Name: Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprenda a induzir lesões corticais focais por fototrombose em camundongos usando Rose Bengal e laser de 561 nm. Este protocolo padronizado permite estudos reprodutíveis de plasticidade neural e mecanismos pós-AVC sem cirurgia invasiva.

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Agradecemos a todos os nossos parceiros de colaboração do Consórcio imunogol (FOR 2879, das células imunes à recuperação do AVC) por sugestões e discussões. Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha no âmbito do Cluster de Munique para Neurologia de Sistemas (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) e sob as bolsas LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.

Os experimentos relatados neste vídeo foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais para o uso de animais experimentais, e os protocolos foram aprovados pelos comitês governamentais alemães (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Os camundongos utilizados neste estudo foram camundongos C57Bl/6J machos, de 10 a 12 semanas de idade, e despachados pela Alemanha do Rio Charles. Os animais foram alojados sob temperaturas controladas (22 °C ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água.
1. Preparação do material e instrumentos
<ol><li>Dissolver Rose Bengala em solução salina de 0,9% para atingir uma concentração final de 10 mg/mL. Conecte a manta de calor para manter a área de operação aquecida e mantenha a temperatura corporal do rato durante a anestesia a 37 °C.</li>
	<li>Prepare tesouras, fórceps, pedaços de algodão, pomada de olhos dexpanthenol e material de sutura. Prepare uma seringa com solução salina (sem agulha) para manter a área de operação hidratada. Prepare o gás anestesia (100% O2 + isoflurane).</li>
</ol>2. Preparação do animal
<ol><li>Injete analgesia 30 min antes da cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).</li>
	<li>Registo o peso corporal do rato para ajustar a dose de Rose Bengala a ser injetada (10 μL/g i.e., 100 μg/g).</li>
	<li>Coloque o rato na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo do corpo e a vibrissae parem.</li>
	<li>Transfira o mouse para o quadro estereotático e coloque-o em uma posição propensa com o nariz na máscara de anestesia. Conserte o animal e mantenha a concentração de isoflurane em 4% por 1 min. Em seguida, reduza e mantenha a concentração de isoflurane em 2%.</li>
	<li>Insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos. Defina a almofada de aquecimento controlada pelo feedback associada para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C.</li>
	<li>Aplique pomada ocular dexpanthenol em ambos os olhos e limpe a pele e a pele circundante com um agente desinfetante.</li>
</ol>3. Modelo de fototrombose
<ol><li>Faça uma incisão longitudinal de 2,0-2,5 cm e retrate-se para expor o crânio. Realize a exposição do crânio com um único corte para evitar complicações da ferida.</li>
	<li>Remova o periosteum suavemente com algodão e identifique as suturas coronais.</li>
	<li>Coloque os óculos de proteção, ligue o laser de 561 nm e marque o bregma +3 mm à esquerda.</li>
	<li>Desligue o laser, conecte um adesivo com um orifício de 4 mm de diâmetro colocado nas coordenadas marcadas acima mencionadas.</li>
	<li>Injete o mouse com Bengal Rose (10 μL/g), intraperitonealmente. Coloque o raio laser a 4-5 cm do crânio, ligue o laser de 561 nm e ilumine o crânio por 20 minutos.</li>
	<li>Aplique duas gotas de soro fisiológico de 0,9% no crânio para reidratar, suturar a ferida e colocar o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C para se recuperar da anestesia. Depois de 1h, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.</li>
	<li>Injete analgesia a cada 12 h durante 3 dias após a cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).</li>
</ol>4. Operação Sham
<ol><li>Realizar dois procedimentos diferentes das operações de Sham, conforme descrito nas etapas 4.1.1 e 4.1.2.<ol>
<li>Realizar todos os procedimentos de forma idêntica à operação descrita acima. Injete Rose Bengala sem ligar o laser. Após 20 minutos sob anestesia, permitem que os animais fiquem na câmara de recuperação por 1h para se recuperarem, antes de serem devolvidos às suas gaiolas.</li>
		<li>Realize todos os procedimentos de forma idêntica à operação descrita acima, ligando o laser. Não injete Rose Bengala. Após 20 minutos de iluminação a laser, permitem que os animais fiquem na câmara de recuperação por 1h para se recuperarem da anestesia, antes de serem devolvidos às suas gaiolas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Mancha laser
<ol><li>Conecte a manta aquecida para manter a área de operação aquecida e mantenha a temperatura do corpo do rato durante a anestesia a 37 °C.</li>
	<li>Coloque o mouse na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo do corpo e vibrissae pare e, em seguida, transfira o mouse para o quadro estereotático.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma posição propensa com o nariz na máscara de anestesia. Conserte o animal e mantenha a concentração de isoflurane em 4% por 1 min. A galinha T reduza e mantenha-o em 2%.</li>
