Name: Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Aprenda a quantificar a ressecção de extremidades de DNA em células HeLa usando marcação com BrdU e imunofluorescência. Este método permite distinguir entre recombinação homóloga e junção de extremidades não homólogas.

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Agradecemos a Marie-Christine Caron por um excelente conselho técnico. Este trabalho é apoiado por financiamento do Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. possui uma cadeira de pesquisa nível 1 no Canadá em reparação de DNA e terapêutica do câncer. J.O'S é um estudante de doutorado da FRQS, e S.Y.M é um pós-doutorando da FRQS.

1. Cultura celular, tratamentos e preparação de clipes
NOTA: Todos os revestimentos celulares, transfecções e tratamentos, além da irradiação, devem ocorrer sob uma capa de cultura celular estéril.
<ol><li>Dia 1º<ol>
<li>Em uma placa de 6 poços, coloque uma única mancha de cobertura em cada poço para quantas condições for necessário. Placa ~150.000 células HeLa para transfecção ou tratamento medicamentoso, conforme desejado. NOTA: Se transfetar, recomenda-se fazer uma transfecção reversa no momento do revestimento, ou é possível fazer uma transfecção para a frente várias horas após o revestimento para permitir a adesão. Uma transfecção reversa é realizada adicionando a mistura de transfecção ao deslizamento antes que as células sejam adicionadas; assim, a transfecção começa antes que as células comecem a aderir. Uma transfecção para a frente, em contraste, é a adição da mistura de transfecção pós-adesão à superfície geralmente no dia seguinte. No entanto, é possível fazer isso no mesmo dia, desde que seja dado tempo suficiente para as células aderirem.</li>
		<li>Para este método, utilize 4 poços: Bem 1: controle siRNA (denominado siCTRL); Bem 2: siRNA contra PARP-1 (siPARP-1); Bem 3: não tratado; Bem 4: Células a serem tratadas com 5 μM BMN673 1 h antes da irradiação. NOTA: Neste protocolo, todos os testes foram realizados em condições irradiadas (ver seção 1.3).</li>
		<li>Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2 de 5% durante a noite, embora o protocolo de transfecção permita até 3 dias de incubação. O tempo de incubação antes do tratamento da BrdU dependerá da eficiência de transfecção do siRNA. Se não houver transfecção, a incubação por 16 h é suficiente para permitir a adesão ao deslizamento de cobertura e algum crescimento celular. NOTA: As condições da incubadora podem ser alteradas de acordo com a linha celular utilizada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dia 2.<ol>
<li>Adicione BrdU em uma concentração final de 10 μM na mídia de cultivo apropriada, e incubar por 16 h (um ciclo celular). NOTA: A solução brdU é preparada em dimetilsulfoxida; a solução de estoque utilizada é de 10 mM e é armazenada em alíquotas a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dia 3.<ol>
<li>Irradie as placas com uma dose total de 5 Giros de irradiação de raios-X (varie a dose de irradiação dependendo do tipo irradiador, por exemplo, pequenos irradiadores animais vs. irradiadores benchtop). Veja a Tabela de Materiais para a marca e modelo de irradiador utilizado.</li>
		<li>Devolva as placas à incubadora e solte as células por 3h.</li>
		<li>Durante o período de incubação de 3 h, prepare os dois buffers, A e B, e 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x salina tamponada com fosfato (PBS). NOTA: Os buffers A e B e a sacarose devem ser preparados frescos no dia da fixação, utilizando solução de sacarose fresca para evitar contaminação.<ol>
<li>Prepare o buffer A (Buffer pré-extração), de acordo com a ordem (30 mL) descrita na Tabela 1. NOTA: A sacarose 1M deve ser preparada no dia do uso para evitar contaminação.</li>
			<li>Prepare o buffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) de acordo com a ordem descrita na Tabela 1 (30 mL). NOTA: O buffer B deve ser preparado na ordem citada para evitar a precipitação da solução de desoxicolato de Tween-20 e desoxicolato de sódio.</li>
			<li>Prepare 4% PFA, 2 mL por condição (10 mL), sob uma capa química (Tabela 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Pré-extração e fixação
NOTA: Toda a pré-extração e fixação são realizadas com as tampas remanescentes na placa de cultura tecidual no gelo ou a 4 °C; o deslizamento de cobertura só é levantado na última etapa de montagem (ver discussão).
<ol><li>Pré-extração<ol>
<li>Aspire o meio, lave cuidadosamente as células duas vezes com 1x PBS e remova o PBS. Adicione 2 mL de Tampão A pré-extração e incuba imediatamente a 4 °C por 10 min. NOTA: É importante que o tempo de incubação no buffer A não seja estendido. A incubação estendida nos buffers de pré-extração resultará em um aumento do número de células separadas do deslizamento de cobertura. Alternativamente, em vez de incubação a 4°C, a incubação pode ser feita no gelo.</li>
