Name: Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprenda a realizar imagem intravital longitudinal do pâncreas em camundongos com resolução celular estável por até três semanas. Este método permite visualizar ilhotas, células cancerígenas e vasos sanguíneos em 3D.

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Este estudo foi apoiado pela subvenção nº 14-2020-002 do Fundo de Pesquisa snubh e pela Bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Todos os procedimentos descritos neste artigo foram realizados de acordo com a8ª edição do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2011)26 e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia da Coreia (KAIST) e do Hospital Bundang da Universidade Nacional de Seul (SNUBH).
1. Preparação da janela e outros materiais
<ol><li>Design personalizado a janela de imagem intravital pancreática para isolar o pâncreas do intestino na cavidade abdominal18 (Figura 1A, B). Um projeto detalhado da janela é descrito em uma figura suplementar de um estudo anterior18.</li>
	<li>Use camundongos C57BL/6N, machos de 8 a 12 semanas, para imagens pancreáticas intravitais. Injete anticorpo anti-CD31 conjugado com um fluoróforo Alexa 647, 2 h antes da imagem, com o propósito de rotular o vaso18.</li>
	<li>Para o estudo das ilhotas, prepare um modelo de camundongo transgênico no qual as ilhotas são marcadas com uma proteína repórter fluorescente. Aqui, utilizamos o MIP-GFP, onde a proteína fluorescente verde foi expressa sob o controle do promotor genético de insulina do camundongo 1, que está ativo nas células beta de todas as ilhotas do mouse24.</li>
	<li>Para o estudo do câncer de pâncreas, prepare células cancerígenas transgênicas marcadas com uma proteína repórter fluorescente e ratos nus BALB/C. Neste estudo, foram utilizadas as células VERMELHAS PANC-1 NucLight. As células cancerígenas PANC-125 foram rotuladas com a sonda fluorescente NucLight Red.</li>
	<li>Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas, cubra vidros (com PEG ou não) e janelas de imagem usando uma autoclave.</li>
	<li>Aplique revestimento PEG no vidro de cobertura para evitar resposta inflamatória e aumentar a biocompatibilidade, que é adequada para imagens de longo prazo.</li>
</ol>2. Cirurgia
<ol><li>Prepare uma plataforma cirúrgica estéril e esterilize as superfícies com 70% de etanol. NOTA: Para sessões de imagem longitudinal, a técnica asséptica é essencial.</li>
	<li>Anesthetize camundongos com uma mistura de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). NOTA: Recomenda-se o uso de tiletamina/zolazepam em vez de cetamina devido ao seu efeito adverso da hiperglicemia. A anestesia ideal deve ser selecionada para efeitos do experimento9,27.</li>
	<li>Monitore a temperatura do corpo usando uma sonda retal com uma almofada de aquecimento controlada homeotermica.</li>
	<li>Raspe o flanco esquerdo do mouse e aplique três rodadas de álcool alternado e esfoliante à base de iodo. NOTA: Se for usado creme depilatório, não deixe mais de 1 minuto para evitar queimaduras químicas.</li>
	<li>Faça uma incisão de 1,5 cm no flanco esquerdo do mouse e disseque a pele e o músculo.</li>
	<li>Realize uma sutura de corda de bolsa com uma sutura preta ou de nylon 4-0 na margem de incisão.</li>
	<li>Use um micro retrátil na incisão e exponha suavemente o baço.</li>
	<li>Misture cuidadosamente o baço com fórceps do anel e identifique o pâncreas.</li>
	<li>Coloque a janela no flanco do mouse e passe o baço e o pâncreas pelo espaço aberto da janela. A manipulação do pâncreas tem que ser muito gentile, pois pode causar sangramento ou pancreatite</li>
	<li>Coloque suavemente o pâncreas na placa da janela de imagem; o baço será colocado no espaço aberto da janela.</li>
	<li>Para o estudo de células cancerígenas, injete PANC-1 NucLight Red (1,0 x 10 6 células)diretamente no pâncreas. NOTA: Para a imagem dos xenoenxertos ortotópicos de câncer pancreático humano, a implantação direta de células cancerígenas como o PANC-1 ou outras células cancerígenas pancreáticas humanas poderia ser facilitada28. Para visualizar com microscopia de fluorescência intravital, as células PANC-1 foram transduzidas com proteína fluorescente vermelha usando o reagente lentiviral NucLight Red que rotula o núcleo29. Embora o volume de injeção máxima seja incerto, diminua o volume possível para evitar o efeito de pressão no pâncreas.</li>
	<li>Aplique gotas de cola de cianoacrilato N-butil na margem da janela de imagem.<ol>
<li>Para minimizar a quantidade da cola aplicada, use uma agulha de cateter de 31 G para a aplicação. Se a quantidade da gota for grande, então o tecido irá involuntariamente aderir à janela ou cobrir o vidro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique suavemente um vidro de cobertura redondo de 12 mm na margem da janela de imagem.</li>