	<li>Insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos. Defina a almofada de aquecimento controlada pelo feedback associado para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C e aplique pomada dexpanthenol nos olhos em ambos os olhos. Limpe a pele e a pele ao redor com um agente desinfetante.</li>
	<li>Faça uma incisão longitudinal de 2,0-2,5 cm e retrate-se para expor o crânio. Realize a exposição do crânio com um único corte para evitar complicações da ferida.</li>
	<li>Coloque o quadro estotactic sob a mancha de laser e ajuste a altura para obter uma imagem nítida. Concentre a câmera de imagem de perfusão de manchas de laser (LSI) na janela craniana. Configure o sistema de câmera de imagem de manchas a laser (LSI) de alta resolução como descrito anteriormente15.</li>
	<li>Adquira dados de um campo de visão de 1 cm x 1 cm usando um comprimento de onda de 785 nm e lasers de 80 mW com uma taxa de quadros de 21 imagens/s a uma distância de trabalho de 1 cm por 1 min.</li>
	<li>Após a imagem, aplique duas gotas de soro fisiológico de 0,9% no crânio para reidratar, suturar a ferida e colocar o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C para se recuperar da anestesia por 1h. Depois de 1h, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.</li>
</ol>6. Neuroscore
NOTA: Para a análise do déficit neurológico, utiliza-se15.
<ol><li>Pontuação dos animais para geral(Tabela 1) e déficits focais(Tabela 2). Esta escala composta varia de 0 (sem déficits) a 46 (prejuízos graves).</li>
	<li>Realize o neuroscore ao mesmo tempo todos os dias e use roupas cirúrgicas para manter um cheiro neutro.</li>
	<li>Habituar os ratos por 30 minutos na sala com uma gaiola aberta antes do teste e permitir que eles observem cada item por 30 s.</li>
</ol>7. Perfusão
<ol><li>Prepare uma seringa de 20 mL contendo PBS-heparin (2 U/mL) e coloque-a 1 m acima do banco para facilitar/garantir a perfusão movida pela gravidade.</li>
	<li>Injete intraperitoneally 100 μL de cetamina e xilazina (120/16 mg/kg de peso corporal, respectivamente). Aguarde 5 min e corroia a cessação do movimento espontâneo do corpo e da vibrissae.</li>
	<li>Fixar o animal em uma posição supina e desinfetar a superfície abdominal do corpo com 100% de etanol. Faça uma incisão de 3 cm de comprimento no abdômen; corte o diafragma e as costelas para visualizar completamente o coração.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão no átrio direito e insira a cânula de perfusão no ventrículo esquerdo e perfuuse com 20 mL PBS-heparin.</li>
	<li>Após a perfusão, decapite o animal e remova o cérebro, congele-o usando gelo seco e armazene-os a -80 °C até que use mais.</li>
</ol>8. Volumetria infarto
<ol><li>Criosectioning: Corte o cérebro em série em um criostat para seções de 20 μm de espessura a cada 120 μm e monte em slides. Armazene os slides a -80 °C até que seja mais processamento.</li>
	<li>Mancha de cresyl violeta (CV)<ol>
<li>Para preparar a solução de coloração, misture 0,5 g de acetato cv em 500 mL de H2O. Mexa e aqueça (60 °C) até dissolver os cristais. Deixe a solução esfriar e armazená-la em uma garrafa escura. Reaqueça a 60 °C e filtro (filtro de papel) antes de cada uso.</li>
		<li>Seque os slides à temperatura ambiente por 30 minutos. Coloque-os em 95% de etanol por 15 min, seguido por 70% de etanol por 1 min, e depois em 50% de etanol por 1 min.</li>
		<li>Coloque os slides em água destilada por 2 minutos, refresque a água destilada e coloque os slides na água novamente por 1 min. Em seguida, coloque os slides na solução de coloração pré-aquecida por 10 min a 60 °C. Lave os slides duas vezes em água destilada por 1 min.</li>
		<li>Coloque os slides em 95% de etanol por 2 minutos. Em seguida, coloque-os em 100% etanol por 5 min, refresque o etanol 100% e coloque os slides em 100% etanol novamente por 2 min. Depois, cubra os slides com um meio de montagem.</li>
		<li>Análise: Escaneie os slides e analise o volume indireto de infarto pelo método Swanson16 para corrigir o edema: Área isquêmica = (região isquêmica)-((hemisfério ipsilateral) - (hemisfério contralateral)).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Coloração de tunel(in situ kit de detecção de apoptose)
<ol><li>Seque os slides, pós-fixação em 4% de paraformaldeído em PBS (ph 7.4) por 10-20 min na RT. Lave em PBS, pós-fixação em etanol pré-cozido: ácido acético 2:1 por 5 min a -20 °C.</li>
	<li>Lave em PBS e aplique tampão de equilíbrio (10 s a um máximo de 60 min no RT) e aplique enzima TdT de força de trabalho (1 h a 37 °C em câmara umidificada)</li>
	<li>Aplique força de trabalho parar/lavar enzima (10 min no RT), lavar em PBS e aplicar a força de trabalho aquecida (RT) conjugado anti-digoxigenina (30 min em RT no escuro)</li>
	<li>Lave em PBS, incuba com DAPI por 5 minutos no RT e monte os slides com mídia fluoromount.</li>
</ol>

