Name: Modelagem de AVC em Camundongos: Oclusão da Artéria Cerebral Média Transitória através da Artéria Carótida Externa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a modelagem de AVC em camundongos por oclusão transitória da artéria cerebral média usando técnica de filamento intraluminal. Este protocolo padronizado permite reperfusão completa e análise funcional reprodutível em pesquisa de acidente vascular cerebral.

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Agradecemos a todos os nossos parceiros de colaboração do ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, das células imunes à recuperação do AVC) por sugestões e discussões. Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha no âmbito do Cluster de Munique para Neurologia de Sistemas (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) e sob as bolsas LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.1.

Os experimentos relatados neste vídeo foram realizados seguindo as diretrizes nacionais para o uso de animais experimentais, e os protocolos foram aprovados pelos comitês governamentais alemães (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Camundongos C57Bl/6J machos de dez semanas de idade foram usados e abrigados sob temperatura controlada (22 ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água.
1. Preparação do material e instrumentos
<ol><li>Conecte a manta de calor para manter a temperatura da área de operação e a temperatura corporal do rato durante a anestesia a 37 °C.</li>
	<li>Tesoura autoclave e fórceps, prepare 70% de solução de etanol e mantenha disponível pomada de olhos dexpanthenol, vários pedaços de algodão, e 5-0 sutura de poliéster trançado revestido pronto para uso. Prepare uma seringa de 1 mL com solução salina de 0,9% (sem agulha) para manter o local de incisão do animal hidratado. Prepare o gás anestesia (100% O2 + isoflurane).</li>
	<li>Prepare um suporte para a sonda Doppler laser cortando a ponta de uma ponta de tubulação de 10 μL (comprimento de 3-5 mm). NOTA: Todos os instrumentos são esterilizados usando um esterilizador de contas quentes. As superfícies também são desinfetadas antes e depois da cirurgia com um spray desinfetante microbiano. Antes da cirurgia, as áreas ao redor da cabeça e peito de camundongos são desinfetadas com um spray de desinfecção de feridas.</li>
</ol>2. Preparação do laser Doppler
<ol><li>Injete analgesia no camundongo 30 min antes da cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina, intraperitoneally).</li>
	<li>Anestesiar o rato colocando-o na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% até a cessação do movimento espontâneo do corpo e vibrissae.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma posição propensa na área de operação com o nariz na máscara de anestesia. Mantenha a concentração de isoflurane em 4% por mais um minuto, depois reduza-a e mantenha-a em 2%.</li>
	<li>Defina a almofada de aquecimento controlada pelo feedback associado para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C e insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos.</li>
	<li>Aplique pomada dexpanthenol nos dois olhos.</li>
	<li>Desinfete a pele e o cabelo ao redor do olho esquerdo e orelha com 70% de etanol.</li>
	<li>Corte o couro cabeludo entre a orelha esquerda e o olho (1 cm de comprimento) para expor o osso do crânio.</li>
	<li>Corte e retire o músculo temporal para visualizar o MCA sob o crânio.</li>
	<li>Fixar com cola a parte externa da ponta segurando a sonda/fibra do Doppler laser em cima da MCA esquerda com cola. Em seguida, cole a pele para fechar a ferida ao redor do suporte da ponta. Aplique 2-3 gotas de cola endurecedora para acelerar o processo. Certifique-se de que a fibra do doppler laser não está colada e pode ser facilmente removida do suporte da ponta a qualquer momento.</li>
</ol>3. Modelo de MCAo transitório (oclusão)