	<li>Puxe o laço de sutura para caber no sulco lateral da janela e amarre-o três vezes.</li>
	<li>Corte o local proximal máximo do nó para evitar a interrupção de pontos apertados quando esses ratos estiverem acordados.</li>
	<li>Deixe os camundongos se recuperarem da anestesia (2-3 horas) e injetem cetoprofeno (5 mg/kg, subcutâneo na pele solta na base do pescoço ou quadril do animal) para alívio da dor. Reavaliar para sinais de dor a cada 12 horas e cetoprofeno deve ser considerado a cada 24 horas durante 1-3 dias. NOTA: A analgesia influencia a secreção da insulina em resposta à glicose9. A escolha e o tempo da analgesia devem ser individualizados para o propósito experimental.</li>
	<li>Acomodar o rato na gaiola com roupa de cama suficiente para evitar o contato da janela com a gaiola. Evite abrigar a casa com os ratos sem a cirurgia da janela.</li>
</ol>3. Imagem intravital
<ol><li>Ligue o microscópio intravital, incluindo a potência laser.</li>
	<li>Ligue a almofada de aquecimento e coloque o regulamento homeotémico em 37 °C. NOTA: Alternativamente, use uma almofada de aquecimento passiva ou lâmpada com controle frequente se não houver regulação homeotérmica.</li>
	<li>Realize anestesia intramuscular com uma mistura de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). NOTA: Recomenda-se o uso de tiletamina/zolazepam em vez de cetamina devido ao seu efeito adverso da hiperglicemia. A anestesia ideal deve ser selecionada para fins dos experimentos9,27.</li>
	<li>Insira um cateter vascular para a injeção.<ol>
<li>Aplique pressão no lado proximal da cauda com o índice e o terceiro dedo como alternativa a uma aplicação de torniquete. Aqueça a cauda com uma lâmpada, se necessário.</li>
		<li>Esterilize a veia traseira com um spray de 70% de etanol.</li>
		<li>Insira um cateter de 30 G na veia lateral da cauda. A regurgitação de sangue será visualizada no tubo PE10.</li>
		<li>Aplique uma fita de seda no cateter para estabilizá-la.</li>
		<li>Injete fitc/TMR dextran ou outras sondas fluorescentes (25 μg de anti-CD31 conjugado com Alexa 647), conforme apropriado, de acordo com a combinação de sondas fluorescentes18. NOTA: Para sondas de anticorpos conjugados fluorescentes, injete 2 h antes da sessão de imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira o mouse da plataforma cirúrgica para o estágio de imagem.</li>
	<li>Insira uma sonda retal para controlar automaticamente a temperatura corporal com o sistema de almofada de aquecimento homeotémico.</li>
	<li>Insira a janela de imagem pancreática no suporte da janela preparado durante a configuração da microscopia intravital(Figura 2). Para um microscópio invertido, um suporte de janela pode não ser necessário.</li>
	<li>Realize imagens intravitais.<ol>
<li>Para a imagem do pâncreas, comece com uma lente objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 4x) para digitalizar toda a visão do pâncreas na janela de imagem pancreática (campo de visão recomendado: 2500 x 2500 μm).</li>
		<li>Após a determinação da região de interesse, mude para lente objetiva de ampliação mais alta (20x ou 40x) para realizar a imagem de nível celular (campo de visão recomendado: 500 x 500 μm ou 250 x 250 μm). Neste experimento, a resolução lateral e axial foi de aproximadamente 0,5 μm e 3 μm, respectivamente.</li>
		<li>Execute imagens de z-stack ou time-lapse para observar a estrutura 3D ou a dinâmica de nível celular, como a migração celular. NOTA: Para a imagem da proteína fluorescente que expressa células de animais transgênicos (MIP-GFP), 30 s de exposição intermitente a laser de 488 nm com potência de até 0,43 mW era tolerável sem fotobleaching ou dano tecidual. Para a imagem das proteínas fluorescentes rotuladas com Alexa 647, a potência laser de 640 nm até 0,17 mW era tolerável sem fotobleaching perceptível ou danos teciduais. Exposição prolongada ao laser de excitação com uma potência acima desta configuração pode levar a fotobleaching ou dano tecidual por fototoxicidade. Ajuste o ganho e o poder adequados para imagem adequada da região de interesse. A definição detalhada dos parâmetros na microscopia intravital deve ser individualizada para cada microscopia intravital preparada no instituto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo descrito aqui consiste em imagens intravitais do pâncreas usando uma nova base de suporte integrada janela de imagem intravital pancreática modificada de uma janela de imagem abdominal. Entre os protocolos descritos acima, o primeiro passo crítico é a implantação da janela de imagem pancreática intravital no camundongo. Para a aplicação da cola na janela, é importante aplicar a cola entre a margem da janela e o vidro de cobertura, mas não no tecido pancreático, pois pode interromper significativamente a image...