		<li>Remova o Buffer A através da aspiração. NOTA: Não lave as tampas após a remoção do buffer A. Vá para a próxima etapa.</li>
		<li>Adicione 2 mL de Citoesqueleto Descascando tampão B e incubar imediatamente a 4 °C por 10 min. Aspire cuidadosamente o Buffer B e lave cuidadosamente as células uma vez com 1x PBS. Aspire cuidadosamente o 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixação<ol>
<li>Conserte as células adicionando 2 mL de 4% pfa sob a capa química. NOTA: O PFA é tóxico e deve ser manipulado sob uma capa química.</li>
		<li>Incubar as células à temperatura ambiente por 20 minutos. Lave as tampas duas vezes com 1x PBS e aspire o excesso.</li>
		<li>Cubra as tampas com metanol 100% frio e incubar as tampas a -20 °C por 5 min. Lave duas vezes com 1x PBS. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As tampas podem ser armazenadas a 4 °C em 1x PBS e a placa envolta em papel alumínio, se necessário. As células não devem ser mantidas mais de 5 dias antes de continuar o protocolo IF.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Permeabilização
<ol><li>Incubar as células com 2 mL de 1x PBS contendo Triton X-100 de 0,5% à temperatura ambiente por 15 minutos. Lave as tampas três vezes com 2 mL de 1x PBS.</li>
</ol>4. Imunostaining
<ol><li>Etapa de bloqueio<ol>
<li>Prepare um buffer de bloqueio fresco suficiente (3% BSA em 1x PBS) para usar 2 mL por tampa. NOTA: Prepare um buffer extra de 5mL para fazer as soluções de anticorpos.</li>
		<li>Adicione 2 mL de tampão de bloqueio a cada poço e incubar à temperatura ambiente por 1h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubação primária de anticorpos<ol>
<li>Prepare a solução primária de anticorpos em tampão de bloqueio fresco: BrdU RPN202 1:1000 e proliferante de antígeno nuclear celular (PCNA) 1:500, 100 μL por deslizamento de cobertura. NOTA: Para preservar o anticorpo, pode-se utilizar um volume menor, 75-100 μL para um deslizamento de cobertura de 22 x 22 mm, 50-75 μL para uma mancha de cobertura de 18 x 18 mm.</li>
		<li>Em cada deslizamento de cobertura, adicione 100 μL de solução de anticorpos primários. Cubra as tampas com um quadrado de parafilm usando pinças, e posicione cuidadosamente o parafilm para não criar bolhas.</li>
		<li>Cubra a placa em papel alumínio e incuba o anticorpo primário durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada.</li>
		<li>Remova os quadrados de parafilm e lave as tampas três vezes com 2 mL de PBS 1x estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubação secundária de anticorpos<ol>
<li>Prepare solução secundária suficiente de anticorpos em tampão de bloqueio fresco: diluição secundária anti-mouse 488 fluorescente A11011 (para BrdU) 1:800 e diluição anti-coelho 568 fluorescente secundária A11011 (para PCNA) diluição 1:800. NOTA: As cores utilizadas podem ser alteradas para atender às necessidades experimentais. A marca específica utilizada pode ser encontrada na Tabela de Materiais.</li>
		<li>Adicione em cada tampalip 100 μL de solução de anticorpos secundários, cubra as tampas com um quadrado de parafilm usando pinças e posicione cuidadosamente o parafilm sem bolhas.</li>
		<li>Incubar o anticorpo secundário à temperatura ambiente por 1h com a placa coberta de papel alumínio.</li>
		<li>Lave as tampas três vezes com 2 mL de 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloração nuclear<ol>
<li>Prepare um volume de 2 mL por deslizamento de cobertura de 1x PBS contendo 4',6-diamidino-2-fenilômicos (DAPI) em uma concentração final de 1 μg/mL (1:1000).</li>
		<li>Adicione em cada tampalip 2 mL da solução DAPI. Incubar as tampas à temperatura ambiente por 10 minutos com a placa coberta de papel alumínio. Lave as tampas duas vezes com 1x PBS.</li>
		<li>Cubra as tampas com 1x PBS e use uma agulha ou uma pinça fina para levantar a tampa da parte inferior do poço. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido tocando uma borda suavemente em uma toalha de papel. NOTA: Tenha cuidado para não soltar o slide ou permitir que a superfície plana com as células aderentes toque no papel.</li>
		<li>Monte as tampas em slides usando 10-20 μL de mídia de montagem específica if.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Aquisição e análise de imagens
NOTA: A aquisição de imagens pode ser feita em vários tipos de microscópios fluorescentes. Utilizou-se um microscópio de epifluorescência com um objetivo de óleo de 63x; ver a Tabela de Materiais para a marca e modelo. Pilhas Z não são necessárias, embora possam ser de uso dependendo da linha celular e nível de coloração mitocondrial.
<ol><li>Análise de imagem<ol>