<ol><li>Transforme o mouse na posição supina. Coloque o focinho no cone de anestesia e conserte as patas com fita adesiva.</li>
	<li>Desinfete a pele e o cabelo ao redor do peito e faça uma incisão midline de 2 cm de comprimento no pescoço.</li>
	<li>Use fórceps para puxar a pele e as glândulas submandibulares separadas. Use retráteis para segurar o músculo estemastoide, exponha o campo cirúrgico e encontre a artéria carótida comum esquerda (CCA). Disseque a CCA livre de tecido conjuntivo e nervos circundantes (sem prejudicar o nervo vagal) e realize uma ligadura transitória antes da bifurcação.</li>
	<li>Disseque a artéria carótida externa (ECA) e amarre um nó permanente na parte visível mais distal. Coloque outra sutura sob o ECA, perto da bifurcação, e prepare um nó solto para ser usado posteriormente.</li>
	<li>Disseca a artéria carótida interna (ICA) e coloque um clipe microvascular sobre ele, 5 mm sobre a bifurcação. Certifique-se de não danificar o nervo vagal.</li>
	<li>Corte um pequeno buraco no ECA entre as ligaduras apertadas e soltas; tenha cuidado para não cortar todo o ECA.</li>
	<li>Introduza o filamento e avance-o em direção à CCA. Aperte a ligadura solta no ECA ao redor do lúmen para fixar em breve o filamento nessa posição e evitar sangramento ao remover o clipe microvascular.</li>
	<li>Remova o clipe microvascular e insira o filamento através do ICA até que a origem do MCA seja atingida pela detecção de uma redução acentuada (>80%) no fluxo sanguíneo cerebral medido pelo laser Doppler. Fixar o filamento nesta posição apertando ainda mais o nó em torno do TCE. NOTA: Quando o filamento vai em direção adequada, ele avança suavemente, e nenhuma resistência deve ser observada.</li>
	<li>Registo do doppler laser antes e depois da inserção do filamento.</li>
	<li>Remova o retrátil e realoque o músculo estemastoide e as glândulas submandibulares antes de suturar a ferida. Remova a sonda Doppler laser e coloque o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C por 1 h (até a remoção do filamento).</li>
</ol>4. Modelo de MCAo transitório (Reperfusion)
<ol><li>Anestesiar o rato colocando-o na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% até a cessação do movimento espontâneo do corpo e vibrissae.</li>
	<li>Aplique pomada dexpanthenol nos dois olhos.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma posição propensa na área de operação com seu focinho na máscara de anestesia. Mantenha a concentração de isoflurane em 4% por mais um minuto, depois reduza-a e mantenha-a em 2%. Conserte as patas do animal com fita adesiva.</li>
	<li>Insira a sonda Doppler laser no suporte da sonda.</li>
	<li>Remova a sutura da ferida, use fórceps para puxar a pele e as glândulas submandibulares separadas. Use retráteis para puxar suavemente o músculo estemastoide e expor o campo cirúrgico.</li>
	<li>Solte a sutura ECA que aperta o filamento e puxe suavemente o filamento. Evite danificar o revestimento de borracha de silicone do filamento durante a remoção.</li>
	<li>Amarre firmemente a sutura do ECA.</li>
	<li>Confirme o aumento do fluxo sanguíneo cerebral no dispositivo Doppler laser (>80% do valor inicial antes da reperfusão).</li>
	<li>Registos do doppler laser antes e depois da remoção do filamento.</li>
	<li>Abra a ligadura transitória antes da bifurcação da CCA.</li>
	<li>Remova o retrátil e realoque o músculo estemastoide e as glândulas submandibulares antes de suturar a ferida. Coloque o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C por 1h para se recuperar da anestesia.</li>
	<li>Após a recuperação, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.</li>
	<li>Cuide dos animais adicionando pelotas de comida molhada e hidrogel em pequenas placas de Petri no chão da gaiola até o dia 3 após a cirurgia.</li>
	<li>Injete analgesia a cada 12 h para 3 d após a cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).</li>
</ol>5. Operação Sham
<ol><li>Realizar todos os procedimentos conforme descrito acima, incluindo a ligadura das artérias e a introdução do filamento (etapas 1-3.7).</li>