O pâncreas é um órgão abdominal com uma função exócrina no trato digestivo e uma função endócrina de secretar hormônios na corrente sanguínea. Imagens celulares de alta resolução do pâncreas podem revelar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas, incluindo pancreatite, câncer de pâncreas e diabetes mellitus1. Ferramentas convencionais de diagnóstico por imagem, como tomografia computadorizada, resolução magnética e ultrassonografia estão amplamente disponíveis no campo clínico1,2. No entanto, essas modalidades de imagem estão restritas à visualização apenas de alterações estruturais ou anatômicas, enquanto alterações no nível celular ou molecular não podem ser determinadas. Dado que alterações moleculares no diabetes mellitus ou câncer de pâncreas em humanos podem iniciar mais de 10 anos antes do diagnóstico3,4, a detecção de doenças pancreáticas de sua transição molecular durante o período latente tem o potencial de fornecer um diagnóstico precoce e uma intervenção oportuna. Assim, imagens que superarão as limitações da resolução e fornecerão insights valiosos sobre a função ganharão notavelmente atenção, fornecendo diagnóstico precoce de câncer de pâncreas ou identificação avançada da alteração das ilhotas durante a progressão do diabetes mellitus5.
Em particular com as ilhotas, imagens nucleares, imagens de bioluminescência e tomografia de coerência óptica têm sido sugeridas como técnicas de imagem de ilhotas não invasivas6. No entanto, a resolução desses métodos é substancialmente baixa, com valores típicos que variam de várias dezenas a centenas de micrômetros, oferecendo uma capacidade limitada para detectar alterações no nível celular nas ilhotas. Por outro lado, foram realizados estudos anteriores de alta resolução de ilhotas sob ex vivo7,8 (por exemplo, fatiamento ou digestão do pâncreas), não fisiológico9 (por exemplo, exteriorização do pâncreas) e condições heterotópicas10,11,12 (por exemplo, implantação sob a cápsula renal, dentro do fígado, e na câmara anterior do olho), o que restringe sua interpretação e implicações clínicas. Se in vivo,modelo fisiológico e ortotópico de imagem de alta resolução pode ser estabelecido, será uma plataforma crítica para a investigação de ilhotas pancreáticas.
A imagem intravital, que revela a fisiopatologia em um nível de resolução microscópica em um animal vivo, recebeu recentemente grande atenção13. Dos métodos de imagem in vivo, o desenvolvimento de uma janela de imagem abdominal14, que implanta uma janela no abdômen de um camundongo, permitiu a descoberta de novos achados (ou seja, um estágio pré-micrometastase da metástase hepática precoce15 e mecanismo de manutenção de células-tronco no epitélio intestinal16). Embora a janela de imagem abdominal forneça resultados valiosos, as aplicações desta janela para o pâncreas e a pesquisa de imagem intravital resultante baseada em doenças envolvendo pâncreas, não foram amplamente investigadas.
Ao contrário das características bem definidas do órgão sólido do pâncreas humano, o pâncreas de um camundongo é uma estrutura difusamente distribuída de tecido mole17. Portanto, é incessantemente afetada por movimentos fisiológicos, incluindo peristalse e respiração. Um estudo anterior sobre a aplicação de uma janela de imagem abdominal para o pâncreas demonstrou que a erração ocorreu devido a artefatos de movimento induzidos pelos movimentos intestinais18. A desfoca severa foi observada na imagem média resultante, o que impediu a visualização e identificação das estruturas de microescala.
Aqui, descrevemos o uso de uma nova base de apoio integrada janela de imagem intravital pancreática combinada com microscopia intravital19,20 para investigar os eventos longitudinais de nível celular em doenças envolvendo o pâncreas. Além de uma descrição detalhada da metodologia no estudo anterior18,a aplicação estendida da janela de imagem pancreática para diversas doenças envolvendo o pâncreas será abordada neste artigo. Neste protocolo, um sistema de microscopia confocal de varredura a laser de velocidade de vídeo personalizado foi utilizado como um sistema de microscopia intravital. Quatro módulos laser (comprimentos de onda em 405, 488, 561 e 640 nm) foram utilizados como fonte de excitação, e quatro canais de sinais de emissão foram detectados por tubos fotomultiplier (PMT) através de filtros de bandpass (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). A varredura a laser consistia em um espelho poligonal rotativo (eixo X) e um espelho de varredura galvanômetro (eixo Y) que permitia a digitalização da taxa de vídeo (30 quadros por segundo). Informações detalhadas sobre microscopia intravital foram descritas nos estudos anteriores10,18,19,20,21,22,23.
