Name: In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda um ensaio tridimensional de angiogênese in vitro usando células-tronco embrionárias de camundongos para modelagem de doenças vasculares e triagem de fármacos. Este método robusto permite estudos mecanicísticos detalhados.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, e pela Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

1. Preparação de mídia e cultura de mESC
<ol><li>Preparar meio condicionado +/- (CM+/-) usando o suplemento 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) com 10% (vol/vol) de Soro Fetal Bovino (FBS) inativado pelo calor, 0,05 mM β-mercaptoetanol, 1x aminoácidos não essenciais (NEAA 1x), 2 mM L-glutamina e 1 mM de piruvato de sódio.</li>
	<li>Preparar meio condicionado +/+ (CM+/+) utilizando o suplemento meio CM+/- com Fator Inibidor de Leucemia (LIF) (1.500 U/mL) e β-mercaptoetanol 0,1 mM.</li>
	<li>Preparar meio condicionado +/+ na presença de dois inibidores (CM+/+ 2i) utilizando o suplemento meio CM+/+ com 1 μM PD0325901 e 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Preparar solução de gelatina a 0,1% misturando 25 mL de solução de gelatina a 2% pré-aquecida em 500 mL de solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (DPBS).</li>
	<li>Preparar 10x tampão de fosfato de tripsina versene (TVP 10x) misturando tripsina (2,5%) com TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% soro de frango, 0,01% tripsina (2,5%) em H2O) (proporção 1:10, vol/vol). NOTA: Filtrar todas as soluções através de um filtro de poros de 0,22 μm. Conservar o meio de cultura a -20 °C a longo prazo e manter outros reagentes a 4 °C até 3 semanas (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Revestir duas placas de cultura celular de 12 poços com solução de gelatina a 0,1% (500 μL por poço) e incubá-las por 30 min em estufa CO 2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera úmida).</li>
	<li>Lave as placas revestidas com gelatina com PBS e adicione 500 μL de meio CM+/-.</li>
	<li>Descongelar dois frascos para injetáveis de 1 x 106 fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) irradiados criopreservados a 37 °C e transferir a suspensão celular para um tubo cônico com 5 mL de meio CM+/-.</li>
	<li>Centrifugar as células a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (TR). Aspirar o meio e ressuspender suavemente o pellet de células em 12 mL de meio CM+/- na concentração de 1,67 x 10,5 células por mL.</li>
	<li>Semear 500 μL de MEF em uma placa de cultura celular de 12 poços (2,4 x 105 células por cm 2) e incubar a placa durante a noite (o/n) em uma incubadora de CO2.</li>
	<li>Descongelar um frasco para injetáveis de mESCs criopreservados (1 x 106) em meio CM+/+ 2i.</li>
	<li>Semeando a suspensão de mESC em uma placa de 12 poços pré-lavada com MEFs em 1 mL de meio CM+/+ 2i e transferindo a placa para uma incubadora de CO2 . Atualize o meio diariamente.</li>
	<li>Com 70% de confluência, lavar as colônias mESC com DPBS. Adicionar 150 μL de tampão TVP 10x quente e incubar em RT por 30 s para iniciar a dissociação enzimática.</li>
	<li>Remover cuidadosamente o tampão TVP, ressuspender as células em 1 mL de meio CM+/+ 2i e dissociar as colônias em células únicas por pipetagem suave.</li>
	<li>Passar as células transferindo-as para uma nova placa de cultura celular de 12 poços com MEFs (proporção de divisão: 1:3-1:5). Misture suavemente para distribuir as células e incube em uma incubadora de CO2 .</li>
	<li>Atualizar o meio de cultura (2-3 mL) e observar diariamente o crescimento/morfologia celular. Repita a passagem em série com 70% de confluência a cada 2 dias. Mude para o meio CM+/+ por duas passagens antes de iniciar a diferenciação celular.</li>
</ol>2. Formação de EB em gota suspensa
<ol><li>Preparar o meio de diferenciação do mesoderma fresco suplementando o meio CM+/- com Fator de Crescimento de Fibroblastos (bFGF) básico (50 ng·mL-1) e com Proteína Morfogenética Óssea 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) e mantê-lo a 4 °C até o uso.</li>
	<li>Cobrir um poço da placa de cultura celular de 6 poços com 500 μL de solução de gelatina a 0,1% e colocá-lo em uma incubadora de CO2 por 30 min.</li>
	<li>Lave as placas revestidas com gelatina com PBS e adicione 500 μL de meio CM+/-.</li>
	<li>Para obter uma população pura de mESCs, tripsinize a placa de cultura celular com tampão TVP 10x por 30 s em RT, ressuspenda as células em meio de diferenciação de mesoderma de 1 mL e, em seguida, transfira-as para a placa de 6 poços revestida com gelatina por 30 min, permitindo que as MEFs se fixem enquanto as mESCs permanecem em suspensão.</li>
	<li>Coletar a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e contar as células usando um hemocitômetro de Neubauer e corante azul de Trypan para uma exclusão de células vivas/mortas.</li>
	<li>Centrifugar as células a 200 x g por 5 min na RT. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em meio de diferenciação mesodérmica para atingir 4,55 x 104 células por mL.</li>