	<li>Remova o filamento imediatamente após sua inserção. Em seguida, coloque o animal na câmara de recuperação por 1h.</li>
	<li>Coloque o animal na área de operação novamente, e remova a ligadura transitória da CCA para garantir a restauração completa do fluxo sanguíneo cerebral.</li>
	<li>Suturar a ferida e colocar o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C por 1h para se recuperar da anestesia. Após a recuperação, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.</li>
	<li>Cuide dos animais adicionando pelotas de comida molhada e hidrogel em pequenas placas de Petri no chão da gaiola até o dia 3 após a cirurgia.</li>
	<li>Injete analgesia a cada 12 h para 3 d após a cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).</li>
</ol>6. Neuroscore
<ol><li>Realize o Neuroscore sempre na mesma hora do dia, e use roupas cirúrgicas para manter um "cheiro neutro" entre cirurgiões individuais.</li>
	<li>Deixe os ratos descansarem por 30 minutos na sala com uma gaiola "aberta" antes do teste.</li>
	<li>Observe cada item na Tabela 1 e Tabela 2 para 30 s.</li>
</ol>7. Perfusão de Intracardiac
<ol><li>Prepare uma seringa de 20 mL contendo soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS)-heparina (2 U/mL) e coloque-a 1 m acima do banco para facilitar a perfusão movida pela gravidade. (OPCIONAL: Realizar perfusão intracardiac com 4% de paraformaldeído (PFA) utilizando uma seringa de 20 mL contendo 4% de PFA em PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Injete intrperitoneally 100 μL de cetamina e xilazina (120 e 16 mg/kg de peso corporal, respectivamente). Espere 5 min e confirme a cessação do movimento espontâneo do corpo e da vibrissae.</li>
	<li>Fixar o animal em uma posição supina, e desinfetar a superfície abdominal do corpo com 70% de etanol.</li>
	<li>Faça uma incisão de 3 cm de comprimento no abdômen; corte o diafragma, as costelas e o esterno para visualizar completamente o coração.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão no átrio direito e insira a cânula de perfusão no ventrículo esquerdo.</li>
	<li>Perfuse com 20 mL de PBS-heparin.</li>
	<li>Após a perfusão, decapite o animal e remova o cérebro.</li>
	<li>Congele o cérebro em gelo seco em pó e armazene a -80 °C até que use mais.</li>
</ol>8. Volumetria infarto
<ol><li>Para criocessão, use um criostat para cortar o cérebro em seções de 20 μm de espessura a cada 400 μm. Coloque as seções em slides e armazene os slides a −80 °C até usar.</li>
	<li>Mancha de cresyl violeta (CV)<ol>
<li>Prepare a solução de coloração mexendo e aquecendo (60 °C) 0,5 g de acetato cv em 500 mL de H2O até que os cristais sejam dissolvidos. Depois que a solução esfriar, armazene-a em uma garrafa escura. Reaqueça a 60 °C e filtre antes de cada uso.</li>
		<li>Deixe os slides secarem à temperatura ambiente por 30 minutos. Mergulhe-os em 95% de etanol por 15 min, em 70% de etanol por 1 min, e depois em 50% de etanol por 1 min.</li>
		<li>Mergulhe os slides em água destilada por 2 minutos; refrescar a água destilada e colocar os slides na água por 1 min. Depois, mergulhe os slides na solução de coloração pré-aquecida por 10 min a 60 °C. Lave as lâminas duas vezes em água destilada por 1 min.</li>
		<li>Mergulhe os slides em 95% de etanol por 2 min. Coloque-os em 100% etanol por 5 min; refrescar o etanol 100% e colocar os slides novamente no etanol por 2 min. Depois, cubra os slides com um meio de montagem.</li>
		<li>Análise (Figura 4C)<ol>
<li>Escaneie os slides e analise o volume indireto de infarto pelo método Swanson12 para corrigir o edema usando a seguinte equação: (Área isquêmica) = (região isquêmica)-((hemisfério ipsilateral)-(hemisfério contralateral))</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).</li>
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</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes para divulgar.

