Injeções de vetores AAV para optogenética em cérebro de primata anestêm e acordado comportando-se não-humano
August 4th, 2021
Como implementado atualmente, a optogenética em primatas não humanos requer injeção de vetores virais no cérebro. Um método de injeção ideal deve ser confiável e, para muitas aplicações, capaz de atingir locais individuais de profundidade arbitrária que são facilmente e inequivocamente identificados na histologia pós-morte. Um método de injeção com essas propriedades é apresentado.
Muitos estudos terapêuticos genéticos e neurocientíficos envolvem as injeções de vetores AAV nos cérebros de primatas não humanos. Para que esses estudos sejam bem sucedidos, a técnica de injeção deve ser confiável. Nossa técnica de injeção é instantânea e precisa.
Este procedimento funciona bem para injeção em animais anestesiados ou acordados. Nossa cânula caseira é fácil de manusear e de baixo custo. Demonstrando o procedimento estará Kevin Mai, um técnico de engenharia do meu laboratório.
Para começar, corte uma ponta de agulha hipodérmica de calibre 30 milímetros com um moedor de disco. Em seguida, corte um pedaço de tubo de aço inoxidável a um comprimento dependendo da profundidade da área cerebral alvo. Com um moedor de disco, desenhe uma extremidade do tubo de corte e suavize a outra.
Desburr o interior do tubo com um broche. Em seguida, corte um pedaço de tubo PTFE a um comprimento apropriado para que o volume da solução vetorial seja carregado. Flare ambas as extremidades do tubo inserindo a agulha hipodérmica sem cortes.
Insira a agulha hipodérmica em linha, aproximadamente cinco milímetros, em uma extremidade do tubo PTFE. Em seguida, insira a extremidade nãovelada da tubulação de aço inoxidável aproximadamente cinco milímetros na outra extremidade. Teste a cânula injetando água filtrada através do cubo de agulha hipodérmica.
Confirme se a água sai da ponta de tubo de aço inoxidável chanfrado sem problemas e que a água não vaze de nenhuma das junções. Depois de testar a cânula, coloque-a em um saco de autoclave e esterilize-a autoclaving. Transfira suavemente a solução vetorial para um tubo PCR esterilizado com uma tubulação P-20, evitando a formação de bolhas.
Em seguida, conecte a cânula com a ponta chanfrada voltada para baixo para um suporte estereutílico orientado verticalmente. Em seguida, conecte uma seringa de bloqueio de um mililitro ao centro de agulha hipodérmica da cânula. Submergir a ponta chanfrada na solução vetorial.
Em seguida, aplique uma pressão negativa suave com a seringa de um mililitro para carregar a solução na cânula enquanto rastreia visualmente o menisco entre a solução e o ar. Uma vez que a solução vetorial tenha sido carregada, continue a pressão negativa suave até que a solução chegue ao cubo da agulha. Em seguida, remova a seringa de um mililitro e injete lentamente óleo mineral colorido ao longo da parede interna do cubo de agulha hipodérmica, tomando o cuidado de evitar bolhas de ar.
Conecte o cubo de agulha hipodérmica a uma das duas portas abertas de uma torneira de bloqueio de três vias. Então, feche o porto. Encha uma seringa de um mililitro com ar e anexe-a a qualquer uma das outras duas portas.
Finalmente, feche a porta restante da torneira para conectar a seringa à cânula. Anexar a seringa força o ar na torneira, e desviar este ar para o porto desocupado impede que ele empurre a solução vetorial de volta para baixo da cânula. Empurre lentamente o ar da seringa para a cânula.
Uma vez que o óleo colorido apareça na ponta da agulha cega na tubulação PTFE, verifique se há ar entre a solução e o óleo colorido. Continue aplicando pressão positiva até que uma gota de solução vetorial seja visível na ponta da cânula chanfrada. Em seguida, feche a torneira para evitar que o vetor saia da cânula pela gravidade.
Uma vez carregada a solução vetorial, afixe a cânula no manipulador estereotítico. Em seguida, para conectar a torneira à bomba de ar elétrica, pegue o tubo de bomba do assistente não estéril. Segure o conector de trava de luer através da parede de uma manga estéril.