	<li>Encha o fundo de placas de poliestireno de fixação baixa de 94 mm com 15 mL de água estéril. NOTA: Quatro pratos contendo gotas pendentes (1,6 x 105 células em 3,52 mL de meio) serão necessários para testar uma condição específica usando o ensaio de angiogênese de brotação 3D.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um reservatório plástico estéril e carregue quatro posições de uma pipeta multicanal com 22 μL de suspensão celular por canal (1 x 103 células por gota de 22 μL).</li>
	<li>Levante e inverta a tampa da placa de 94 mm e coloque-a na superfície limpa do gabinete de fluxo com o lado interno voltado para cima.</li>
	<li>Depositar 40 gotas da suspensão celular na superfície interna de cada tampa. Inverta cuidadosamente a tampa sem perturbação e coloque-a de volta no prato, de modo que as gotas fiquem viradas para a água.</li>
	<li>Incube os pratos em uma incubadora de CO2 . Considere isso como dia de diferenciação 0. Manter as placas por 4 dias para formar EBs.</li>
</ol>3. Ensaio de competição para a posição da célula de ponta
<ol><li>Cultura: uma linhagem mESC fluorescente e outra não fluorescente, conforme descrito anteriormente13. Como exemplo, são usados mESCs 7ACS/EYFP rotulados em amarelo e mESCs R1.</li>
	<li>Prepare EBs em mosaico misturando quantidades iguais das duas linhas mESC (proporção 1:1) e incube as placas suspensas em uma incubadora de CO 2, conforme descrito na etapa2 .</li>
</ol>4. Cultura de EBs flutuantes para diferenciação vascular
<ol><li>Antes de coletar EBs das gotas pendentes, prepare o seguinte.<ol><li>Preparar solução de ágar a 5% em H2O e esterilizá-la em autoclave (20 min a 120 °C).</li>
		<li>Use a solução quente de ágar a 5% para preparar o meio G-MEM BHK-21 contendo ágar a 1% e despeje rapidamente 3 mL em uma das placas de poliestireno de 60 mm. Deixe o ágar solidificar por 1 h no RT. Guarde os pratos a 4 °C até usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar meio de diferenciação vascular fresco 2x suplementando o meio CM+/- com bFGF (100 ng·mL-1) e VEGF-A (50 ng·mL-1). Conservar o meio a 4 °C até à utilização.</li>
	<li>Coletar as gotas pendentes em um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta P1000 e remover o sobrenadante após alguns minutos de sedimentação com EB.</li>
	<li>Ressuspender as EBs em 3 mL de meio de diferenciação vascular 2x, transferir a suspensão da EB para uma mão revestida em ágar, distribuir as EBs homogeneamente para evitar agregação.</li>
	<li>Incubar as placas em estufa CO 2 e refrescar o meio a cada2 dias até o dia 9 usando 1x meio de diferenciação vascular na presença de bFGF (50 ng·mL-1) e VEGF-A (25 ng·mL-1).</li>
	<li>Alternativamente, adicione o Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 no dia 4 e 5 ng·mL-1 no dia 6 e no dia 8) ao meio de diferenciação vascular para promover a diferenciação das células murais.</li>
</ol>5. Análise por citometria de fluxo
<ol><li>Coletar os EBs de 9 dias em um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta P1000 e lavá-los uma vez com PBS quente.</li>
	<li>Adicionar 1mL de meio G-MEM BHK-21 contendo 0,2 mg·mL-1 de colagenase A e incubar as células em incubadora de CO2 por 5 min.</li>
	<li>Dissociar os EBs pipetando suavemente para cima e para baixo com uma pipeta P1000.</li>
	<li>Interromper a atividade da colagenase adicionando 1 mL de meio G-MEM BHK-21 frio com 10% de FBS.</li>
	<li>Centrifugar as células a 200 x g por 5 min no TR.</li>
	<li>Ressuspender as células em 500 μL de PBS com SFB a 2%.</li>
	<li>Conte as células usando um hemocitômetro de Neubauer.</li>
	<li>Ressuspender 400.000 células em 100 μL de PBS com 2% de FBS por condição de coloração.</li>
	<li>Incubar as células durante 45 minutos a 4 °C com os seguintes anticorpos: APC conjugado de rato anti-rato PECAM-1 (clone MEC13.3) e FITC conjugado de rato anti-rato CD45 (clone 30-F11) ou anticorpos de controlo isotípico.</li>
	<li>Lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS contendo FBS a 2%.</li>
	<li>Ressuspender as células para atingir uma concentração final de 5 x 106 células por mL.</li>
	<li>Filtre as células usando um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo, com uma tampa de encaixe do filtro de células.</li>
	<li>Analisar 20.000 eventos PECAM-1 (+) por citometria de fluxo.</li>
</ol>6.3D ensaio de angiogênese por brotamento e coloração por imunofluorescência
<ol><li>No dia 9, preparar um meio de brotação adicionando 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), eritropoetina humana recombinante (hEPO) (20 ng·mL-1), interleucina-6 humana (IL-6) (10 ng·mL-1), β-mercaptoetanol 0,05 mM, NEAA (1x), L-glutamina (1x), piruvato de sódio (1x), colágeno de cauda de rato tipo I (1,25 mg·mL-1), e NaOH (3,1 mM) para GMEM em meio BHK-1.</li>
	<li>Para evitar a gelificação do colágeno, mantenha o meio de brotação no gelo até o uso.</li>
	<li>Para avaliar o efeito de moléculas pró/antiangiogênicas, adicione o fármaco ou veículo selecionado ao meio de brotação na concentração selecionada.</li>
	<li>Coletar EBs de 9 dias de uma placa de ágar de 60 mm em um tubo cônico de 15 mL (equivalente a uma condição) e remover o sobrenadante após alguns minutos de sedimentação.</li>
	<li>Cobrir o fundo de uma placa de cultura de 35 mm com 1 mL do meio de brotação e incubar a 37 °C por 5 min para induzir a gelificação.</li>
	<li>Ressuspender as EBs em 2 mL de meio de brotação a frio.</li>