O presente protocolo descreve um modelo experimental de avc baseado no acordo de consenso de um consórcio alemão de pesquisa multicêntrico ("ImmunoStroke") para estabelecer um modelo de MCAo transitório padronizado. O modelo transitório de MCAo estabelecido pela introdução de um filamento revestido de silício através do ECA até a origem do MCA é um dos modelos de traçado mais utilizados para alcançar a reperfusão arterial após um período de oclusão delimitado. Portanto, este procedimento pode ser considerado um modelo de...

O AVC é uma das causas mais comuns de morte e incapacidade em todo o mundo. Embora existam principalmente duas formas distintas de derrame, isquêmicas e hemorrágicas, 80-85% de todos os casos de acidente vascular cerebral são isquêmicos1. Atualmente, apenas dois tratamentos estão disponíveis para pacientes com AVC isquêmico: tratamento farmacológico com ativador de plasmininogen de tecido recombinante (rtPA) ou trombio mecânica. No entanto, devido à estreita janela de tempo terapêutico e aos critérios de exclusão múltipla, apenas um número seleto de pacientes pode se beneficiar dessas opções específicas de tratamento. Nas últimas duas décadas, a pesquisa de AVC pré-clínico e translacional se concentrou no estudo de abordagens neuroprotetoras. No entanto, todos os compostos que atingiram os ensaios clínicos não apresentaram até agora melhorias para o paciente2.
Uma vez que os modelos in vitro não podem reproduzir com precisão todas as interações cerebrais e mecanismos fisiodicos do AVC, modelos animais são cruciais para a pesquisa de derrame pré-clínico. No entanto, imitar todos os aspectos do AVC isquêmico humano em um único modelo animal não é viável, pois o AVC isquêmico é uma doença altamente complexa e heterogênea. Por essa razão, diferentes modelos de avc isquêmico foram desenvolvidos ao longo do tempo em diferentes espécies. Fototrombose de arteriolas cerebrais ou oclusão distal permanente da artéria cerebral média (MCA) são modelos comumente utilizados que induzem lesões pequenas e localmente definidas no neocórtex3,4. Além desses, o modelo de traçado mais usado é provavelmente o chamado "modelo de filamento", no qual uma oclusão transitória de MCA é alcançada. Este modelo consiste em uma introdução transitória de um filamento de sutura à origem da AMC, levando a uma redução abrupta do fluxo sanguíneo cerebral e ao subsequente grande infarto das regiões cerebrais subcorticas e corticas5. Embora a maioria dos modelos de traçado imite oclusões MCA 6,o "modelo de filamento" permite a delimitação precisa do tempo isquêmico. A reperfusão por remoção de filamentos imita o cenário clínico humano de restauração do fluxo sanguíneo cerebral após espontâneo ou terapêutico (rtPA ou trombectomia mecânica) de lise de coágulos. Até o momento, foram descritas diferentes modificações deste "modelo de filamento". Na abordagem mais comum, descrita pela primeira vez por Longa et al. em 19895, um filamento revestido de silício é introduzido através da artéria carótida comum (CCA) à origem da MCA7. Embora seja uma abordagem amplamente utilizada, este modelo não permite a restauração completa do fluxo sanguíneo durante a reperfusão, uma vez que a CCA é permanentemente ligada após a remoção do filamento.
Na última década, um número crescente de grupos de pesquisa tem se interessado em modelar o avc em camundongos usando este "modelo de filamento". No entanto, a considerável variabilidade desse modelo e a falta de padronização dos procedimentos são algumas das razões para a alta variabilidade e baixa reprodutibilidade dos resultados experimentais e achados científicos relatados até agora2,8. Uma causa potencial da atual "crise de replicação", referindo-se à baixa reprodutibilidade entre os laboratórios de pesquisa, são os volumes infartos não comparáveis entre grupos de pesquisa utilizando a mesma metodologia experimental9. De fato, após a realização do primeiro estudo de ensaio multicêntrico controlado randomizadopré-clínico 10,pudemos confirmar que a falta de padronização suficiente deste modelo experimental de AVC e os parâmetros de desfecho subsequentes foram as principais razões para a falha da reprodutibilidade em estudos pré-clínicos entre laboratórios independentes11 . Essas diferenças drásticas nos tamanhos de infarto resultantes, apesar de usarem o mesmo modelo de AVC, representam justificadamente não apenas uma ameaça à pesquisa confirmatória, mas também às colaborações científicas devido à falta de modelos robustos e reprodutíveis.
Diante desses desafios, buscamos desenvolver e descrever detalhadamente o procedimento para um modelo de MCAo transitório padronizado como utilizado para os esforços de pesquisa colaborativa dentro do consórcio de pesquisa "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). Este consórcio tem como objetivo entender as interações cérebro-imunes subjacentes aos princípios mecanicistas da recuperação do AVC. Além disso, são apresentados métodos funcionais histológicos e relacionados para análise de desfechos de acidente vascular cerebral. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão estabelecidos utilizados em todos os laboratórios de pesquisa do consórcio ImmunoStroke.