Solte a gola da manga, permitindo que ela se estenda ao longo do tubo pela gravidade. Em seguida, afixe a torneira e tape a manga firmemente ao redor do conector de trava de luer. Em seguida, teste a bomba de ar e a cânula, colocando a bomba de ar em baixa pressão, antes de ligá-la e aumentar a pressão até que o óleo avance pela cânula e uma gota de solução vetorial seja visível na ponta da cânula.
Tape uma régua de plástico na tubulação PTFE para medir o movimento do menisco durante a injeção. Em seguida, dirija a cânula para baixo com o manipulador estereotaxico até que a ponta atinja a superfície e grave a profundidade. Dirija a cânula até o local mais profundo a ser injetado ao longo da pista.
A superfície vai coçar após o contato. Para minimizar o direcionamento errado devido à compressão tecidual, acione a cânula para baixo e supere o local de injeção mais profundo em 500 micrômetros. Então, retraia lentamente.
Outras alternativas são conduzir a cânula para baixo lentamente ou dirigi-la rapidamente e esperar na parte inferior por um a cinco minutos. Uma vez que a cânula esteja posicionada no local de injeção mais profundo, use a bomba de ar elétrica para injetar 0,5 microliters da solução vetorial durante 10 a 30 segundos. Confirme o fluxo de injeção rastreando o menisco entre o óleo colorido e a solução vetorial no tubo PTFE.
Depois de esperar por um minuto, retraia a cânula para o próximo local de injeção ao longo da pista. Após a injeção final, deixe a cânula no lugar por 10 minutos para evitar efflux vetorial. Em seguida, retraia a cânula e descarte-a em um recipiente de agudos de risco biológico.
A injeção de vetores AAV carregando o canal rhodopsin II transgene no colliculus superior esquerdo, seguido de estimulação com luz azul contínua a 40 miliwatts, produziu uma série de potenciais de ação consecutivos. Pulsos de luz de um milissegundo não conseguiram evocar potenciais de ação a 40 miliwatts, mas os evocaram de forma confiável a 160 miliwatts. Estimulação óptica do colículo superior desencadeada por saccades visualmente guiadas reduziu gradualmente o ganho de saccade.
A lentidão desta mudança é consistente com a plasticidade optogeneticamente induzida. Entrega de luz laser amarela à vermícula oculomotor após injeções de AAV no núcleo reticularis tegmentae pontis suprimida atividade de fibra de musgo, que é uma entrada para o cerebelo. Esta supressão reduziu a atividade da célula Purkinje, que é uma saída do cerebelo.
Durante a supressão optogenética, a taxa de disparo diminuiu e mudou para um padrão de poros estourado, sugerindo que a entrada inibida de fibra de musgo para células Purkinje influencia a fase de desaceleração saccade, conduzindo a segunda explosão. A rodopsina do canal foi expressa exclusivamente em células Purkinje dos vermis oculomotores. A entrega de pulsos de luz curta aumentou a atividade de pico simples de uma célula Purkinje isolada.
Um único pulso de luz de 1,5 milissegundos frequentemente evocava mais de um simples pico. Ativação de pico simples optogenético cronometrada para ocorrer durante a saccade aumentou a amplitude do saccade, confirmando o papel de desinhibitório das células Purkinje no gerador de explosão oculomotor. Bolhas de ar na cânula podem interromper o menisco vetorial do vetor de óleo, complicar a determinação dos volumes de injeção e evitar um bom controle da vazão.
Por essas razões, carregar as soluções vetoriais sem bolhas de ar é fundamental para este procedimento. Seis a oito semanas após a injeção, manipulações optogenéticas podem ser realizadas e o tecido cerebral pode ser processado para análise histológica. Essa técnica permite aos pesquisadores testar muitos vetores em poucos animais, o que, por sua vez, facilita o desenvolvimento e validação de novos vetores.
