Injeções de vetores AAV para optogenética em cérebro de primata anestêm e acordado comportando-se não-humano
4 de agosto de 2021
Como implementado atualmente, a optogenética em primatas não humanos requer injeção de vetores virais no cérebro. Um método de injeção ideal deve ser confiável e, para muitas aplicações, capaz de atingir locais individuais de profundidade arbitrária que são facilmente e inequivocamente identificados na histologia pós-morte. Um método de injeção com essas propriedades é apresentado.
Muitos estudos terapêuticos genéticos e neurocientíficos envolvem as injeções de vetores AAV nos cérebros de primatas não humanos. Para que esses estudos sejam bem sucedidos, a técnica de injeção deve ser confiável. Nossa técnica de injeção é instantânea e precisa.
Este procedimento funciona bem para injeção em animais anestesiados ou acordados. Nossa cânula caseira é fácil de manusear e de baixo custo. Demonstrando o procedimento estará Kevin Mai, um técnico de engenharia do meu laboratório.
Para começar, corte uma ponta de agulha hipodérmica de calibre 30 milímetros com um moedor de disco. Em seguida, corte um pedaço de tubo de aço inoxidável a um comprimento dependendo da profundidade da área cerebral alvo. Com um moedor de disco, desenhe uma extremidade do tubo de corte e suavize a outra.
Desburr o interior do tubo com um broche. Em seguida, corte um pedaço de tubo PTFE a um comprimento apropriado para que o volume da solução vetorial seja carregado. Flare ambas as extremidades do tubo inserindo a agulha hipodérmica sem cortes.
Insira a agulha hipodérmica em linha, aproximadamente cinco milímetros, em uma extremidade do tubo PTFE. Em seguida, insira a extremidade nãovelada da tubulação de aço inoxidável aproximadamente cinco milímetros na outra extremidade. Teste a cânula injetando água filtrada através do cubo de agulha hipodérmica.
Confirme se a água sai da ponta de tubo de aço inoxidável chanfrado sem problemas e que a água não vaze de nenhuma das junções. Depois de testar a cânula, coloque-a em um saco de autoclave e esterilize-a autoclaving. Transfira suavemente a solução vetorial para um tubo PCR esterilizado com uma tubulação P-20, evitando a formação de bolhas.
Em seguida, conecte a cânula com a ponta chanfrada voltada para baixo para um suporte estereutílico orientado verticalmente. Em seguida, conecte uma seringa de bloqueio de um mililitro ao centro de agulha hipodérmica da cânula. Submergir a ponta chanfrada na solução vetorial.
Em seguida, aplique uma pressão negativa suave com a seringa de um mililitro para carregar a solução na cânula enquanto rastreia visualmente o menisco entre a solução e o ar. Uma vez que a solução vetorial tenha sido carregada, continue a pressão negativa suave até que a solução chegue ao cubo da agulha. Em seguida, remova a seringa de um mililitro e injete lentamente óleo mineral colorido ao longo da parede interna do cubo de agulha hipodérmica, tomando o cuidado de evitar bolhas de ar.
Conecte o cubo de agulha hipodérmica a uma das duas portas abertas de uma torneira de bloqueio de três vias. Então, feche o porto. Encha uma seringa de um mililitro com ar e anexe-a a qualquer uma das outras duas portas.
Finalmente, feche a porta restante da torneira para conectar a seringa à cânula. Anexar a seringa força o ar na torneira, e desviar este ar para o porto desocupado impede que ele empurre a solução vetorial de volta para baixo da cânula. Empurre lentamente o ar da seringa para a cânula.
Uma vez que o óleo colorido apareça na ponta da agulha cega na tubulação PTFE, verifique se há ar entre a solução e o óleo colorido. Continue aplicando pressão positiva até que uma gota de solução vetorial seja visível na ponta da cânula chanfrada. Em seguida, feche a torneira para evitar que o vetor saia da cânula pela gravidade.
Uma vez carregada a solução vetorial, afixe a cânula no manipulador estereotítico. Em seguida, para conectar a torneira à bomba de ar elétrica, pegue o tubo de bomba do assistente não estéril. Segure o conector de trava de luer através da parede de uma manga estéril.
Solte a gola da manga, permitindo que ela se estenda ao longo do tubo pela gravidade. Em seguida, afixe a torneira e tape a manga firmemente ao redor do conector de trava de luer. Em seguida, teste a bomba de ar e a cânula, colocando a bomba de ar em baixa pressão, antes de ligá-la e aumentar a pressão até que o óleo avance pela cânula e uma gota de solução vetorial seja visível na ponta da cânula.