<table><tbody><tr><td>45&deg; rampa</td><td>H& S Kunststofftechnik</td><td></td><td>altura: 18 cm</td></tr><tr><td>5/0 ameaça</td><td>Pearsalls</td><td>10C103000</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma Ciências da Vida</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia para isoflurano</td><td>Drager</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen pomada</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J camundongos</td><td>Charles Braçadeira de</td><td>000664</td><td></td>River</tr><tr><td></td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Clipe</td><td>FST</td><td>18055-04</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de clipe</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Cotons</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Filamentos</td><td>Doccol</td><td>602112PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>Pinça angular fina</td><td>45 FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>FST</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Cola</td><td>Orechseln</td><td>BSI-112</td><td></td></tr><tr><td>Endurecedor Cola</td><td>Drechseln & Mehr</td><td>BSI-151</td><td></td></tr><tr><td>Manta de aquecimento</td><td>FHC DC Controlador</td><td></td><td></td>de temperatura</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Doppler</td><td>Perimed</td><td>PF 5010 LDPM, Sistema de Perifluxo 5000</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Laser Doppler</td><td>Perimed</td><td>91-00123</td><td></td></tr><tr><td>Tamponamento de fosfato pH salino: 7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni München</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de recuperação</td><td>Mediheat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit meio de montagem</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Feather</td><td>02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Filamentos revestidos de silicone</td><td>Doccol</td><td>602112PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Xylacine</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelagem de avc em camundongos: oclusão da artéria cerebral média transitória através da artéria carótida externa

Modeling Stroke in Mice: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion via the External Carotid Artery

O AVC é a terceira causa mais comum de mortalidade e a principal causa de incapacidade adulta adquirida nos países desenvolvidos. Até o momento, as opções terapêuticas são limitadas a uma pequena proporção de pacientes com AVC nas primeiras horas após o AVC. Novas estratégias terapêuticas estão sendo amplamente investigadas, especialmente para prolongar a janela de tempo terapêutico. Essas investigações atuais incluem o estudo de importantes vias fisiodicosiológicas após o AVC, como inflamação pós-acidente vascular cerebral, angiogênese, plasticidade neuronal e regeneração. Na última década, tem havido uma preocupação crescente com a baixa reprodutibilidade dos resultados experimentais e os achados científicos entre grupos de pesquisa independentes. Para superar a chamada "crise de replicação", são urgentemente necessários modelos padronizados detalhados para todos os procedimentos. Como um esforço dentro do consórcio de pesquisa "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/), propõe-se um modelo padronizado de camundongos de oclusão de artéria cerebral média transitória (MCAo). Este modelo permite a restauração completa do fluxo sanguíneo após a remoção do filamento, simulando a lise de coágulos terapêutico ou espontâneo que ocorre em grande proporção de derrames humanos. O procedimento cirúrgico deste modelo de avc "filamento" e ferramentas para sua análise funcional são demonstrados no vídeo que acompanha.