<ol><li>GBD 2016 Causes of Death Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+age-sex+specific+mortality+for+264+causes+of+death%2C+1980-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%3A+The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+Neuro+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).</li>
<li>Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+in+the+cerebral+microcirculation%3A+effect+of+aspirin+and+other+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents.</a> Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li>
<li>Bergeron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+photochemical+cortical+lesions+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inducing photochemical cortical lesions in rat brain.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+ischemia+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model.</a> Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).</li>
<li>Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+infarction.+I.+Early+microvascular+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations.</a> Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).</li>
<li>Labat-gest, V., Tomasi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombotic+ischemia%3A+a+minimally+invasive+and+reproducible+photochemical+cortical+lesion+model+for+mouse+stroke+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370(2013).</li>
<li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journals+unite+for+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Journals unite for reproducibility.</a> Science. 346 (6210), 679(2014).</li>
<li>Llovera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+preclinical+randomized+controlled+multicenter+trial+%28pRCT%29%3A+Anti-CD49d+treatment+for+acute+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
<li>Dirnagl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+appeal+for+international+cooperation+in+preclinical+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research.</a> Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).</li>
<li>Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulating+multicentre+clinical+stroke+trials%3A+a+new+paradigm+for+studying+novel+interventions+in+experimental+models+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stroke%3A+Official+Journal+of+the+INternational+Stroke+Society%22%5BJournal%5D)">Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke.</a> International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+The+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+%26+Pharmacotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).</li>
<li>Llovera, G., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+step+in+translational+research%3A+lessons+learned+from+the+first+preclinical+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial.</a> Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).</li>
<li>Gnyawali, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retooling+laser+speckle+contrast+analysis+algorithm+to+enhance+non-invasive+high+resolution+laser+speckle+functional+imaging+of+cutaneous+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation.</a> Scientific Reports. 7, 41048(2017).</li>
<li>Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+differences+in+the+early+detection+of+breast+cancer+in+metropolitan+Detroit%2C+1978+to+1987%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987.</a> Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).</li>
<li>Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monofilament+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423(2011).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).</li>
<li>Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat%3A+reproducible+extensive+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).</li>
<li>Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice%3A+permanent+coagulation+of+the+distal+middle+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729(2014).</li>
<li>Cramer, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+widefield+calcium+imaging+of+the+mouse+cortex+for+analysis+of+network+connectivity+in+health+and+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease.</a> Neuroimage. 199, 570-584 (2019).</li>
<li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+morphological+analysis+of+microglia+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Automated morphological analysis of microglia after stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106(2018).</li>
<li>Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-function+injectable+angiogenic+biomaterial+for+the+repair+of+brain+tissue+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke.</a> Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nogo-A+targeted+therapy+promotes+vascular+repair+and+functional+recovery+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).</li>
<li>Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalational+anesthetics+as+neuroprotectants+or+chemical+preconditioning+agents+in+ischemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).</li>
<li>Farr, T. D., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impairments+in+skilled+reaching+in+the+mouse+%28Mus+musculus%29+after+a+focal+motor+cortex+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke.</a> Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).</li>
<li>Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonocclusion+and+spontaneous+recanalization+rates+in+acute+ischemic+stroke%3A+a+review+of+cerebral+angiography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies.</a> Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).</li>
<li>Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hardware+and+methodology+for+targeting+single+brain+arterioles+for+photothrombotic+stroke+on+an+upright+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope.</a> Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes para divulgar.