<li>Para cada imagem, crie vários arquivos de tiff; mesclar todos os planos, mas mantenha os canais de cores separados. Importe esses arquivos para o Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) e analise usando o pipeline de contagem de manchas (Vídeo Suplementar 1).</li>
		<li>Upload das imagens (Figura Suplementar S1A).<ol>
<li>Para começar a criar o projeto, carregue o pipeline de contagem de manchas para dentro do programa e as imagens a serem analisadas na área fornecida.</li>
			<li>Use o módulo NamesAndTypes para atribuir um nome significativo a cada imagem pela qual outros módulos se referirão a ela-C01: Representando canal brdU; C02: Representando o Canal PCNA; C03: Representando o Canal DAPI. NOTA: Estes identificadores dependerão do microscópio; deve haver um identificador no nome do arquivo para distinguir entre os canais.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identifique qual arquivo será usado para identificar os núcleos e nomeá-lo (altere este nome conforme necessário) (ver Figura Suplementar S1B e Figura Suplementar S1C).<ol>
<li>Selecione o diâmetro do objeto entre unidades de 50 a 300 pixels, que é a faixa de tamanho aceitável para núcleos, mas altere o valor para se encaixar nos núcleos da imagem. NOTA: Pode ser que 50 seja um valor muito grande e impeça a identificação de núcleos menores; da mesma forma, 300 podem permitir que grandes agrupamentos de núcleos sejam contados como 1.</li>
			<li>Descarte objetos fora da faixa de diâmetro para garantir que apenas aqueles que correspondem aos critérios serão contados.</li>
			<li>Descarte objetos que toquem bordas para remover células que podem estar apenas parcialmente no campo.</li>
			<li>Aplique o limiar para se encaixar nas imagens específicas. Observe as seguintes configurações como exemplo. Alterar o fator de correção de limiar com base no quão rigorosa será a estratégia de limiar. Outras configurações incluem estratégia limiar: Global; método de limiar: Otsu; duas classes ou três classe limiar: Duas classes; escala de alisamento de limiares: 1; fator de alisamento do limiar: 1; limites inferiores e superiores no limiar: 0,0 e 1,0; método para distinguir objetos desajeitados: Forma; e método para desenhar linhas divisórias entre objetos agrupados: Propagar. NOTA: Para cada parâmetro, o profiler de células fornece definições complementares e possibilidade disponível para a configuração variável.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identificar o objeto primário para identificar os focos (Figura Suplementar S2A).<ol>
<li>Use as seguintes configurações: selecione a imagem de entrada: Maskedgreen; chamado de objeto primário a ser identificado: BrdUFoci; diâmetro típico do objeto: 1-15; descartar o objeto fora da faixa de diâmetro: Sim; descartar o objeto tocando a borda da imagem: Não; estratégia limiar: Adaptativo; método de limiar: Otsu; duas classes ou três de classe limiar: três classes; escala de alisamento de limiares: 1; fator de alisamento do limiar: 3; e tamanho do filtro de alisamento: 4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Intensidade de medida (Figura Suplementar S2B).<ol>
<li>Selecione a imagem a ser medida: OrigGreen.</li>
			<li>Clique em Adicionar outra imagem. Selecione a imagem a ser medida: PCNA. Selecione objetos para medir: Núcleos. NOTA: Este será usado para medir a intensidade de BrdU e PCNA - os dados finais que serão gráficos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
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<li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li>
<li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Precision+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li>
<li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibitor+resistance%3A+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li>
<li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954(2019).</li>
<li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19(2014).</li>
<li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li>
<li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li>
<li>Huertas, P., Cruz-García, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+of+resection+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li>
<li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve um método que faz uso da coloração IF para medir variações na ressecção de DNA no celulose. O padrão atual para observar um efeito na ressecção do DNA é através da coloração de RPA; no entanto, este é um método indireto que pode ser influenciado pela replicação do DNA. Anteriormente, outra técnica de SEC baseada em incorporação de DNA baseada em BrdU foi descrita para classificar as intensidades resultantes em células brdU-positivas e brdU-negativos. Esse método permitiu que as células que n...