	<li>Transfira a suspensão para a placa de cultura de 35 mm revestida com a primeira camada de meio de brotação.</li>
	<li>Distribua os EBs por toda a placa e certifique-se de que eles estejam a uma distância igual um do outro. Incubar o prato em uma incubadora de CO2 . A primeira formação de brotos acontece dentro de 24-48 h.</li>
	<li>No 12º dia, o gel de colágeno contendo EBs é cuidadosamente transferido para uma lâmina de vidro (75 x 26 mm) usando uma espátula.</li>
	<li>Retire o excesso de líquido usando uma pipeta (P1000) e desidrate o gel colocando uma folha de gaze de linho de nylon e cartões de filtro absorvente (gel blotting paper) sobre o gel. Aplique pressão colocando um peso (250 g) por 2 min. Retire cuidadosamente os papéis de nylon/filtro e deixe as lâminas secarem ao ar por 30 min no RT.</li>
	<li>Lave as lâminas três vezes com PBS por 5 min no RT.</li>
	<li>Fixar os EB utilizando solução de zinco (ver Tabela de Materiais) o/n a 4 °C. Alternativamente, fixar os EBs fluorescentes em mosaico com Paraformaldeído (PFA) (4%) o/n a 4 °C no escuro.</li>
	<li>Remova o fixador. Lave as lâminas cinco vezes com PBS por 5 min no RT.</li>
	<li>Permeabilizar os EBs em PBS contendo Triton-X100 a 0,1% por 15 min no TR.</li>
	<li>Remova a solução de permeabilização. Lave as lâminas cinco vezes com PBS por 5 min.</li>
	<li>Incubar os EBs no tampão de bloqueio (PBS com 2% de Albumina de Soro Bovino, BSA) por 1 h no TR.</li>
	<li>Para corar os brotos endoteliais, use um anticorpo primário anti-PECAM-1 de rato (diluição de 1:100) no tampão de bloqueio o/n a 4 °C.</li>
	<li>Lave as lâminas cinco vezes com PBS por 5 min.</li>
	<li>Incubar as lâminas com o anticorpo secundário Alexa 555 anti-rato de cabra em tampão de bloqueio (diluição de 1:250) e, quando necessário, com o anticorpo anti-α-SMA conjugado com FITC em tampão de bloqueio (diluição de 1:250) para corar as células murais por 2 h no RT no escuro.</li>
	<li>Lave as lâminas três vezes com PBS por 5 min e uma vez com H20 antes de montá-las.</li>
</ol>7. Imagem confocal, morfométrica e análise quantitativa de brotos endoteliais de EB
<ol><li>Adquirir imagens de alta resolução das EBs imunomarcadas por fusão no plano focal (z-stacking) usando um microscópio confocal. Use a objetiva de ampliação de 10x para criar imagens de EBs inteiras.</li>
	<li>Analisar as imagens adquiridas no ImageJ para avaliar a morfologia e quantificar as características dos brotos endoteliais positivos para PECAM-1 de acordo com métodos de quantificação estabelecidos13,14,21.<ol><li>Calcular o número médio de brotos endoteliais por EBs contando manualmente o número total de brotos por EBs individuais.</li>
		<li>Meça os comprimentos individuais dos brotos usando a ferramenta de desenho ImageJ. Definir a base do broto endotelial a partir da área central da EB e traçar manualmente uma linha até o final da ponta do broto.</li>
		<li>Calcule o número médio de células da ponta por broto contando manualmente o número de células da ponta por broto individual e, em seguida, calcule a média por EB.</li>
		<li>Calcule a orientação dos filópodes determinando manualmente o eixo do broto pai e meça o ângulo agudo entre eles usando a ferramenta de ângulo do software ImageJ. Calcule o número de brotos com orientação >50° e divida pelo número total de brotos do EB de interesse. OBS: Os ângulos sempre variaram de 0° a 90°.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquirir imagens de alta resolução das EBs imunomarcadas usando um microscópio confocal. Use a objetiva de aumento de 40x para obter imagens de alta resolução de brotos endoteliais únicos.</li>
	<li>Quantifique a cobertura vascular de brotos CE positivos para PECAM-1 circundados por MCs positivos para α-SMA usando o software ImageJ.<ol><li>Divida as imagens mescladas em canais vermelhos e verdes separados.</li>
		<li>Converta as imagens em sua forma binária.</li>
		<li>Medir a área celular total do broto ocupada separadamente por células positivas para PECAM-1 (células endoteliais marcadas em vermelho) e por células positivas para α-SMA (células murais marcadas em verde).</li>
		<li>Gere a imagem mesclada usando a função de calculadora de imagem e o operador AND. Meça a área celular total da imagem. Para calcular a cobertura, divida a área da imagem colocalizada pela área da imagem binária PECAM-1.</li>
	</ol></li>
	<li>Para analisar a competição celular pela posição das células da ponta/pedúnculo endotelial de brotos desenvolvidos por EBs em mosaico, pontuar manualmente o número de células da ponta e marcar sua origem genotípica com base no sinal de fluorescência. Calcular os valores médios por EB.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um ensaio vascular de brotamento baseado em EB 3D imparcial, robusto e reprodutível, passível de triagem para drogas e genes moduladores da angiogênese. Este método oferece vantagens sobre muitos ensaios bidimensionais (2D) amplamente utilizados usando culturas de células endoteliais, como as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) para monitorar a migração (ensaio de scratch lateral ou o ensaio da câmara de Boyden)22,23 ou proliferação (contagem do número de células, detecção de sín...