O protocolo apresentado descreve o modelo experimental de derrame de fototrombose iluminando o crânio intacto com um laser de 561 nm, com uma injeção intraperitoneal anterior de Rose Bengala. Até recentemente, o uso desse modelo tem sido baixo, mas está aumentando constantemente.
A mortalidade por indução de AVC neste modelo está ausente. A mortalidade geral de menos de 5% surge durante a operação devido a complicações anestesiológicas ou sacrifício após o cumprimento dos critérios de exclusão...

O AVC isquêmico continua sendo a principal causa de morte e incapacidade adulta adquirida em países desenvolvidos no séculoXXI, representando aproximadamente 2,7 milhões de mortes em 2017 em todo o mundo1. Mesmo com os imensos esforços da comunidade científica, poucos tratamentos estão disponíveis. Além disso, com critérios de exclusão tão elevados, essas opções já limitadas não são acessíveis a muitos pacientes, resultando em uma necessidade urgente de novos tratamentos para melhorar a recuperação funcional após o AVC.
Considerando a incapacidade dos modelos in vitro de replicar as interações complexas do cérebro, os modelos animais são essenciais para a pesquisa de derrame pré-clínico. Os camundongos são o modelo animal mais usado no campo de pesquisa de derrame. A maioria desses modelos de camundongos visa induzir infartos bloqueando o fluxo sanguíneo dentro da artéria cerebral média (MCA) uma vez que a maioria das lesões de derrame humano estão localizadas no territóriomca 2. Embora esses modelos recapitulem melhor as lesões de derrame humano, envolvem cirurgias convuladas com alta variabilidade de volume infarto.
Desde a proposta de Rosenblum e El-Sabban do modelo fototrombótico em 19773, e mais tarde a aplicação deste modelo aos ratos Watson et al.4, tornou-se amplamente utilizado na pesquisa isquêmica de derrame5,6. O modelo de derrame fototrombótico induz um infarto cortical local e definido como resultado da fotoativação de um corante sensível à luz previamente injetado no fluxo sanguíneo. Isso causa trombose local dos navios nas áreas expostas à luz. Brevemente, após a exposição à luz do corante fotossensível injetado, induzida a lesão oxidativa localizada da membrana celular endotelial é induzida, levando à agregação plaquetária e à formação de trombos, seguida pela interrupção local do fluxo sanguíneo cerebral7.
A principal vantagem dessa técnica reside na sua simplicidade de execução e na possibilidade de direcionar a lesão para a região desejada. Ao contrário de outros modelos experimentais de derrame, é necessário menor experiência cirúrgica para realizar o modelo de derrame fototrombótico, pois a lesão é induzida pela iluminação do crânio intacto. Além disso, as bordas bem delimitadas (Figura 2A e Figura 5B) e a flexibilidade para induzir a lesão a uma região cerebral específica podem facilitar o estudo das respostas celulares dentro da área cortical isquêmica ou intacta8. Por essas razões, essa abordagem é adequada para o estudo de mecanismos celulares e moleculares de plasticidade cortical.
Ao longo das últimas décadas, a crescente preocupação com a falta de reprodutibilidade entre os grupos de pesquisa foi cunhada da chamada crise de replicação9. Após a coordenação do primeiro estudo de ensaio multicêntrico controlado randomizado pré-clínico em 201510, uma ferramenta proposta para melhorar a pesquisa pré-clínica11,12,13, foi confirmado que uma das causas para a falha na reprodutibilidade entre estudos pré-clínicos de laboratórios independentes foi a falta de padronização suficiente de modelos experimentais de avc e parâmetros de desfecho14. Assim, quando o consórcio ImmunoStroke foi estabelecido (https://immunostroke.de/), uma colaboração que visa compreender as interações cérebro-imunes subjacentes aos princípios mecanicistas da recuperação do AVC, a padronização de todos os modelos experimentais de AVC entre cada grupo de pesquisa foi essencial.
Descrito aqui é o procedimento padronizado para a indução do modelo fototrombótico, conforme utilizado no consórcio de pesquisa acima mencionado. Resumidamente, um animal foi submetido a anestésicos, recebeu uma injeção de Bengala Rosa (10 μL/g) intraperitonalmente, e o crânio intacto, 3 mm restante de bregma, foi imediatamente iluminado por um laser de 561 nm por 20 min (Figura 1). Além disso, é relatado um método histológico e comportamental relacionado para analisar o desfecho do AVC neste modelo. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão desenvolvidos e utilizados em laboratório.