Modulação de fatores de reparação de DNA é um método em constante evolução para a terapia do câncer, particularmente em ambientes tumorais deficientes de reparação de DNA DSB. A inibição de fatores de reparação específicos é uma das estratégias engenhosas usadas para sensibilizar as células cancerígenas para agentes prejudiciais ao DNA. Décadas de pesquisa levaram à identificação de várias mutações de genes de reparação de DNA como biomarcadores para escolhas de estratégia terapêutica1. Consequentemente, o campo de reparação de DNA tornou-se um centro de desenvolvimento de medicamentos para garantir uma ampla gama de tratamentos, capacitando o conceito de medicina personalizada. 
Os DSBs são reparados por duas vias principais: NHEJ e HR2. A via NHEJ é propensa a erros, ligando rapidamente as duas extremidades de DNA com pouco ou nenhum processamento final de DNA e envolvendo a quinase proteica (DNA-PKcs), o complexo Ku70/80, 53BP1 e RIF1 proteins3. Em contrapartida, o RH é um mecanismo fiel iniciado pelo BRCA14. Um passo essencial na reparação do RH é o processo de ressecção do DNA-end, que é a degradação das extremidades quebradas levando ao DNA de um único fio (ss) com extremidades de 3'-OH. O BRCA1 facilita o recrutamento das proteínas a jusante que formam o resectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, que estão envolvidos na ressecção de DNA de 5' a 3'5. 
A ressecção final inicial é realizada através da atividade endonuclease do MRE11, permitindo um processamento adicional pelos núcleos DNA2 e EXO1. As ssDNA ssDNA geradas são rapidamente revestidas por Proteína de Replicação A (RPA) para protegê-los de mais processamento. Posteriormente, BRCA2, PALB2 e BRCA1 se engajam para mediar o deslocamento do RPA e a montagem do nucleofilamento RAD51 necessário para o mecanismo de reparação direcionado à ímologia. Um bom equilíbrio entre o uso de NHEJ e RH é necessário para a manutenção ideal da integridade genômica. A escolha do caminho depende da fase do ciclo celular. O RH é usado preferencialmente durante as fases S e G2, onde a ressecção de DNA está no mais alto nível, e as cromátides irmãs estão disponíveis para garantir o reparo adequado.
Poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1) é uma das primeiras proteínas recrutadas para o DSB. Regula tanto a atividade de ressecção quanto a montagem de efeitos a jusante envolvidos no NHEJ5,6. PARP-1 também é necessário para o reparo de quebra de um único fio de DNA durante a replicação7,8. Devido ao seu importante papel na reparação do DNA, os inibidores PARP (PARPi) são usados como terapias contra o câncer. Em vários cânceres deficientes de RH, o tratamento PARPi leva a uma resposta letal sintética devido à incapacidade das células deficientes de RH para reparar o dano acumulado através de uma via alternativa9,10. Atualmente existem quatro PARPi aprovados pela FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib e Talazoparib (também chamado de BMN 673), que são usados para vários tratamentos de câncer de mama e ovário11. No entanto, a resistência parpi é comum, e uma causa potencial surge através da reaquisição da proficiência em RH12. A perda ou inibição do PARP-1 na presença de irradiação desregula o maquinário resectoso, levando ao acúmulo de tratos SSDNA mais longos13. Portanto, um estudo aprofundado da ressecção de DNA in vivo é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento subsequente de novas estratégias para tratar o câncer e superar a resistência do PARPi.
Existem vários métodos empregados para detectar eventos de ressecção de DNA5. Um desses métodos é a técnica clássica baseada em IF que permite a coloração indireta e visualização do DNA ressecado após dSB induzido pelo estresse usando um anticorpo anti-RPA. Rotular DNA genômico com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU) e detectar apenas ssDNA é uma medição direta de eventos de ressecção de DNA. Contorna o monitoramento do RPA, que está envolvido em múltiplos processos celulares, como a replicação de DNA. No método descrito aqui, as células incubadas com BrdU para um único ciclo celular permitem que BrdU seja incorporada em um fio do DNA celular replicante. Após a ressecção, a coloração if é realizada em condições que permitem a detecção de BrdU apenas na forma ssDNA, com o uso de um anticorpo anti-BrdU. Este anticorpo só pode acessar nucleotídeos brdu expostos e não detectará aqueles integrados em DNA de dupla cadeia. Utilizando microscopia de fluorescência, o DNA ressecado pode ser visualizado na forma de focos de BrdU/ssDNA pontuados. A intensidade nuclear desses focos pode ser usada como leitura para quantificar a ressecção após danos no DNA. Este artigo descreve passo a passo os processos deste método, que podem ser aplicados à maioria das linhas celulares de mamíferos. Este método deve ser de ampla utilidade como uma forma simples de monitorar a ressecção final do DNA no celulose, como prova de conceito.