Nas últimas três décadas, a descoberta de fármacos baseada em alvos (TDD) tem sido amplamente empregada na descoberta de fármacos pela indústria farmacêutica. A TDD incorpora um alvo molecular definido que desempenha um papel importante em uma doença e depende do desenvolvimento de sistemas de cultura celular relativamente simples e leituras para triagem de drogas1. A maioria dos modelos típicos de doenças usados em programas de TDD incluem métodos tradicionais de cultura de células, como células cancerosas ou linhagens celulares imortalizadas cultivadas em ambientes artificiais e substratos não fisiológicos. Embora muitos desses modelos tenham fornecido ferramentas viáveis para identificar candidatos a fármacos bem-sucedidos, o uso de tais sistemas pode ser questionável devido à sua baixa relevância para a doença2.
Para a maioria das doenças, os mecanismos subjacentes são realmente complexos e vários tipos celulares, vias de sinalização independentes e múltiplos conjuntos de genes são frequentemente encontrados para contribuir para um fenótipo específico da doença. Isso também é verdade para doenças hereditárias em que a causa primária é uma mutação em um único gene. Com o recente advento de tecnologias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) e ferramentas de edição gênica, agora é possível gerar organoides 3D e modelos de doenças organ-on-chip que poderiam recapitular melhor a complexidade humana in vivo 3,4. O desenvolvimento de tais tecnologias está associado ao ressurgimento do interesse em programas de descoberta de drogas fenotípicas (TID)1. O TID pode ser comparado ao rastreamento empírico, pois não depende do conhecimento da identidade de um alvo específico da droga ou de uma hipótese sobre seu papel na doença. A abordagem TID é hoje cada vez mais reconhecida por contribuir fortemente para a descoberta de drogas de primeira classe5. Como o desenvolvimento de tecnologias de organoides humanos e organ-on-chip ainda está engatinhando, espera-se que os modelos iPSC (complementados com ferramentas inovadoras de imagem e aprendizado de máquina6,7) forneçam, em um futuro próximo, vários novos modelos complexos de doenças baseadas em células para triagem de drogas e programas associados de TID para superar a baixa produtividade da abordagem TDD8, 9º.
Embora os modelos organoides humanos e organ-on-chip possam fornecer informações importantes sobre a complexidade da doença e para a identificação de novos medicamentos, trazer medicamentos para a nova prática clínica também depende fortemente de dados de modelos animais para avaliar sua eficácia e segurança. Entre eles, camundongos geneticamente modificados são certamente os modelos de mamíferos preferidos. Eles têm muitas vantagens, pois têm um tempo de geração relativamente curto para os mamíferos, têm muitos fenótipos semelhantes às doenças humanas e podem ser facilmente manipulados geneticamente. São, portanto, extensivamente utilizados em programas de descoberta de fármacos10. No entanto, fazer a ponte entre camundongos e humanos continua sendo um desafio importante11. O desenvolvimento de modelos in vitro de camundongos equivalentes a modelos organoides e organ-on-chip humanos poderia, pelo menos parcialmente, preencher essa lacuna, pois permitirá comparações diretas de eficácia e segurança de medicamentos entre dados in vivo de camundongos e in vitro em humanos. 
Aqui, um ensaio de brotamento vascular em corpos embrionários (EBs) de camundongos é descrito. Os vasos sanguíneos são compostos por células endoteliais (revestimento interno das paredes dos vasos), células murais (células musculares lisas vasculares e pericitos)12. Esse protocolo baseia-se na diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) em EBs vascularizadas utilizando gotículas pendentes que recapitulam a diferenciação de células endoteliais e murais de novo 13,14. CTEs de camundongos podem ser facilmente estabelecidas em cultura a partir de blastocistos isolados do dia 3,5 de camundongos com diferentes origens genéticas15. Também oferecem possibilidades de análise clonal, rastreamento de linhagens e podem ser facilmente manipulados geneticamente para gerar modelos de doenças13,16.
Como os vasos sanguíneos nutrem todos os órgãos, não é surpreendente que muitas doenças, se não todas, estejam associadas a alterações na microvasculatura. Em condições patológicas, as células endoteliais podem adotar um estado ativado ou podem se tornar disfuncionais, resultando em morte celular mural ou migração para longe dos vasos sanguíneos. Estes podem resultar em angiogênese excessiva ou em rarefação de vasos, podem induzir fluxo sanguíneo anormal e barreira vascular defeituosa levando ao extravasamento de células imunes e inflamação12,17,18,19. A pesquisa para o desenvolvimento de fármacos moduladores dos vasos sanguíneos é, portanto, alta, e múltiplos atores e conceitos moleculares já foram identificados para o direcionamento terapêutico. Nesse contexto, o protocolo descrito é particularmente adequado para a construção de modelos de doenças e para testes de drogas, pois recapitula as principais características da angiogênese em brotamento in vivo, incluindo seleção de células da ponta e do pedúnculo endotelial, migração e proliferação de células endoteliais, orientação de células endoteliais, formação de tubos e recrutamento de células murais. Também apresenta semelhanças com ensaios vasculares 3D recentemente descritos, baseados em tecnologias humanas iPSC20.