Nossos procedimentos refinados podem levar a maiores taxas de sobrevivência para os receptores, o que permite um estudo mais aprofundado da função de ilhotas após o transplante.

minimizing-post-infusion-portal-vein-bleeding-during-intrahepatic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo descreve um procedimento cirúrgico para entregar células tumorais mamárias ao fígado murino por meio de injeção na veia porta. Este modelo permite a investigação de estágios tardios de metástases hepáticas.

Injeção na veia porta: um método para estudar a metástase do câncer no fígado

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para infundir células das ilhotas pancreáticas na veia porta hepática, seguido pela aplicação de espuma de gel para prevenir o sangramento com sucesso. O sangramento pós-operatório é uma causa comum de alta mortalidade durante o transplante de ilhotas.

Modelo Murino de Transplante de Ilhotas: Um Método Cirúrgico para Infundir Ilhotas Pancreáticas na Veia Portal e Prevenção de Sangramento Pós-Operatório

As ferramentas usadas para visualizar a regeneração vascular requerem métodos para contrastar as árvores vasculares. Este filme demonstrou uma técnica de injeção delicada usada para obter o contraste ideal das árvores vasculares e ilustrar os benefícios potenciais resultantes de uma análise detalhada do espécime resultante usando μCT e cortes seriados histológicos.

Visualização dos Vascular e parênquima regeneração após 70% hepatectomia parcial em ratos normais

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

É apresentado um método para o omental transplante de ilhotas em um rato. As ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada em bolsa omental de um rato diabético. Então, a glicose no sangue é monitorada, e é realizada a análise imuno-histoquímico.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Neste protocolo, um método de isolamento e transplante de isto de murina no tecido adiposo branco subcutâneo inguinal é descrito. Ishotas singeneicas isoladas são transplantadas em um receptor de murina usando um hidrogel de membrana do porão. O nível de glicemia dos receptores é monitorado, e a análise de histologia dos enxertos de lumiçal é realizada.

Modelo de transplante de tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (ISWAT) de Isletas murina

O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.

Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

O protocolo descreve um método simples de ressecção de um fígado de rato intacto para estudos metabólicos através da perfusão venosa portal.

Ex Vivo Perfusão hepática através do Portal Veia em Rato

A depuração hepática da insulina é fundamental para regular a homeostase da glicose. Este artigo descreve um procedimento de perfusão hepática fácil de usar para avaliar diretamente a taxa de depuração da insulina hepática in situ em camundongos.

Avaliação da depuração de insulina em camundongos por meio de perfusão hepática in situ

Aqui, fornecemos detalhes sobre a realização da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) via perfusão através da vasculatura de camundongos com um pâncreas intacto como uma técnica adicional para avaliar a função pancreática endócrina com redução de possíveis fatores de confusão.

Secreção de insulina estimulada por glicose via perfusão através da vasculatura de camundongos com pâncreas intacto

Aprenda técnicas cirúrgicas refinadas para transplante de ilhotas intraportais em camundongos, minimizando sangramento e mortalidade. Este método avança pesquisas em doenças hepáticas e câncer de fígado.

Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Explorar mais vídeos