<table><tbody><tr><td>Alexa 568 cabra anti-coelho</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11011</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-rato</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11001</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Anti PARP1 (F1-23)</td> <td>Caseiro</td><td></td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Anti PCNA (SY12-07)</td> <td>Novus</td><td>NBP2-67390</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-Alpha tubulina (DM1A)</td> <td>Abcam</td><td>Ab7291</td><td>1:100000</td></tr><tr><td>anti-BrdU</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN202</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Radiador de raios-X de bancada</td><td>Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMN673</td><td>MedChem Express</td><td>HY-16106</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxiuridina (BrdU)</td> <td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Perfilador de células</td><td>Broad Institute</td><td>V 3.19</td><td>https://cellprofiler.org/</td></tr> <tr><td>Filme de Embalagem de Laboratório Curwood Parafilm M 4in / 250 ft</td><td>Fisher scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilidol, Dicloridrato)</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alta glicose</td><td>Fisher scientific</td><td>10063542</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro bovino</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Óculos de cobertura: Quadrados 22 x 22</td> Microscópio fluorescente <td>Fisher scientific</td><td>12 541B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td>objetiva de imersão 63x</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 160I CO2 INCUBADORA 1-21 TC 120V</td><td>VWR</td><td>51030408</td><td>37% CO2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>BioShop Canada</td><td>MAG520.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>Agulha</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Wisent Bio Products</td><td>311-010-CS</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>Cedarlane Labs</td><td>15710-S(EM)</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>P-36930</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>siPARPi</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td></tr><tr><td>siRNA control</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholcate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>BioShop Canadá</td><td>SUC507.5</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>BioShop Canadá</td><td>TRS001.5</td><td></td></tr><tr><td>Trition X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher científico</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da ressecção final de duplo fio de dna global usando rotulagem brdu-dna juntamente com a discriminação do ciclo celular