O modelo descrito aqui é uma modificação do modelo de traçado de "filamento" comumente utilizado, que consiste em introduzir um filamento revestido de silício através do ECA para bloquear transitoriamente a origem da MCA (Figura 1). Após a remoção do filamento, apenas o fluxo sanguíneo no TCE é permanentemente cessado, permitindo a recanalização completa do CCA e do ICA. Isso permite uma reperfusão adequada do cérebro (Figura 2), semelhante à situação observada ...

Diferentes modelos de oclusão da artéria cerebral média (MCAo) são usados em pesquisas experimentais de derrame. Aqui, é descrito um modelo experimental de AVC de MCAo transitório através da artéria carótida externa (ECA), que visa imitar o AVC humano, no qual o trombo cerebrovascular é removido devido à lise espontânea de coágulo ou terapia.

Modelagem de AVC em Camundongos: Oclusão da Artéria Cerebral Média Transitória através da Artéria Carótida Externa

Stroke is the third most common cause of mortality and the leading cause of acquired adult disability in developed countries. To date, therapeutic options ...

No modelo de filamento descrito aqui, a restauração completa do fluxo sanguíneo e seu registro, são requisitos para garantir um influxo produtível entre camundongos, especialmente em estudos de derrame translacional. Este modelo tem duas principais vantagens em comparação com outros modelos de traçado descritos anteriormente. Não é necessária craniotomia, e uma re-perfusão completa do vaso sanguíneo é alcançada.O modelo de filamento é uma intervenção cirúrgica complexa envolvendo a manipulação de processos de diferentes artérias. A visualização e explicação de tudo isso são pequenos, mas importantes passos, pode acelerar o período de aprendizagem dos neurocirurgiões. Conecte a manta de calor para manter a temperatura da área de operação e a temperatura corporal do rato durante a anestesia a 37 graus Celsius.Prepare tesouras e fórceps autoclave, solução de 70% etanol e pomada para o olho dexpanthenol, e mantenha vários pedaços de algodão e sutura de poliéster trançado Cinco O, pronto para usar. Prepare uma solução salina de 0,9% em uma seringa de um mililitro sem agulha para manter o local de incisão hidratado. Prepare um suporte para a sonda Doppler laser cortando a ponta de uma ponta de pipeta de 10 microliter.Uma vez que o mouse esteja completamente anestesiado, coloque-o em uma posição propensa na área de operação. Insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos. Depois de desinfetar o local cirúrgico, corte este couro cabeludo entre a orelha esquerda e o olho para expor o osso do crânio.Em seguida, corte e retire o músculo temporal para visualizar as múltiplas artérias cerebrais ou MCA sob o crânio. Fixar a parte externa da ponta segurando a sonda Doppler laser ou fibra em cima do MCA esquerdo com cola e feche a pele para que a pele também esteja colada. Aplique de duas a três gotas de cola endurecedora para acelerar o processo.Certifique-se de que a fibra do doppler laser não está colada e pode ser facilmente removida do suporte da ponta a qualquer momento. Vire o mouse para a posição supina, em seguida, coloque o focinho no cone de anestesia e fixar as patas com fita. Desinfete a pele e o cabelo ao redor do peito e faça uma incisão média de dois centímetros de comprimento no pescoço.Use fórceps para puxar a glândula submandibular da pele e o músculo estemastoide separados. Use retráteis para expor o campo cirúrgico e encontre a artéria carótida comum esquerda ou CCA. Disseque a CCA livre de tecido conjuntivo e nervos circundantes sem prejudicar o nervo vagal e realize uma ligadura transitória antes da bifurcação.Disseque