<table><tbody><tr><td>Laser de comprimento de onda de 561 nm</td><td>Solna</td><td>Cobolt HS-03</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Life Science</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia para isoflurano</td><td>Drager</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Peroxidase Kit de detecção de apoptose in situ</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen pomada</td><td>Bayer</td><td>1578681</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl / 6J camundongos</td><td>Colimetro</td><td>de 000664</td><td></td>Charles River</tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>F240APC-A</td><td></td></tr><tr><td>Cotons</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td> <td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99%</td> <td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Macherey-Nagel</td><td>432018</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>Manta de aquecimento</td><td>FHC DC Controlador de temperatura</td><td>&nbsp; 40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Speckle</td><td>Perimed PeriCam</td><td>PSI HR</td><td></td></tr><tr><td>Mayor Tesoura</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Solução Salina PH: 7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni München</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de proteção</td><td>Laser 2000</td><td>NIR-ZS2-38</td><td></td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>198250-5G</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit meio de montagem</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Quadro</td> <td>estereotáxicoStoelting</td><td>51500U</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Xylacine</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelagem de avc em camundongos: lesões corticais focais por fototrombose

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

O AVC é uma das principais causas de morte e incapacidade adulta adquirida em países desenvolvidos. Apesar da extensa investigação para novas estratégias terapêuticas, permanecem opções terapêuticas limitadas para pacientes com AVC. Portanto, mais pesquisas são necessárias para vias fisiofisiológicas como inflamação pós-acidente vascular cerebral, angiogênese, plasticidade neuronal e regeneração. Dada a incapacidade de modelos in vitro para reproduzir a complexidade do cérebro, modelos experimentais de derrame são essenciais para a análise e posterior avaliação de novos alvos de drogas para esses mecanismos. Além disso, modelos padronizados detalhados para todos os procedimentos são urgentemente necessários para superar a chamada crise de replicação. Como um esforço dentro do consórcio de pesquisa ImmunoStroke, um modelo de rato fototrombótico padronizado usando uma injeção intraperitoneal de Rose Bengala e a iluminação do crânio intacto com um laser de 561 nm é descrito. Este modelo permite o desempenho do AVC em camundongos com alocação para qualquer região cortical do cérebro sem cirurgia invasiva; assim, possibilitando o estudo do AVC em várias áreas do cérebro. Neste vídeo, são demonstrados os métodos cirúrgicos de indução de AVC no modelo fototrombótico, juntamente com a análise histológica.

O modelo descrito aqui é um modelo de derrame fototrombótico pela injeção de Rose Bengala e iluminação intacta do crânio por 20 minutos, em um comprimento de onda constante de 561 nm e 25 mW de potência de saída na fibra. Embora a cirurgia fototrombótica completa dure 30 minutos, o animal é mantido sob baixa anestesia e o dano cerebral é moderado. Aproximadamente 10 minutos após a transferência para suas gaiolas, todos os animais estavam acordados, movendo-se livremente na gaiola, e interagindo com os companheiros de lix...

Descrito aqui é o modelo de derrame fototrombótico, onde um derrame é produzido através do crânio intacto induzindo a oclusão microvascular permanente usando iluminação laser após a administração de um corante fotossensível.

Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...

A abordagem do modelo de derrame fototrombose pode ser adequada para estudos celulares e moleculares de plasticidade cortical devido às bordas limitadas e flexibilidade para induzir lesões em diferentes áreas do córtex. Três vantagens fundamentais distinguem o modelo de fototrombose de outros modelos de AVC, a possibilidade de direcionar a lesão para a região desejada, sua alta reprodutibilidade e baixa mortalidade. A dosagem adequada de bengala rosa é fundamental para o sucesso e para a estabilidade do modelo.Os resultados dependem de especificações técnicas como potência a laser, tempo de aplicação cruzada e xelim óptico do córtex não afetado. Comece dissolvendo a bengala rosa em solução salina de 0,9% para uma concentração final de 10 miligramas por mililitro. Esterilize meticulosamente todos os instrumentos usando um esterilizador de chumbo quente e desinfete todas as superfícies antes e depois da cirurgia com um spray desinfetante microbiano.Prepare uma seringa cheia de solução salina para manter a área de operação hidratada e preparar o gás anestesia. Meça o peso corporal do camundongo para ajustar a dose de bengala rosa a ser injetada. Defina a almofada de aquecimento contro

modeling-stroke-in-mice-focal-cortical-lesions-by-photothrombosis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o procedimento para gerar AVC fototrombótico em um modelo de camundongo por iluminação a laser de um crânio intacto após a administração de corante fotossensível.