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

O estudo da resposta a danos no DNA (DDR) é um campo complexo e essencial, que só se tornou mais importante devido ao uso de medicamentos direcionados ao DDR para o tratamento do câncer. Estes alvos são poli (ADP-ribose) polimerases (PARPs), que iniciam várias formas de reparação de DNA. Inibir essas enzimas utilizando inibidores parp (PARPi) atinge a letalidade sintética conferindo uma vulnerabilidade terapêutica em células deficientes de recombinação homólogo (RH) devido a mutações no câncer de mama tipo 1 (BRCA1), BRCA2 ou parceiro e localizador do BRCA2 (PALB2). 
As células tratadas com PARPi acumulam quebras de duplo fio de DNA (DSBs). Essas quebras são processadas pelo maquinário de ressecção final de DNA, levando à formação de DNA mono-encalhado (ss) e posterior reparação de DNA. Em um contexto deficiente brca1, revigorar a ressecção do DNA através de mutações em inibidores de ressecção de DNA, como 53BP1 e DYNLL1, causa resistência parpi. Portanto, ser capaz de monitorar a ressecção de DNA em celulose é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento de novas estratégias para superar a resistência do PARPi. As técnicas baseadas em imunofluorescência (IF) permitem o monitoramento da ressecção global de DNA após danos no DNA. Esta estratégia requer rotulagem de DNA genômico de pulso longo com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU). Após danos no DNA e ressecção da extremidade do DNA, o DNA de uma única cadeia resultante é especificamente detectado por um anticorpo anti-BrdU em condições nativas. Além disso, a ressecção de DNA também pode ser estudada usando marcadores de ciclo celular para diferenciar entre várias fases do ciclo celular. As células da fase S/G2 permitem o estudo da ressecção final dentro do RH, enquanto as células G1 podem ser usadas para estudar a junção final não homólogo (NHEJ). Um protocolo detalhado para este método IF acoplado à discriminação do ciclo celular é descrito neste artigo.

Neste protocolo, o ensaio baseado em bromodeoxyuridina (BrdU) foi usado para medir quantitativamente a resposta de ressecção das células HeLa para danos induzidos por irradiação. As faixas de SSDNA geradas são visualizadas como focos distintos após a coloração da imunofluorescência (Figura 1A). Os focos identificados foram então quantificados e expressos como a intensidade total integrada da coloração da BRDU nos núcleos (Figura 1B, Figura Suplementar S1...

No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Este protocolo permite na quantificação de celulose do DNA e ressecção após danos no DNA. A principal vantagem desta técnica é a marcação do ciclo celular que restringe as células à fase S e G2, garantindo que o sinal de bromodeoxyuridina resulte do DNA e da ressecção. Demonstrando o procedimento estarão Jean-Yves Masson, um dos principais investigadores, e Sofiane Y.Mersaoui, pesquisadora de pós-doutorado.Trabalhando sob um capô de cultura estéril, coloque uma única mancha em cada poço de uma placa de seis poços para quantas condições necessárias. Placa aproximadamente 150.000 células HeLa para transfecção ou tratamento medicamentoso. No terceiro dia, após a incubação noturna com BrdU em uma concentração final de 10 micromolar, irradie as placas com uma dose total de cinco cinzas de irradiação de raios-X.Após a irradiação, devolva as placas para incubação a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de óxido de carbono de 5% por três horas. Para pré-extração, aspire o meio e lave cuidadosamente as células duas vezes com PBS. Depois de remover o PBS, adicione dois mililitros de tampão de pré-extração A e incuba as células a quatro graus Celsius no gelo por 10 minutos.Após 10 minutos, aspire tampão A, adicione dois mililitros de citoesqueleto descascando tampão B, e repita a incubação. Em seguida, aspire cuidadosamente o tampão B e lave as células com PBS. Após aspirar PBS, fixe as células adicionando dois mililitros de 4% de paraformaldeído sob a capa química.Após a remoção do paraformaldeído e lava com PBS, cubra as tampas com metanol 100% frio para incubação a menos 20 graus Celsius por cinco minutos e lave as tampas duas vezes com PBS. Para permeabilização, incubar as células com dois mililitros de PBS contendo 0,5% Tritan X-100 à temperatura ambiente. Após 15 minutos, lave as tampas três vezes com dois mililitros de PBS.Para imunostaining, adicione dois mililitros de tampão de bloqueio a cada poço. Após uma hora de incubação, adicione 100 microliters de solução de anticorpos primários a cada deslizamento de cobertura. Use pinças para cobrir as tampas com parafilm quadrado e posicione cuidadosamente o parafilme para não criar bolhas.Em seguida, cubra a placa em papel alumínio e incuba o anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara umidificada. No dia seguinte, remova as praças de parafilm e lave as tampas três vezes com dois mililitros de PBS. Após a lavagem, adicione 100 microliters de solução de anticorpos secundários em cada tampa e cubra as tampas com um quadrado de parafilm, como demonstrado.Incubar o anticorpo secundário à temperatura ambiente por uma hora e proteger a placa da luz usando papel alumínio. Em seguida, lave as tampas três vezes com dois mililitros de 1X PBS. Para coloração nuclear, adicione dois mililitros de solução DAPI a cada deslizamento de cobertura e lave as tampas com PBS.Adicione 10 a 20 microlitros de meio de montagem específico do IF em slides de microscópio. Use a agulha ou pinça fina para levantar a tampa da parte inferior do poço. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido tocando uma borda suavemente em uma toalha de papel e monte as tampas em slides de microscópio.Para aquisição e análise de imagens, importe esses arquivos para o CellProfiler e analise-os usando o pipeline de contagem de manchas. Identifique o objeto principal para identificar os focos usando as configurações descritas no manuscrito do texto e medir a intensidade. Imagens representativas da formação de focos de desoxyuridina 5-bromo-2-prime-desoxyuridina e a proliferação de manchas de antígeno nuclear celular após a irradiação são mostradas aqui.As faixas de DNA geradas foram visualizadas como focos distintos. Os focos identificados foram então quantificados e expressos como a intensidade total integrada da coloração bromodeoxyuridina nos núcleos. A co-coloração mostrou diferenciação entre a ressecção de curto alcance devido à junção final não homólogoa e a ressecção de longo alcance da recombinação homóloga usando um anticorpo anti-PCNA para identificar células que passam pela fase S.O PCNA é proeminente no núcleo e atinge a expressão máxima durante a fase S do ciclo celular com uma coloração bastante intensa. O resultado em valores são então plotados como uma estratégia de dispersão para discriminar entre os núcleos negativos PCNA positivo e PCNA. Os resultados negativos do PCNA são removidos do conjunto de dados para permitir a análise baseada em intensidade de BrdU devido ao sinal de BrdU baixo, independentemente da condição.Os núcleos negativos do PCNA abrigam uma intensidade basal integrada de focos brdU de 900 unidades arbitrárias e esse valor chega a 1.800 UA em núcleos positivos pcna. Na condição de controle do siRNA, a intensidade integrada de focos de BrdU por núcleo é de aproximadamente 1.500 UA nos núcleos positivos do PCNA. Após um knockdown eficiente de PARP-1 utilizando um siRNA, observou-se um aumento significativo na intensidade dos focos brdU para aproximadamente 1.900 UA.Esta técnica pode fornecer insights-chave sobre o primeiro estágio da recombinação homólogo, ajudando assim a identificar se uma proteína está envolvida no primeiro passo da via de reparo. O tempo de incubação dos buffers de pré-extração deve ser estritamente mantido. A exposição excessiva a esses buffers resultará em descolamento excessivo de células e aumento do sinal de fundo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