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Milipore, Merck</td><td>805740</td><td>Biohazard: instruções de segurança adequadas devem ser seguidas ao manusear</td></tr><tr><td>Agar Noble</td><td>Difco, BD Pharmigen</td><td>214220</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluo 555 cabra anti-rato IgG</td><td>Life technologies</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>APC anticorpo conjugado anti-rato PECAM-1 de rato (clone MEC13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>Rato APC IgG2a &kappa; Controle de Isotipo (Clone&nbsp; R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 25 microscópio de cultura de tecidos de contraste de fase invertida</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada, Allegra X-15R</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932 Gabinete de</td><td></td></tr><tr><td>biossegurança BioVanguard (Linha Verde)</td><td>Telstar</td><td>133H401001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células, Buerker, 0,100 mm</td><td>Marienfeld</td><td>640211</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células 60 x 15 mm</td><td>Corning</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células, 35 x 10 mm</td><td>Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células 12 poços</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de detecção de PCR em tempo real CFX96 Touch</td><td>Biorad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>soro de frango</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021) HCl</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, alta concentração, cauda de rato, 100mg</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>colagenase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Varredura a laser confocal Microscópio, TCS SP5</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura, 24 &vezes; 50 mm</td><td>Vwr</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>DAPT &gamma;? inibidor de secretase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DC101 anti camundongo VEGFR-2 Clone</td><td>BioXcell</td><td>BP0060</td><td></td></tr><tr><td>DC101 isotipo rato IgG1</td><td>BioXcell</td><td>BP0290</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438-5X</td><td>Biohazard: instruções de segurança adequadas devem ser tomadas ao manusear</td></tr><tr><td>DPBS (10x), sem cálcio, sem magnésio</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>14200067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 40 mM</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco embrionárias Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>16141-079</td><td>Deve ser testado por lote para máxima viabilidade e crescimento de células ES. Inativar o calor a 60&deg; C e armazenar em &menos; 20 &deg; C por até 1 ano</td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge 5415R</td><td>Eppendorf AG</td><td>&nbsp; </td><td></td>Z605212</tr><tr><td>Eritropoietina humana (hEPO), 250 U (2,5 &micro; g) (1 mL)</td> <td>Proteína</td><td></td> LIF de camundongo recombinante Roche 11120166001 <td></td></tr><tr><td>ESGRO (10? unidades&nbsp; &nbsp; 1 mL)</td> <td>Milipore, tubos Merck</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon 50 mL</td><td>Greiner Bio-0ne</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>Ponta do filtro, transparente, estéril F.Gilson, P-200</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>Ponta do filtro, transparente, estéril F.Gilson, P10</td><td>Greiner Bio-One</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>Ponta do filtro, transparente, estéril F.Gilson, P1000</td><td>Greiner Bio-One</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugado anti-&alfa; Actina de músculo liso (SMA) (clone 1A4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugado rato anti-camundongo CD45 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103107</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rato IgG2b, &kappa; Isotipo Ctrl Anticorpo (clone RTK4530)</td><td>Biolegend</td><td>400605</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de montagem fluorscente</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Gascompress</td><td>Cutisoft</td><td>45846</td><td></td></tr><tr><td>Gaze Cutisoft 10 x 10 cm</td><td>Bsn Medical</td><td>45844_00</td><td></td></tr><tr><td>Papel mata-borrão em gel, Grau GB003</td><td>Whatman</td><td>WHA10547922</td><td></td></tr><tr><td>Solução de gelatina, tipo B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow's MEM (GMEM)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>21710082</td><td></td></tr><tr><td>IHC Fixador de Zinco</td><td>BD Pharmigen</td><td>550523</td><td></td></tr><tr><td>IncuSafe CO2 Incubadora</td><td>PHCBi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-6, humano (hIL-6)</td><td>Roche</td><td>11138600001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de lâminas de microscópio</td><td>Kartell Labware</td><td>278</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio, vidro Starfrost</td><td>Knittel</td><td>VS113711FKB.0</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>QT00110467</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Eng_1_SG