Tape uma régua de plástico na tubulação PTFE para medir o movimento do menisco durante a injeção. Em seguida, dirija a cânula para baixo com o manipulador estereotaxico até que a ponta atinja a superfície e grave a profundidade. Dirija a cânula até o local mais profundo a ser injetado ao longo da pista.
A superfície vai coçar após o contato. Para minimizar o direcionamento errado devido à compressão tecidual, acione a cânula para baixo e supere o local de injeção mais profundo em 500 micrômetros. Então, retraia lentamente.
Outras alternativas são conduzir a cânula para baixo lentamente ou dirigi-la rapidamente e esperar na parte inferior por um a cinco minutos. Uma vez que a cânula esteja posicionada no local de injeção mais profundo, use a bomba de ar elétrica para injetar 0,5 microliters da solução vetorial durante 10 a 30 segundos. Confirme o fluxo de injeção rastreando o menisco entre o óleo colorido e a solução vetorial no tubo PTFE.
Depois de esperar por um minuto, retraia a cânula para o próximo local de injeção ao longo da pista. Após a injeção final, deixe a cânula no lugar por 10 minutos para evitar efflux vetorial. Em seguida, retraia a cânula e descarte-a em um recipiente de agudos de risco biológico.
A injeção de vetores AAV carregando o canal rhodopsin II transgene no colliculus superior esquerdo, seguido de estimulação com luz azul contínua a 40 miliwatts, produziu uma série de potenciais de ação consecutivos. Pulsos de luz de um milissegundo não conseguiram evocar potenciais de ação a 40 miliwatts, mas os evocaram de forma confiável a 160 miliwatts. Estimulação óptica do colículo superior desencadeada por saccades visualmente guiadas reduziu gradualmente o ganho de saccade.
A lentidão desta mudança é consistente com a plasticidade optogeneticamente induzida. Entrega de luz laser amarela à vermícula oculomotor após injeções de AAV no núcleo reticularis tegmentae pontis suprimida atividade de fibra de musgo, que é uma entrada para o cerebelo. Esta supressão reduziu a atividade da célula Purkinje, que é uma saída do cerebelo.
Durante a supressão optogenética, a taxa de disparo diminuiu e mudou para um padrão de poros estourado, sugerindo que a entrada inibida de fibra de musgo para células Purkinje influencia a fase de desaceleração saccade, conduzindo a segunda explosão. A rodopsina do canal foi expressa exclusivamente em células Purkinje dos vermis oculomotores. A entrega de pulsos de luz curta aumentou a atividade de pico simples de uma célula Purkinje isolada.
Um único pulso de luz de 1,5 milissegundos frequentemente evocava mais de um simples pico. Ativação de pico simples optogenético cronometrada para ocorrer durante a saccade aumentou a amplitude do saccade, confirmando o papel de desinhibitório das células Purkinje no gerador de explosão oculomotor. Bolhas de ar na cânula podem interromper o menisco vetorial do vetor de óleo, complicar a determinação dos volumes de injeção e evitar um bom controle da vazão.
Por essas razões, carregar as soluções vetoriais sem bolhas de ar é fundamental para este procedimento. Seis a oito semanas após a injeção, manipulações optogenéticas podem ser realizadas e o tecido cerebral pode ser processado para análise histológica. Essa técnica permite aos pesquisadores testar muitos vetores em poucos animais, o que, por sua vez, facilita o desenvolvimento e validação de novos vetores.
Uma área específica de interesse atual é o desenvolvimento de vetores que atingirão tipos neuronais específicos.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma técnica de injeção confiável e imediata para a administração de vetores AAV no cérebro de primatas não humanos, o que é essencial para aplicações optogenéticas. O método permite o direcionamento de áreas cerebrais específicas, com estimulação bem-sucedida do colículo superior, levando a alterações eletrofisiológicas notáveis e insights sobre plasticidade.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Optogenética
- Terapia gênica
Antecedentes
- A optogenética exige entrega precisa e confiável de vetores virais.
- A técnica de injeção deve permitir o direcionamento e identificação precisos de áreas cerebrais.
- Métodos anteriores podem apresentar falta de eficácia ou precisão, exigindo técnicas aprimoradas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um procedimento de injeção confiável para vetores AAV em primatas não humanos.
- Explorar os efeitos da estimulação optogenética nas respostas neuronais.
- Estabelecer um método aplicável tanto a indivíduos acordados quanto anestesiados.