Controlando mudanças subtis na progressão e cinética de fases do ciclo celular pode ser conseguida pelo uso de uma combinação de marcação metabólica de ácidos nucleicos com BrdU e coloração do ADN genómico total de via iodeto de propídio. Este método evita a necessidade de sincronização química de células de bicicleta, impedindo assim que a introdução de não-específica danos no ADN, que por sua vez afecta a progressão do ciclo celular.

Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo

A administração de dois análogos de timidina, EdU e BrdU, em ratinhas grávidas permite a análise da progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais e no cérebro do rato embrionário. Este método é útil para determinar os efeitos do stress genotóxico, incluindo a radiação ionizante, durante o desenvolvimento do cérebro.

Avaliando a progressão do ciclo celular de tronco neurais e as células progenitoras no desenvolvimento do cérebro do rato após estresse genotóxico

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridine/Phospho-Histone H3 Protocolo de rotulagem dupla para análise de progressão do ciclo celular em células-tronco neurais Drosophila

Aqui apresentamos um método baseado em citometria de fluxo para visualização e quantificação de marcadores associados à senescência múltipla em células únicas.

Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

O protocolo a seguir apresenta a detecção de focos de DNA de fita simples na fase G1 do ciclo celular utilizando sincronização do ciclo celular seguida de coloração por imunofluorescência RPA2.

Visualizando focos de DNA de fita simples na fase G1 do ciclo celular

Apresentamos protocolos para a avaliação da proficiência da via de reparo de quebra de fita dupla em células usando um conjunto de substratos repórteres extracromossômicos baseados em luminescência.

Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência

Aprenda a quantificar a ressecção de extremidades de DNA em células HeLa usando marcação com BrdU e imunofluorescência. Este método permite distinguir entre recombinação homóloga e junção de extremidades não homólogas.

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular

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