Uma área específica de interesse atual é o desenvolvimento de vetores que atingirão tipos neuronais específicos.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma técnica de injeção confiável e instantânea para a entrega de vetores AAV nos cérebros de primatas não humanos, o que é crucial para aplicações optogenéticas. O método permite o direcionamento de áreas cerebrais específicas, com estimulação bem-sucedida do colículo superior levando a notáveis mudanças eletrofisiológicas e insights de plasticidade.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Optogenética
- Terapia gênica
Fundamentos
- A optogenética requer entrega precisa e confiável de vetores virais.
- A técnica de injeção deve permitir o direcionamento preciso e identificação de áreas cerebrais.
- Métodos anteriores podem carecer de eficácia ou precisão, necessitando técnicas aprimoradas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um procedimento de injeção confiável para vetores AAV em primatas não humanos.
- Explorar os efeitos da estimulação optogenética nas respostas neuronais.
- Estabelecer um método aplicável tanto para sujeitos acordados quanto anestesiados.
Métodos Utilizados
- O estudo empregou uma cânula caseira para a entrega de soluções de vetores.
- Uma agulha hipodérmica de calibre 30 e tubulação de aço inoxidável foram utilizadas na construção.
- O método envolveu passos meticulosos para preparação, carregamento e injeção da solução.
- As injeções da solução do vetor foram executadas sob controle preciso usando uma bomba de ar elétrica.
- Respostas eletrofisiológicas foram monitoradas durante e após as injeções.
Principais Resultados
- A injeção de vetores AAV levou à geração significativa de potencial de ação em resposta à estimulação óptica.
- Mudanças eletrofisiológicas sugerem plasticidade induzida optogenéticamente em respostas sacádicas.
- A infusão do vetor resultou na supressão observada da saída cerebelar indicativa de padrões de atividade neuronal alterados.
Conclusões
- A técnica de injeção proposta permite o direcionamento preciso para estudos optogenéticos em modelos de primatas.
- Os achados contribuem para a compreensão dos mecanismos neuronais e da plasticidade associada ao processamento visual.
- A precisão aprimorada da injeção tem implicações significativas para futuras aplicações de terapia gênica.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Reliable, spatially precise delivery of AAV vectors in non-human primate (NHP) brains is a critical enabler for translational optogenetics and neurological gene therapy development. This method addresses the challenge of reproducible vector administration in NHPs, supporting robust target validation and mechanistic de-risking before clinical translation. Its ability to facilitate multiplexed vector testing in limited animal cohorts directly impacts portfolio efficiency and predictive confidence in CNS therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of optogenetic constructs and vector tropism in a disease-relevant NHP system.
- Supports functional validation of neuronal targets through controlled optical modulation and electrophysiological readouts.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing precise spatial and volumetric delivery of candidate vectors.
Screening & Assay Development
- Prepares validated NHP brain regions for downstream optogenetic and electrophysiological assays.
- Standardizes injection volumes and rates, improving reproducibility across experimental runs.
- Enables quantitative assessment of vector expression and functional outcomes for screening vector candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by modeling human-relevant neural circuitry in NHPs.
- Provides continuity from vector discovery through preclinical validation in a high-fidelity system.
- Reduces biological risk by enabling robust, histologically verifiable delivery and expression of therapeutic constructs.
Pipeline & Workflow Integration
This injection technique integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development for CNS gene therapy and optogenetics programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise neural circuit manipulation in NHPs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative vector administration for comparative evaluation of candidate constructs.
- Analytics: Provides measurable outputs such as injection volume, rate, and postmortem histological confirmation.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by modeling human-like neural responses in NHPs.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable to diverse vector and target combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and throughput for vector testing in NHPs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by enabling robust preclinical data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS gene therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery and NHP neuroanatomy for accurate targeting.
- Demands access to specialized cannula fabrication, injection instrumentation, and histological analysis infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various brain regions and vector types with protocol modifications as needed.
- Careful exclusion of air bubbles is critical to maintain injection accuracy and avoid flow disruptions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Making a Cannula
2:09
Loading the Vector Solution for Injection
4:14
Cannula Insertion into the Target Brain Area and Injection
6:33
Results: Optogenetic Manipulations by Adeno-Associated Viral (AAV) Vector Injections in Awake Monkeys
8:39
Conclusion