Em nosso estudo anteriorde ilhotas 18,nós com sucesso e imagem as ilhotas em camundongos vivos usando um modelo de rato transgênico (MIP-GFP)24 em que as ilhotas foram marcadas com GFP. O método possibilitou a visualização de alta resolução das alterações nas ilhotas durante um período de 1 semana. Também facilitou a imagem das mesmas ilhotas por até 3 semanas, o que sugere a viabilidade de estudos de longo prazo das ilhotas pancreáticas para o rastreamento ou monitoramento funcional durante a patogênese do diabetes mellitus18. Além disso, desenvolvemos um modelo ortotópico de câncer de pâncreas no qual células cancerígenas pancreáticas fluorescentes (PANC-1 NucLight Red)25 foram implantadas diretamente no pâncreas do camundongo. Com a aplicação da janela de imagem intravital pancreática, este modelo poderia ser utilizado como uma plataforma para investigar a fisiopatologia celular e molecular no microambiente tumoral do câncer de pâncreas e para o monitoramento terapêutico de novos candidatos a medicamentos.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Ésteres Succinimidílicos (ésteres NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td>Sonda fluorescente para conjugado com anticorpo</td></tr><tr><td>BALB/C Nude</td><td>OrientBio</td><td>BALB/C Nude</td><td>BALB/C Nude</td></tr><tr><td>BD Tubo de polietileno intramédico</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td>cateter PE10 para conexão com agulha</td></tr><tr><td>C57BL/</td><td>6N OrientBio</td><td>C57BL/6N</td><td>C57BL/6N</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura circular</td><td>Marienfeld</td><td>0111520</td><td>Vidro de cobertura para janela de imagem pancreática</td></tr><tr><td>FITC Dextran 2MDa</td><td>Merck (Antigo Sigma Aldrich)</td><td>FD200S</td><td>Para identificação de vasos</td></tr><tr><td>IMARIS 8.1</td><td>Bitplane</td><td>IMARIS</td><td>Processamento de imagem</td></tr><tr><td>Microscopia intravital</td><td>IVIM tech</td><td>IVM-C</td><td>Microscopia intravital</td></tr><tr><td>IRIS Tesoura</td><td>JEUNGDO BIO e PLANT CO, LTD</td><td>S-1107-10</td><td>Este produto pode ser substituído pelo produto de outra empresa</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>401</td><td>N-butil cianoacrilato cola</td></tr><tr><td>Micro porta-agulha</td><td>JEUNGDO BIO & PLANTA CO, LTD</td><td>H-1126-10</td><td>Este produto pode ser substituído com o produto da outra empresa</td></tr><tr><td>Micro retractor</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>17004-03</td><td>Este produto pode ser substituído pelo produto de outra empresa</td></tr><tr><td>Microforceps</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>F-1034</td><td>Este produto pode ser substituído pelo produto de outra empresa</td></tr><tr><td>MIP-GFP</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>006864</td><td>B6. Cg-Tg (Ins1-EGFP) 1Hara / J</td></tr><tr><td>Nylon 4-0</td><td>AILEE</td><td>NB434</td><td>Sutura não absorvível</td></tr><tr><td>Omnican N 100 30G</td><td>B BRAUN</td> FT9172220S <td></td><td>Para cateter vascular, use apenas a parte da agulha</td></tr><tr><td>PANC-1 NucLightRed</td><td>Feito sob medida</td> Feito sob <td>medida</td><td>Feito em laboratório</td></tr><tr><td>Janela de imagem pancreática</td><td>Geumto Engineering</td><td>Pedido personalizado</td><td>Janela de imagem pancreática - pedido personalizado</td></tr><tr><td>Physiosuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-02</td><td>Controlador de temperatura homeotérmico</td></tr><tr><td>Purificado NA/LE Rato Anti-Rato CD31</td><td>BD Biociências</td><td>553708</td><td>Anticorpo para rotulagem de vasos in vivo</td></tr><tr><td>Pinça de anel</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>F-1090-3</td><td>Este produto pode ser substituído pelo produto de outra empresa</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td>Rompun</td><td>Agente anestésico</td></tr><tr><td>TMR Dextran 65-85kDa</td><td>Merck (ex-Sigma Aldrich)</td> <td>T1162</td><td>Para identificação de vasos</td></tr><tr><td>Suporte de janela</td><td>Geumto Engineering</td><td>Pedido personalizado</td><td>Suporte de janela - pedido personalizado</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 100</td><td>Agente anestésico</td></tr></tbody></table>

visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

A imagem direta de resolução celular in vivo do pâncreas em um modelo animal pequeno vivo tem sido tecnicamente desafiadora. Um estudo recente de imagem intravital, com uma janela de imagem abdominal, possibilitou a visualização da dinâmica celular em órgãos abdominais in vivo. No entanto, devido à arquitetura macia do pâncreas do mouse que pode ser facilmente influenciada pelo movimento fisiológico (por exemplo, peristalse e respiração), foi difícil realizar imagens longitudinais estabilizadas ao longo de várias semanas no nível celular para identificar, rastrear e quantificar ilhotas ou células cancerígenas no pâncreas do rato. Aqui, descrevemos um método para implantar uma nova base de suporte, uma janela de imagem intravital pancreática integrada, que pode separar espacialmente o pâncreas do intestino para imagens intravitais longitudinal do pâncreas microestrutura. A imagem longitudinal in vivo com a janela de imagem permite a visualização estável, permitindo o rastreamento de ilhotas durante um período de 3 semanas e imagens tridimensionais de alta resolução da microestrutura, como evidenciado aqui em um modelo de câncer pancreático ortotópico. Com nosso método, novos estudos de imagem intravital podem elucidar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas a nível celular.

A microscopia intravital combinada com a janela de imagem intravital pancreática integrada da base de suporte permite imagens longitudinal do nível celular do pâncreas em um rato. Este protocolo com a janela de imagem intravital pancreática fornece estabilidade tecidual de longo prazo que permite a aquisição de imagens de alta resolução para rastrear ilhotas individuais por até 3 semanas. Como resultado, imagens de mosaico para um campo de visão estendido, reconstrução tridimensional (3D) de imagens de pilha de z e rastr...