Ensaio de Primer QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00148981</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Epha4_1_SG Ensaio de Primer QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>QT00093576</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Ephb2_1_SG Ensaio de Primer QuantiTect</td><td>QT00154014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mm_Flt1_1_SG Ensaio de Primer QuantiTect</td><td>QT00096292</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mm_Flt4_1_SG Ensaio de Primer QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>QT00099064</tr><tr><td>Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>QT01658692</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>QT00097020</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer</td><td>Qiagen</td><td>QT00156982</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer</td><td>Assay Qiagen</td><td>QT00153104</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer</td><td>Qiagen</td><td>QT01052044</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>QT00114576</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo (ICR) Fibroblastos Embrionários Inativados&nbsp; (2 milhões)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>A24903</td><td>Armazene frascos em nitrogênio líquido (195,79 &deg; C) linha</td></tr><tr><td>de células-tronco embrionárias de camundongo indefinidamente 7AC5 / EYFP (ATCC SCRC-1033)</td> <td>ATCC</td><td>SCRC-1033</td><td>Gerado pelo Dr. A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontário, M5G 1X5, Canadá. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mecanismos de Desenvolvimento. 76 (1&ndash; 2), 79&ndash; 90 (1998)].</td></tr><tr><td>Linhagens de células-tronco embrionárias de camundongo Acvrl1 +/- e Acvrl1 +/+</td><td></td><td></td><td>Geradas no Centro Médico da Universidade de Leiden [Thalgott, J.H. et al. Circulação. 138 (23), 2698&ndash; 2712 (2018)].</td></tr><tr><td>Células-tronco embrionárias de camundongo linhagem E14</td><td></td><td></td><td>Fornecido pelo laboratório M Letarte e gerado de acordo com Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635&ndash; 3642 (2001).</td></tr><tr><td>Células-tronco embrionárias de camundongo linhagem R1 (ATCC SCRC-1011)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1011</td><td>Gerado pelo Dr. A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontário, M5G 1X5, Canadá. [Nagy, A., et al. Procedimentos da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América. 90 (18), 8424-ndash; 8428 (1993)].</td></tr><tr><td>Linha de células-tronco embrionárias de camundongo Z / Red (cepa 129 / Ola)</td><td></td><td></td> <td>Gerado pelo Dr. A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontário, M5G 1X5, Canadá [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241&ndash; 246 (2004)].</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 UV/VIS Espectrofotômetro</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleckchem</td><td>S1036</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB,</td> anticorpo <td>Peprotech</td><td>100-14B</td><td></td>Pecam-1 humano recombinante</tr><tr><td>, Rato Anti-Rato</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>placa de Petri, PS, 94/16 mm, padrão, com aberturas, estéril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy acu 2</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155 019</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman G Multicanal P8 x 200G</td><td>Gilson</td><td>F144072</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman G Starter Kit, 4 Kit de pipeta, P2G, P20G, P200G, P1000G</td><td>Gilson</td><td>F167360</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4 humano recombinante Proteína</td><td>R& Mini</td> kit RNeasy Plus <td>314-BP</td><td></td>da D Systems</tr><tr><td></td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas, 10 mL</td><td>de pipetas sorológicas Greiner Bio-One</td><td>607 180</td><td></td></tr><tr><td>, 25 mL</td><td>de pipetas sorológicas Greiner Bio-One</td><td>760 180</td><td></td></tr><tr><td>, 5 mL</td><td>de Greiner Bio-One</td><td>606 180</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Merck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio 100 mM</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio 5ml fundo redondo com tampa de filtro de células</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador, T100</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (BioXtra)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td> <td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>Tripsina (2,5%)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Filtro a Vácuo/Garrafa de Armazenamento, 500 mL</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>VEGFA165 , água murina recombinante</td><td>Peprotech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr>, banho-maria<td>estéril</td><td>Fresenius-Kabi</td><td>B230531</td><td></td></tr>, <tr><td>Lab-Line Digital</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>18052A</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ensaio tridimensional de angiogênese utilizando células-tronco embrionárias de camundongos para modelagem de doenças vasculares e testes de fármacos

