In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

Este protocolo descreve um ensaio de angiogênese brotamento in vitro que recapitula muitas características da formação de vasos sanguíneos e pode ser usado para testar drogas. Esse método é fácil de implementar em laboratório, robusto e escalável. Tem muitas semelhanças com ensaios usando células endoteliais humanas e microesferas.

Esse modelo mimetiza robustamente o fenótipo mostrando seleção defeituosa das células da ponta endotelial e migração orientada de células endoteliais que leva à angiogênese patológica. O trabalho pode fornecer informações sobre os mecanismos que regulam a angiogênese brotante, os genes-chave e as vias de sinalização envolvidas, notadamente realizando o rastreamento genético O principal desafio é manter a qualidade ou pluripotência das células-tronco embrionárias de camundongos em cultura. É importante verificar regularmente os estágios de pluripotência e a morfologia das linhagens celulares.

Também é importante realizar um cariótipo das linhagens celulares, pois elas tendem a perder ou ganhar cromossomos. Comece revestindo um poço da placa de cultura de células de seis poços com 500 microlitros de solução de gelatina a 0,1% e coloque-o em uma incubadora de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, lave as placas revestidas de gelatina com PBS e adicione 500 microlitros de CM recém-preparado mais meio negativo.

Para obter uma população pura de células-tronco embrionárias de camundongo ou mESCs, tripsinize a placa de cultura celular com tampão TVP 10x por 30 segundos à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de meio de diferenciação mesodérmica antes de transferi-las para a placa de seis poços revestida com gelatina por 30 minutos para permitir que os fibroblastos embrionários de camundongos se fixem enquanto as mESCs permanecem em suspensão. Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros antes de contar as células vivas usando um hemocitômetro de Neubauer no corante azul de Trypan.

Em seguida, centrifugar as células a 200 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em volume apropriado de meio de diferenciação mesodérmico. Prepare quatro pratos de poliestireno de fixação baixa de 94 milímetros adicionando 15 mililitros de água estéril ao fundo.

Após transferir a suspensão celular para um reservatório plástico estéril, carregar quatro posições de uma pipeta multicanal com 22 microlitros de suspensão celular por canal. Levante e coloque a tampa invertida do prato de 94 milímetros na superfície limpa do armário de fluxo com o lado interno voltado para cima. Deposite 40 gotas da suspensão celular na superfície interna de cada tampa e inverta cuidadosamente a tampa sem perturbação para colocá-la de volta no prato, de modo que as gotas fiquem voltadas para a água.

Incubar as placas em uma incubadora de dióxido de carbono por quatro dias, considerando isso como dia zero de diferenciação. Após quatro dias de incubação, coletar as gotas pendentes em um tubo cônico de 15 mililitros usando uma pipeta P1000. Deixe o sedimento EB no tubo antes de remover o sobrenadante.

Ressuspender as EBs em três mililitros de meio de diferenciação vascular 2x antes de transferir e distribuir uniformemente a suspensão da EB em uma placa revestida de ágar 60 milímetros. Incube os pratos em uma incubadora de dióxido de carbono até o nono dia com uma atualização média a cada dois dias. Prepare um prato de cultura de 35 milímetros adicionando um mililitro do meio de brotação ao seu fundo.

Para induzir a gelificação, incube o prato a 37 graus Celsius por cinco minutos. Coletar EBs de nove dias de uma placa de ágar em um tubo cônico de 15 mililitros e remover o sobrenadante. Ressuspender os EBs em dois mililitros de meio de brotação a frio para transferir para a placa de cultura revestida com a primeira camada de meio de brotação.

Distribua os EBs por toda a placa, garantindo que eles estejam a uma distância igual um do outro. A formação do primeiro broto deve ser evidente após a incubação por cerca de 24 a 48 horas. No dia 12, use uma espátula para transferir cuidadosamente o gel de colágeno contendo EBs para uma lâmina de vidro.

Retire o excesso de líquido com uma pipeta e desidrate o gel colocando uma folha de gaze de linho de nylon e cartões de filtro absorvente por cima do gel. Aplique pressão com um peso de 250 gramas por dois minutos. Em seguida, retire os papéis de nylon para permitir que as lâminas sequem ao ar por 30 minutos em temperatura ambiente.

Após a secagem, fixar os EBs usando solução de zinco durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, retire o fixador antes de lavar as lâminas cinco vezes com PBS. Permeabilizar os EBs e PBS contendo 0,1% de Triton X-100.

Após 15 minutos, retirar a solução de permeabilização para lavar as lâminas cinco vezes com PBS por cinco minutos. Incubar os EBs no tampão de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente e lavar com PBS por cinco minutos. Em seguida, adicione o anticorpo primário diluído no tampão de bloqueio e incube a quatro graus Celsius durante a noite.

Em seguida, incubar as lâminas com o anticorpo secundário Goat anti-Rat Alexa 555 em um tampão de bloqueio por duas horas à temperatura ambiente. Após a incubação, lavar as lâminas três vezes com PBS por cinco minutos e uma vez com água antes de montá-las para microscopia. O ensaio de angiogênese com brotamento 3D foi realizado em três EBs com dois fármacos, DC101 e DAPT.

Ambos os compostos bloquearam progressivamente a angiogênese no modelo de EB com concentrações crescentes. As diversas concentrações de fármacos nas EBs mostraram que altas doses de DC101 inibem o número e o comprimento dos brotos dos vasos. DAPT teve efeitos opostos na dose de um micromol por litro.

DAPT aumentou fortemente o número de células da ponta endotelial por brotos de vasos com fenótipo de orientação incorreta mesmo em doses baixas, em comparação com DC101. Vasos defeituosos brotaram em EBs de telangiectasia hemorrágica hereditária do controle ACVRL1 e genótipos heterozigotos de ACVRL1 com numerosos fenótipos de orientação incorreta brotando em ângulos aleatórios em relação aos vasos de origem. Misturas de uma linha mESC selvagem-tipo em uma proporção um-para-um com uma linha selvagem mESC não marcada, levaram a uma contribuição igual para as principais células da ponta endotelial.

A análise microscópica dessa EB quimérica representativa foi realizada para identificar a origem genotípica das principais células da ponta endotelial. Para quantificar a cobertura celular mural do brotamento do vaso, as EBs foram fixadas e coradas para marcadores de células endoteliais, PECAM, e marcador de células murais, alfa actina de músculo liso. Uma imagem de alta magnificação revelou que um brotamento de vaso individual estava cercado por células murais.

A transformação binária foi realizada após a separação dos canais de cor e a proporção de vasos positivos para PECAM cobertos por células murais alfa SMA positivas foi quantificada. O background genético da linhagem de células-tronco embrionárias também é um fator-chave que os pesquisadores devem considerar, pois algumas linhagens brotam melhor do que outras. Este método pode ser usado para realizar o rastreamento genético usando abordagens RNAi ou um banco de células-tronco embrionárias de camundongos que abrigam mutações gênicas.