A imagem in vivo de alta resolução do pâncreas foi facilitada com a janela de imagem intravital pancreática.

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Este protocolo descreve imagens in vivo estabilizadas e repetitivas do pâncreas com uma nova janela de imagem intravital pancreática. A principal vantagem desta técnica é que é possível realizar imagens tridimensionais imóveis com resolução até o nível celular ao longo de três semanas no pâncreas de um rato vivo. Comece preparando a plataforma cirúrgica e desinfetando as superfícies com 70% de etanol.Após a anestesia, use uma sonda retal com uma almofada de aquecimento controlada por homeotermica para monitorar a temperatura corporal. Remova o cabelo do flanco esquerdo do mouse e aplique álcool e iodo alternativamente, girando do local da incisão para a superfície externa, nunca mais voltando ao local da incisão e terminando com iodo. Em seguida, faça uma incisão de 1,5 centímetros no flanco esquerdo do rato, dissecando a pele e o músculo.Use uma sutura 4-0 preta ou nylon para realizar uma sutura de corda de bolsa na margem de incisão. Puxe o baço cuidadosamente com fórceps do anel e identifique o pâncreas. Colocando a janela no flanco do mouse, passe o baço e o pâncreas pelo espaço aberto da janela.Em seguida, coloque suavemente o pâncreas na placa da janela de imagem enquanto coloca o baço no espaço aberto da janela. Injete panc-1 nuclite vermelho diretamente no pâncreas. Use uma agulha de cateter de calibre 31 para aplicar gotas de cola cianoacrilato n-Butyl à margem da janela de imagem, garantindo a aplicação de uma quantidade mínima de cola.Aplique suavemente um vidro redondo de cobertura de 12 milímetros à margem da janela de imagem. Em seguida, segure o laço de sutura para caber no sulco lateral da janela e amarrá-lo três vezes. Finalmente, para evitar a interrupção desses pontos apertados quando os ratos estiverem acordados, corte o local máximo proximal da gravata.Comece ligando o microscópio intravital, incluindo a potência do laser. Para inserir um cateter vascular, aplique pressão no lado proximal da cauda com o índice e o terceiro dedo. Se necessário, aqueça a cauda com uma lâmpada.Desinfete a veia traseira com um spray de 70% de etanol, em seguida, insira um cateter de calibre 30 na veia traseira lateral e visualize a regurgitação de sangue no tubo PE-10. Aplique fita de seda no cateter para estabilizá-la. Injete fitc dextran e dextran TMR, ou outras sondas fluorescentes conforme apropriado, de acordo com a combinação de sondas fluorescentes.Insira uma sonda retal para controlar automaticamente a temperatura corporal com um sistema de almofada de aquecimento homeotémico. Em seguida, insira a janela de imagem pancreática preparada durante a configuração da microscopia intravital no suporte da janela. Transfira o mouse da plataforma cirúrgica para o estágio de imagem.Para realizar imagens intravitais, comece com a imagem do pâncreas em uma baixa ampliação, como quatro vezes, para escanear toda a visão do pâncreas na janela de imagem pancreática. Uma vez determinada a região de interesse, mude para uma lente objetiva de ampliação mais alta, como 20 vezes ou 40 vezes, para realizar imagens de nível celular com resolução lateral e axial aproximadamente 0,5 micrômetros e 3 micrômetros, respectivamente. Execute imagens de pilha Z ou time-lapse para observar a estrutura 3D ou dinâmicas de nível celular, como migração celular.A microscopia intravital combinada com a janela de imagem intravital pancreática fornece estabilidade tecidual de longo prazo que permite a aquisição de imagens de alta resolução para rastrear ilhotas individuais por até três semanas. A janela implantada em um mouse C57 preto 6 N com anticorpo anti-CD31 injetado por via intravenosa, conjugado com um fluoróforo Alexa 647, facilitou imagens de ampla área e imagens 3D ampliadas do pâncreas. As células acinar foram identificadas nas imagens médias do tecido pancreático na vasculatura adjacente, visualizadas com autofluorescência e anticorpo anti-CD31, respectivamente.Usando o método de imagem de mosaico, que combina uma visão de campo largo com imagens de alta resolução, aproximadamente 40 a 50 ilhotas com a vasculatura adjacente foram visualizadas em um mouse MIP-GFP. Um estudo anterior mostrou que as ilhotas podem ser rastreadas por até três semanas usando este método de imagem estável. Para visualizar as células cancerígenas, as células vermelhas nuclites PANC-1 foram implantadas diretamente no pâncreas do rato durante a cirurgia e os vasos próximos foram manchados com anti-CD31 conjugado com Alexa 647.Usando este protocolo, foram geradas imagens de campo amplo do câncer de pâncreas. Isso ajudou a delinear a margem do tumor, bem como alcançar imagens 3D de alta resolução no nível de célula única. O passo mais crítico neste método é a implantação hábil da janela de imagem pancreática no mouse.Usando outras combinações das células fluorescentes do rato, e sondas de anticorpos, a interação dinâmica de células próximas com ilhotas ou células de cancelamento poderia ser identificada. Este método pode ser amplamente aplicado por aqueles que exploram a mudança da ilhota em várias condições fisiopatológicas e microambientais do câncer de pâncreas in situ.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma...