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Avanços recentes em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) e tecnologias de edição de genes permitem o desenvolvimento de novos modelos de doenças baseadas em células humanas para programas de descoberta de drogas fenotípicas (PDD). Embora esses novos dispositivos pudessem prever a segurança e a eficácia de drogas experimentais em humanos com mais precisão, seu desenvolvimento para a clínica ainda depende fortemente de dados de mamíferos, notadamente o uso de modelos de doenças em camundongos. Em paralelo aos modelos de doenças organoides ou organ-on-chip humanas, o desenvolvimento de modelos relevantes em camundongos in vitro é, portanto, uma necessidade não atendida para avaliar comparações diretas de eficácia e segurança de medicamentos entre espécies e condições in vivo e in vitro. Neste artigo, descreve-se um ensaio de brotamento vascular que utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários (EBs). EBs vascularizadas cultivadas em gel de colágeno 3D desenvolvem novos vasos sanguíneos que se expandem, um processo chamado angiogênese brotamento. Esse modelo recapitula as principais características da angiogênese germinada in vivo-formação de vasos sanguíneos a partir de uma rede vascular pré-existente, incluindo seleção de células da ponta endotelial, migração e proliferação de células endoteliais, orientação celular, formação de tubos e recrutamento de células murais. É passível de triagem para drogas e genes moduladores da angiogênese e apresenta semelhanças com ensaios vasculares tridimensionais (3D) recentemente descritos baseados em tecnologias humanas de iPSC.

