Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse
9 de junho de 2021
Aqui descrevemos um método para visualizar a sinaptogênese de neurônios de grânulos no cerebelo do rato ao longo do curso de tempo do desenvolvimento cerebral pós-natal, quando essas células refinam suas estruturas sinápticas e formam sinapses para se integrarem ao circuito cerebral geral.
O protocolo estuda neurônios de grânulos cerebelares em diferentes estágios de desenvolvimento, a fim de visualizar o crescimento morfológico chave. As vantagens da técnica incluem segmentação específica da célula, expressão rápida de construções transfectadas e marcação esparsa de células, o que permite o estudo dos efeitos autônomos celulares. Comece cortando um segmento de 11,2 milímetros de uma ponta de pipeta de carregamento e coloque a parte cortada sobre a ponta da seringa Hamilton como um espaçador para limitar a profundidade de injeção a 1,5 milímetros.
Prenda o espaçador na ponta da seringa com adesivo ou parafilme. Para estudar a morfologia de CGNs eletroporados únicos de seções cerebrais sagitais do filhote experimental, faça imagens de Pilha Z a 0,5 micrômetros por pilha em um microscópio confocal. Imagem de uma célula por janela de imagem para permitir uma fácil análise de imagem e reconstrução 3D.
Analise o comprimento da neurite e a formação de garras dendríticas de maneira cega usando traçador de neurita simples. Carregue imagens Z-stack de canal único de CGNs eletroporados em Fiji e clique em Plugins"Segmentation"and Simple Neurite Tracer"Select Create New 3D Viewer"no menu suspenso. Role até a base de um dendrito que se conecta ao soma da célula e inicie um caminho clicando na junção.
Trace manualmente o caminho clicando nas seções em que o sinal de preenchimento da célula é mais brilhante e pressionando Y para manter o rastreamento. Trace até o final do dendrito e confirme o caminho pressionando F.Alternativamente, trace até a base da garra. Em seguida, trace a garra desde a base da estrutura até o final da neurita mais longa.
Rastreie ramificações secundárias e terciárias mantendo pressionada a tecla Control no Windows ou ALT em um macOS e clicando no caminho. Confirme o caminho pressionando F.Observe que as medições para os traços são visíveis em uma janela separada. Some todos os tamanhos dos ramos das garras para obter o comprimento total de cada garra.
Na análise representativa, as imagens de projeção de CGNs eletroporados, de 3 a 14 dias após a injeção, mostraram uma diminuição progressiva no número de dendritos. Os CGNs passaram por uma fase de crescimento dendrítico seguida de refinamento de 3 DPI para 7 DPI que resultou na poda de mais de 50% do excesso de dendritos. Este evento coincide com o alongamento gradual dos mandris restantes na formação de estruturas semelhantes a garras no final de cada dendrito, indicando que esses processos de desenvolvimento estão acontecendo simultaneamente.
Por 7 DPI, garras foram encontradas em cerca de 75% dos dendritos. Cada CGN marcado foi reconstruído em RMNM para quantificar a área de superfície somato-dendrítica total e o volume. Nenhuma diferença significativa no tamanho do CGN foi observada ao longo do desenvolvimento.
Embora em 7 DPI, os CGNs exibiram uma diminuição significativa de 20% no volume em comparação com 3, 5 e 10 DPI. A coisa mais importante no procedimento é localizar com precisão o cerebelo antes da injeção. O método pode ser adaptado para manipular geneticamente genes in vivo para estudar seu papel no desenvolvimento de neurônios de grânulos por transfecção de shRNAs, siRNAs ou Cre Recombinase.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para estudar o desenvolvimento morfológico de neurônios granulares cerebelares (CGNs) no cerebelo em desenvolvimento de camundongo utilizando eletroporação in vivo. A técnica permite a marcação esparsa e a manipulação genética dos CGNs, possibilitando uma análise detalhada do crescimento dendrítico, formação de garras e sinaptogênese durante estágios-chave do desenvolvimento. O método combina injeção precisa, imagem confocal e análise morfométrica quantitativa para acompanhar a maturação dos CGNs ao longo do tempo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Biologia Celular
Contexto
- Os neurônios passam por mudanças estruturais e funcionais significativas durante o desenvolvimento cerebral.
- O cerebelo de roedor é um sistema modelo para o estudo da morfogênese em nível celular, particularmente dos neurônios granulares cerebelares (CGNs).
- Os CGNs formam garras dendríticas especializadas que são fundamentais para a entrada sináptica.
- Os métodos tradicionais de marcação frequentemente apresentam falta de especificidade celular ou resolução temporal.
Objetivo do Estudo
- Visualizar e quantificar o desenvolvimento morfológico de neurônios granulares cerebelares individuais in vivo.