Modelagem de AVC Fototrombótico em Modelo de Camundongo: Uma Técnica de Iluminação a Laser Através do Crânio de Camundongo Após Administração de Corante Fotossensível para Induzir Fototrombose

Fototrombose é uma técnica rápida, minimamente invasiva para induzir pequena e bem delimitada infarto em áreas de interesse de maneira altamente reprodutível. É particularmente adequado para o estudo de respostas celulares e moleculares subjacentes plasticidade cerebral em ratinhos transgénicos.

Isquemia Photothrombotic: Um Modelo de lesão cortical fotoquímica Minimamente Invasiva e reprodutível para mouse Estudos curso

Vários modelos murinos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) são amplamente utilizados em pesquisas sobre o cérebro experimental. Aqui, demonstramos o modelo de transcraniana permanente distal MCAO que produz enfarte cortical consistente de um tamanho correspondente ao dano imposto pela maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos humanos.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia óptica semi-invasiva para a indução de um coágulo fototrombótico de Rosa Bengala no córtex somatossensorial de um camundongo in vivo.  Os aspectos técnicos do procedimento de imagem são descritos desde a indução de um evento fototrombótico até a aplicação e coleta de dados.

Rosa Bengala Fototrombose por imageamento óptico confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um Modelo de curso Veículo Individual

A fototrombose é um procedimento minimamente invasivo e altamente reprodutível para induzir isquemia focal na medula espinhal e serve como modelo de lesão medular em camundongos.

Fototrombose induzida por isquemia focal como um Modelo de Lesão Medular em Ratos

Este manuscrito descreve uma técnica de modelagem de infarto capsular. Aqui utilizamos uma técnica photothrombotic modificado com baixa intensidade de luz após o mapeamento de destino pré-cirurgia. Usando esta técnica, criamos um modelo de enfarte capsular circunscrito com comprometimento motor persistente.

Circunscrito capsular infarto Modelagem usando uma técnica Photothrombotic

Os modelos tradicionais de AVC fototrombótico (STP) induzem principalmente agregados plaquetários densos de alta resistência ao tratamento lítico com ativador do plasminogênio tecidual (tPA). Aqui um modelo de PTS murino modificado é introduzido pela co-injeção de trombina e corante fotossensível para fotoativação. O modelo de PTS com trombina produz coágulos mistos plaquetas:fibrina e é altamente sensível à trombólise tPA.

Modelo de AVC fototrombótico enriquecido com fibrina e sensível ao tPA

Diferentes modelos de oclusão da artéria cerebral média (MCAo) são usados em pesquisas experimentais de derrame. Aqui, é descrito um modelo experimental de AVC de MCAo transitório através da artéria carótida externa (ECA), que visa imitar o AVC humano, no qual o trombo cerebrovascular é removido devido à lise espontânea de coágulo ou terapia.

Modelagem de AVC em Camundongos: Oclusão da Artéria Cerebral Média Transitória através da Artéria Carótida Externa

Usando uma abordagem totalmente óptica, o AVC isquêmico é induzido enquanto registra simultaneamente a atividade neuronal de Ca2+ usando um biossensor fluorescente no núcleo emergente do AVC de um camundongo acordado e comportado.

Fototrombose Simultânea e Fotometria de Fibra para Induzir e Monitorar AVC Isquêmico em Camundongos em Comportamento

Esse protocolo oferece um método integrado que inclui entrega viral, implantação de optrodo, indução fototrombótica, registro simultâneo da atividade de astrócitos e neurais, e estimulação optogenética de astrócitos. Esse método integrado visa fornecer investigação simultânea da relação astrócito-neurônio nos estágios agudo a crônico do AVC isquêmico.

Um Método Integrado para Modelagem de AVC Fototrombótico e Registro In Vivo de Optrode da Atividade Neuronal e Astrocítica em Ratos Comportando-se

Aprenda a induzir lesões corticais focais por fototrombose em camundongos usando Rose Bengal e laser de 561 nm. Este protocolo padronizado permite estudos reprodutíveis de plasticidade neural e mecanismos pós-AVC sem cirurgia invasiva.

Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

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