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

Este vídeo demonstra o procedimento para implantar uma janela de imagem pancreática para separar o pâncreas dos intestinos para imagens longitudinais de alta resolução com lapso de tempo da microestrutura do pâncreas.

Instalação da janela de imagem intravital pancreática em modelo de camundongo: uma janela de imagem pancreática integrada para imagens in vivo de lapso de tempo da microestrutura do pâncreas murino

Neste vídeo, descrevemos a imagem intravital do pâncreas de um camundongo através de uma janela estabilizada para visualização de longo prazo da dinâmica celular.

Imagem intravital: um método para observação em nível celular do pâncreas de camundongo através de uma janela de imagem estabilizada

O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.

Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.

Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

Apresentamos um protocolo para o implante cirúrgico de uma janela óptica de demora estabilizada para imagens de resolução subcelular do pâncreas murino, permitindo estudos seriados e longitudinais do pâncreas sadio e doente.

Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

Ao combinar um polido e reforçado crânio-fino (portas) craniana janela e injeção de células do glioblastoma (GBM), podemos observar glioma iniciação e crescimento de células GBM injetadas no cérebro de um rato vivo longitudinalmente.

Imagem Glioma Iniciação<em&gt; Em Vivo</em&gt; Através de um polido e reforçado Janela crânio-Thin craniana

Um modelo de implante de stent na artéria carótida do rato é descrito. Comparado com outros métodos similares, este procedimento é muito rápido, simples e acessível, oferecendo a possibilidade de estudar em uma forma conveniente a reação da parede vascular para diferentes stents farmacológicos e os mecanismos moleculares de reestenose.

Um modelo murino de implante de stent na artéria carótida para o Estudo da reestenose

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia óptica semi-invasiva para a indução de um coágulo fototrombótico de Rosa Bengala no córtex somatossensorial de um camundongo in vivo.  Os aspectos técnicos do procedimento de imagem são descritos desde a indução de um evento fototrombótico até a aplicação e coleta de dados.

Rosa Bengala Fototrombose por imageamento óptico confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um Modelo de curso Veículo Individual

Este manuscrito descreve um procedimento para controlar a remodelação do cerebrovasculature durante amyloid acúmulo de placa in vivo utilizando microscopia de dois fótons longitudinal. Uma preparação crânio-diluídos permite a visualização de corantes fluorescentes para avaliar a progressão do dano vascular cerebral num modelo de rato da doença de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Aprenda a realizar imagem intravital longitudinal do pâncreas em camundongos com resolução celular estável por até três semanas. Este método permite visualizar ilhotas, células cancerígenas e vasos sanguíneos em 3D.

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática (Vídeo) | JoVE Journal

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

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