- Acompanhar o crescimento dendrítico, a poda e a formação de garras ao longo de pontos temporais do desenvolvimento.
- Fornecer uma plataforma para manipulação genética autônoma celular dos neurônios granulares cerebelares.
Métodos Utilizados
- Eletroporação in vivo de progenitores de neurônios granulares no cerebelo em desenvolvimento de camundongo.
- Marcação esparsa de CGNs para análise morfológica clara.
- Microscopia confocal com imagens em Z-stack para reconstrução tridimensional.
- Rastreamento manual e quantificação do comprimento dos neuritos e das estruturas das garras dendríticas utilizando Fiji e Simple Neurite Tracer.
Resultados Principais
- As imagens de projeção de 3 a 14 dias após a injeção (DAI) revelaram uma diminuição progressiva no número de dendritos por NCG.
- Entre 3 e 7 DAI, os NCGs passaram por poda dendrítica, eliminando mais de 50% dos dendritos em excesso.
- Estruturas semelhantes a garras se formaram nas extremidades dos dendritos remanescentes, com garras presentes em aproximadamente 75% dos dendritos no 7º DAI.
- O tamanho dos NCGs permaneceu amplamente constante, embora uma redução significativa de 20% no volume tenha sido observada no 7º DAI em comparação com os demais pontos temporais.
Conclusões
- O protocolo permite uma análise detalhada e específica por célula do desenvolvimento morfológico dos CGNs in vivo.
- A poda dendrítica e a formação das garras são processos simultâneos durante a maturação dos CGNs.
- O método é adaptável para manipulação genética, a fim de estudar a função gênica no desenvolvimento dos CGNs.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise quantitativa in vivo da morfologia de neurônios granulares cerebelares (CGN) e do desenvolvimento de sinapses atende a uma necessidade crítica de confiança preditiva na validação de alvos neurodesenvolvimentais. A possibilidade de marcação esparsa e de manipulação genética permite a redução de riscos mecanicistas nos estágios iniciais da descoberta do SNC. Esta abordagem sustenta a continuidade translacional ao associar a morfogênese celular à integração sináptica, orientando decisões em portfólios de P&D com foco em neurobiologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da função gênica na morfogênese e sinaptogênese de CGN.
- Apóia a redução de riscos mecanicistas ao isolar efeitos autônomos celulares in vivo.
- Fornece leituras quantitativas para validação de alvos orientada por hipóteses.
- Facilita a triagem de alvos neurodesenvolvimentais com base em fenótipos morfológicos e sinápticos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece fluxos de trabalho validados e reprodutíveis de imagem e análise para a morfologia neuronal.
- Fornece métricas quantitativas, como número de dendritos, formação de garras e comprimento dos neuritos, para triagem subsequente.
- Permite a padronização de ensaios por meio de análise morfométrica assistida por software e com ocultação de identificação.
- Prepara sistemas biológicos robustos para triagem de compostos ou genética em pipelines do SNC.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha fenótipos morfológicos com o desenvolvimento sináptico relevante para doenças em modelos de roedores.
- Apoia a continuidade desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica de intervenções neurodesenvolvimentais.
- Oferece uma plataforma para avaliar biomarcadores translacionais de maturação sináptica.
- Reduz riscos no avanço ao vincular alterações celulares a desfechos sinápticos funcionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos líderes na pesquisa do sistema nervoso central, permitindo testes iterativos de hipóteses e fenotipagem quantitativa de intervenções genéticas ou farmacológicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipótese nula para função gênica na morfogênese neuronal e formação de sinapses.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas reprodutíveis para análise da estrutura dendrítica e sináptica.
- Análises: Oferece medição assistida por software e em condições cegas do comprimento de neuritos, garras dendríticas e volume celular.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos celulares ao desenvolvimento sináptico relevante para doenças in vivo.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a diversas manipulações genéticas e sistemas modelo do SNC em diferentes programas de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos neurodesenvolvimentais e na redução de riscos mecanicistas.
- Valor Operacional: Padroniza a imagem in vivo e a análise morfométrica para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao associar perturbação gênica a fenótipos neuronais quantificáveis.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos do SNC com base em dados robustos in vivo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em neuroanatomia de roedores e técnicas precisas de injeção estereotáxica.
- Exige acesso à microscopia confocal e software avançado de análise de imagens (por exemplo, Fiji, Simple Neurite Tracer).
- Necessita padronização entre equipes para análise cega e interpretação de dados.
- Adaptável a diversas construções genéticas (shRNA, siRNA, Cre Recombinase) para estudos autônomos celulares.
- A precisão da injeção e a eficiência da marcação celular são fundamentais para resultados reprodutíveis.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