a artéria carótida externa ou ECA e amarre um nó permanente na parte visível mais distal. Coloque outra sutura sob o ECA e perto da bifurcação, em seguida, prepare um nó solto para ser usado mais tarde. Disseca a artéria carótida interna ou ICA e coloque um clipe microvascular sobre ele cerca de cinco milímetros sobre a bifurcação.Certifique-se de não danificar o nervo vagal. Em seguida, corte um pequeno furo no ECA entre as ligaduras apertadas e soltas, garantindo não cortar todo o ECA. Introduza o filamento e avance-o em direção à CCA.Aperte a ligadura solta no ECA em torno do lúmen para fixar momentaneamente o filamento nessa posição. Removendo o clipe microvascular e evitar sangramento. Após a remoção do clipe microvascular, insira o filamento através do ICA até que a origem do MCA seja atingida.Fixar o filamento nesta posição apertando ainda mais o nó em torno do TCE. Registo do doppler laser antes e depois da inserção do filamento. Remova o retrátil e realoque o músculo estemastoide na glândula submandibular antes de suturar a ferida.Remova a sonda Doppler laser e coloque o animal em uma câmara de recuperação a 37 graus Celsius durante uma hora. Coloque o mouse em uma posição propensa na área de operação com seu focinho na máscara de anestesia e, em seguida, conserte as patas do animal com fita adesiva. Insira a sonda Doppler laser no suporte da sonda.Remova a sutura da ferida e use fórceps para puxar a pele, a glândula submandibular e o músculo estemastoide separados. Use retráteis para expor o campo cirúrgico. Solte a sutura ECA que aperta o filamento e puxe suavemente o filamento.Evite danificar o revestimento de borracha de silicone do filamento durante a remoção. Regisso laser Doppler valores antes e depois da remoção do filamento. Amarre firmemente a sutura do ECA e confirme o aumento do fluxo sanguíneo cerebral no dispositivo Laser Doppler.Abra a ligadura transitória antes da bifurcação da CCA para restaurar o fluxo sanguíneo completo. Remova o retrátil e realoque o músculo estemastoide na glândula submandibular antes de suturar a ferida. Em seguida, coloque o animal em uma câmara de recuperação a 37 graus Celsius por uma hora para se recuperar da anestesia.Após a recuperação, os ratos retornem suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura e cuidem dos animais adicionando pelotas de alimentos molhados e hidrogel em pequenas placas de Petri no chão da gaiola e injetem analgesia a cada 12 horas até o terceiro dia após a cirurgia. Uma vez que o fluxo sanguíneo na CCA é restaurado após a remoção do filamento, ocorre a re-perfusão completa do cérebro, o que é semelhante à situação observada após o sucesso da trombectomia mecânica em pacientes humanos. Os animais de AVC apresentaram uma mudança significativa no escore neuro composto e focal, mas não no escore neuro geral quando comparados com animais falsos.O volume de infarto recuperado também foi realizado usando manchas de cresol violeta de seções cerebrais coronárias 24 horas após a indução do derrame. A área da lesão inclui o somatosensorial e córtex motor, bem como estruturas sub-corticais, como o estriado. A média de volume de infarto foi de 61 a 62 milímetros quadrados, representando 48% do hemisfério cerebral efetivado.É importante realizar uma dissecção adequada do CCA, TCE e RCA sem causar danos ao tecido adjacente, especialmente o nervo vago, para ter uma boa visualização de todas as estruturas, e ser capaz de inserir o filamento e ocluir a origem do MCA.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Filamentosas de oclusão da artéria cerebral média é um modelo comum para o estudo de AVC isquêmico em ratos.