A visão geral do protocolo do ensaio de brotamento de vasos sanguíneos é mostrada na Figura 1. EBs de nove dias de idade derivadas de três linhagens independentes de 129/Ola mESC (Z/Red, R1 e E14) foram enzimaticamente dissociadas em células únicas usando colagenase A. As células foram coradas para PECAM-1 e analisadas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) conforme descrito. Todas as linhagens celulares exibiram diferenciação endotelial robusta, e não foram observadas di...

Este ensaio utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários cultivadas em gel de colágeno 3D para analisar os processos biológicos que controlam a angiogênese brotada in vitro. A técnica pode ser aplicada para testar drogas, modelar doenças e estudar genes específicos no contexto de deleções embrionariamente letais.

In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

Este protocolo descreve um ensaio de angiogênese brotamento in vitro que recapitula muitas características da formação de vasos sanguíneos e pode ser usado para testar drogas. Esse método é fácil de implementar em laboratório, robusto e escalável. Tem muitas semelhanças com ensaios usando células endoteliais humanas e microesferas.Esse modelo mimetiza robustamente o fenótipo mostrando seleção defeituosa das células da ponta endotelial e migração orientada de células endoteliais que leva à angiogênese patológica. O trabalho pode fornecer informações sobre os mecanismos que regulam a angiogênese brotante, os genes-chave e as vias de sinalização envolvidas, notadamente realizando o rastreamento genético O principal desafio é manter a qualidade ou pluripotência das células-tronco embrionárias de camundongos em cultura. É importante verificar regularmente os estágios de pluripotência e a morfologia das linhagens celulares.Também é importante realizar um cariótipo das linhagens celulares, pois elas tendem a perder ou ganhar cromossomos. Comece revestindo um poço da placa de cultura de células de seis poços com 500 microlitros de solução de gelatina a 0,1% e coloque-o em uma incubadora de

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Research

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Biology

Biologia

Este vídeo demonstra o protocolo de um ensaio in vitro angiogênese que recapitula vários estágios de angiogênese. Lapso de tempo imagens de germinação, formação de lúmen, ramificação e anastomose - características-chave da angiogênese - são mostrados.

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Descrevemos uma abordagem microcirúrgico para a geração de um circuito arteriovenoso (AV) como um modelo para analisar a vascularização in vivo num ambiente isolado e bem caracterizado. Este modelo não só é útil para a investigação de angiogênese, mas também é perfeitamente adaptado para a engenharia axial vascularizado e tecidos transplantáveis.

The Loop arteriovenosa (AV) em um modelo animal pequeno para estudar angiogénese e Engenharia de tecido vascularizado

Este trabalho apresenta um procedimento abrangente para avaliar em vitro se vasculogênese clássico existe em hemangioblastomas (HBs) e seu papel na HBs. Os resultados destacam a complexidade do HB-neovascularização e sugerem que esta forma comum de angiogênese é apenas um mecanismo complementar no HB-neovascularização.

Um procedimento abrangente para avaliar o desempenho In Vitro da neovascularização de Hemangioblastoma putativo usando o Spheroid brotando do ensaio

Os progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC-EPs) têm potencial para revolucionar os tratamentos de doenças cardiovasculares e possibilitar a criação de modelos de doenças cardiovasculares mais fiéis. Nisto, o encapsulamento de iPSC-EPs em microambientes tridimensionais do colagénio (3D) e uma análise quantitativa do potencial vasculogenic destas pilhas são descritos.

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Este método descreve a cultura das células endotélias derivadas do iPSC como 40 microvasos 3D perfundidos em uma plataforma microfluídica padronizada. Esta plataforma permite o estudo do sprouting angiogenic gradiente-conduzido em 3D, incluindo a anastomose e a estabilização dos sprouts angiogenic em uma maneira escalável e high-throughput.

Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

O sistema esferóide tridimensional do ensaio da angiogênese da cocultura é projetado imitar a angiogênese fisiológica. Os esferoides da co-cultura são dados forma por dois precursores vasculares humanos da pilha, por ecfcs e por MSCS, e incorporados no gel do colagénio. O novo sistema é eficaz para avaliar moduladores angiogênicos e fornece informações mais relevantes para o estudo in vivo.

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Este protocolo apresenta ensaio de brotos de choroide, um modelo ex vivo de proliferação microvascular. Este ensaio pode ser usado para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais e avaliar tratamentos medicamentosos usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.

Um Ensaio Ex Vivo Choroid de Angiogênese Microvascular Ocular

Este estudo apresenta o ensaio de migração bidimensional (2D) e o ensaio tridimensional (3D) de brotamento esferóide, juntamente com seus respectivos métodos de análise a jusante, incluindo extração de RNA e imunocitoquímica, como ensaios adequados para estudar a angiogênese in vitro.

Investigando a angiogênese em nível funcional e molecular, aproveitando o ensaio de migração de feridas por arranhões e o ensaio de brotamento de esferóides

A angiogênese germinativa, fundamental para o desenvolvimento e a doença, envolve processos moleculares e mecânicos complexos. Apresentamos um modelo ex vivo 2.5D versátil que analisa o brotamento celular das artérias carótidas suínas, revelando a angiogênese dependente da rigidez e a mecânica celular líder-seguidora distinta. Este modelo auxilia no avanço de estratégias de engenharia de tecidos e abordagens de terapia do câncer.

Modelo 2.5D para caracterização mecânica ex vivo da angiogênese germinada em tecido vivo

Aprenda um ensaio tridimensional de angiogênese in vitro usando células-tronco embrionárias de camundongos para modelagem de doenças vasculares e triagem de fármacos. Este método robusto permite estudos mecanicísticos detalhados.

In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos (Vídeo) | JoVE Journal

In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

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