Métodos Utilizados
- O estudo empregou uma cânula caseira para a administração de soluções vetoriais.
- Uma agulha hipodérmica de calibre 30 e um tubo de aço inoxidável foram utilizados na construção.
- O método envolveu etapas meticulosas de preparação, carregamento e injeção da solução.
- As injeções da solução vetorial foram realizadas sob controle preciso utilizando uma bomba de ar elétrica.
- As respostas eletrofisiológicas foram monitoradas durante e após as injeções.
Resultados Principais
- A injeção de vetores AAV levou à geração significativa de potenciais de ação em resposta à estimulação óptica.
- As alterações eletrofisiológicas sugerem plasticidade induzida por optogenética nas respostas sacádicas.
- A infusão do vetor resultou na supressão observada da saída cerebelar, indicativa de padrões alterados de atividade neuronal.
Conclusões
- A técnica de injeção proposta permite um direcionamento preciso para estudos optogenéticos em modelos primatas.
- Os achados contribuem para a compreensão dos mecanismos neuronais e da plasticidade associados ao processamento visual.
- A maior precisão nas injeções tem implicações significativas para futuras aplicações de terapia gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A entrega confiável e espacialmente precisa de vetores AAV em cérebros de primatas não humanos (PNH) é um fator essencial para o desenvolvimento da optogenética translacional e da terapia gênica neurológica. Este método aborda o desafio da administração reprodutível de vetores em PNHs, apoiando a validação robusta de alvos e a redução de riscos mecanicistas antes da translação clínica. Sua capacidade de facilitar testes multiplexados de vetores em coortes limitadas de animais impacta diretamente a eficiência do portfólio e a confiança preditiva nos pipelines terapêuticos do SNC.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação rigorosa de construtos optogenéticos e tropismo de vetores em um sistema de primatas não humanos relevante para doenças.
- Apóia a validação funcional de alvos neuronais por meio de modulação óptica controlada e leituras eletrofisiológicas.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao permitir a entrega precisa espacial e volumétrica de vetores candidatos.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Prepara regiões cerebrais de primatas não humanos validadas para ensaios optogenéticos e eletrofisiológicos posteriores.
- Padroniza volumes e taxas de injeção, melhorando a reprodutibilidade entre experimentos.
- Permite a avaliação quantitativa da expressão do vetor e dos resultados funcionais para triagem de candidatos a vetores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se às estratégias translacionais de biomarcadores ao modelar circuitos neurais relevantes para humanos em primatas não humanos (PNHs).
- Proporciona continuidade desde a descoberta de vetores até a validação pré-clínica em um sistema de alta fidelidade.
- Reduz o risco biológico ao permitir a entrega e expressão robustas e verificáveis histologicamente de construtos terapêuticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa técnica de injeção integra-se na interface entre a descoberta inicial, a validação de alvos e o desenvolvimento de modelos pré-clínicos para programas de terapia gênica e optogenética do SNC.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir a manipulação precisa de circuitos neurais em primatas não humanos (NHPs).
- Triagem: Permite a administração reprodutível e quantitativa de vetores para avaliação comparativa de construtos candidatos.
- Análises: Fornece resultados mensuráveis, como volume e taxa de injeção, além da confirmação histológica post mortem.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta científica à validação pré-clínica ao modelar respostas neurais semelhantes às humanas em primatas não humanos (NHPs).
- Reutilização em Escala Corporativa: Oferece um protocolo padronizado e escalável, adaptável a diversas combinações de vetores e alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos no SNC.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade, padronização e produtividade nos testes de vetores em PNHs.
- Valor Estratégico: Aprimora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção do projeto e a alocação de capital ao permitir a geração robusta de dados pré-clínicos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco dos ativos de terapia gênica para o SNC.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cirurgia estereotáxica e neuroanatomia de primatas não humanos para direcionamento preciso.
- Requer acesso a infraestrutura especializada para fabricação de cânulas, instrumentação para injeção e análise histológica.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes para garantir reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Adaptável a diversas regiões cerebrais e tipos de vetores, com modificações do protocolo conforme necessário.
- A exclusão cuidadosa de bolhas de ar é essencial para manter a precisão da injeção e evitar interrupções no fluxo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Making a Cannula
2:09
Loading the Vector Solution for Injection
4:14
Cannula Insertion into the Target Brain Area and Injection
6:33
Results: Optogenetic Manipulations by Adeno-Associated Viral (AAV) Vector Injections in Awake Monkeys
8:39
Conclusion