Curso de modelagem em Ratos - Oclusão da Artéria Cerebral Média com o modelo de Filamento

Demonstramos no vídeo um método para produzir uma oclusão da artéria cerebral média em ratos adultos utilizando um monofilamento intraluminal. Também mostramos como avaliar a extensão do infarto cerebral por 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto de coloração (TTC).

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

O intraluminal cerebral média de oclusão da artéria modelo (MCAO) é o modelo mais freqüente dentre os modelos experimentais acidente vascular cerebral isquêmico. Aqui vamos demonstrar todo o modelo em detalhes com o guia de Laser Doppler fluxometria, e os resultados do seu representante.

Intraluminal artéria cerebral média Oclusão Model (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com Laser Doppler Fluxometria Orientação em Ratos

O modelo de oclusão intraluminal cerebral média em ratinhos é aqui apresentada. A extensão do enfarte cerebral é avaliada por uma pontuação neurológica e coloração com violeta de cresilo, a coloração de uma alternativa ao TTC, que oferece a grande vantagem de testar em paralelo marcadores de interesse muitos.

Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

Este vídeo descreve o procedimento para desenvolver AVC transitório em um modelo murino usando oclusão baseada em filamento revestido de silicone da artéria cerebral média. O modelo desenvolvido imita o AVC humano, ajudando assim a investigar novas estratégias terapêuticas para o tratamento do AVC.

Modelo de AVC Transitório Baseado em Inserção de Filamento: Um Procedimento Cirúrgico para Realizar a Oclusão da Artéria Cerebral Média no Cérebro Murino

Vários modelos murinos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) são amplamente utilizados em pesquisas sobre o cérebro experimental. Aqui, demonstramos o modelo de transcraniana permanente distal MCAO que produz enfarte cortical consistente de um tamanho correspondente ao dano imposto pela maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos humanos.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Oclusão de filamento intraluminal da artéria cerebral média é o modelo mais frequentemente utilizadas na vivo do acidente vascular cerebral experimental em roedores. Uma abordagem alternativa cirúrgica para permitir a reparação de artéria carótida comum é realizada aqui, que permite a reperfusão da artéria carótida comum e uma reperfusão completa no território da artéria cerebral média.

Oclusão de artéria Cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos

Este protocolo demonstra um modelo único de acidente vascular cerebral em camundongo com um infarto de tamanho médio e uma excelente taxa de sobrevida. Esse modelo permite que os pesquisadores pré-clínicos do AVC estendam a duração da isquemia, usem camundongos envelhecidos e avaliem os resultados funcionais a longo prazo.

Modelo de Oclusão Transcraniana da Artéria Cerebral Média Modificada para Estudo de Resultados de Acidente Vascular Cerebral em Camundongos Idosos

Este protocolo descreve o modelo de isquemia cerebral focal transitória em camundongos através da oclusão intraluminal da artéria cerebral média. Além disso, exemplos de avaliação de resultados são mostrados usando ressonância magnética e testes comportamentais.

Modelo de Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média do Acidente Vascular Encefálico

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de oclusão da artéria cerebral média distal (dMCAO) por meio de eletrocoagulação transcraniana em camundongos C57BL/6J e avaliar o comportamento neurológico subsequente e as características histopatológicas.

Indução de AVC Isquêmico Agudo em Camundongos Usando a Técnica de Oclusão Distal da Artéria Média

O protocolo atual descreve um modelo de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média em ratos que preserva a estrutura anatômica dos vasos cerebrais sem causar danos.

Um modelo de rato de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média sem danificar a estrutura anatômica dos vasos cerebrais

Aprenda a modelagem de AVC em camundongos por oclusão transitória da artéria cerebral média usando técnica de filamento intraluminal. Este protocolo padronizado permite reperfusão completa e análise funcional reprodutível em pesquisa de acidente vascular cerebral.

Modelagem de AVC em Camundongos: Oclusão da Artéria Cerebral Média Transitória através da Artéria Carótida Externa

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