Name: Detecção de Agregação de Proteínas usando Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Aprenda a detectar agregação de proteínas usando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) em lisados e células vivas. Este método analisa proteínas associadas à ELA, como TDP25 e SOD1 mutante.

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A.K. foi apoiada por uma Sociedade Japonesa de Promoção da Ciência (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), por uma subvenção da Fundação Nakatani para Contramedidas contra novas infecções por coronavírus, por uma bolsa do Escritório da Universidade de Hokkaido para o Desenvolvimento de Futuros Líderes de Pesquisa (L-Station), e uma subvenção da Fundação Hoansha. M. K. foi parcialmente apoiado por um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686), e um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).

1. Materiais e reagentes
<ol><li>Use soluções livres pirogênicas e médias para cultura celular(Tabela 1).</li>
	<li>Prepare soluções para o experimento bioquímico usando água ultrauso e use como DNase/RNase livre.</li>
	<li>Selecione um FBS apropriado para a cultura celular com um processo de verificação de lotes. Uma vez que o lote selecionado da FBS muda regularmente, o catálogo e o número do lote para FBS não podem ser representados aqui.</li>
	<li>DNA plasmídeo<ol>
<li>Prepare pmeGFP-N15 para expressão monômero eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 para expressão GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 para expressão SOD1-G85R-GFP; e pCAGGS8 como portador. NOTA: meGFP é uma variante monomérica que carrega mutação A206K de GFP aprimorado (eGFP). TDP25 é um fragmento terminal C associado à ALS do TDP-43. SOD1-G85R é um mutante associado à ALS do SOD1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tensão celular<ol>
<li>Use células de neuroblastoma de murina Neuro2a. NOTA: As células Neuro2a têm alta eficiência de transfecção e proteínas exógenas altamente expressas. Para a expressão TDP25, são necessárias cepas de células com alta eficiência de expressão, como células Neuro2a ou HEK293. Nas células HeLa, o TDP25 não foi capaz de ser expresso eficientemente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultura celular e transfecção
<ol><li>Prepare um prato plástico de 100 mm cultivando células Neuro2a semi-confluentemente em meio de crescimento normal. NOTA: É necessário incubar a 37 °C por aproximadamente 48-72 horas após a semeadura anterior até que a semi-confluência seja atingida.</li>
	<li>Remova o meio.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de solução trypsin-EDTA no prato de cultura celular e incuba-os a 37 °C por 1 min.</li>
	<li>Adicione 9,5 mL de meio de crescimento normal no prato e suspenda as células separadas.</li>
	<li>Usando o azul Trypan para manchar as células mortas, conte o número de células usando um contador de células ou manualmente. Em seguida, diluir as células em meio de cultura (1,0 × 105/mL).</li>
	<li>Adicione 2 mL de suspensão celular em uma antena plástica de 35 mm para lise celular ou uma antena de base de vidro para medição de células vivas.</li>
	<li>Incubar o prato a 37 °C durante 1 dia.</li>
	<li>Comece os preparativos a seguir 15 minutos antes do dia da transfecção.</li>
	<li>Prepare dois tubos de 1,5 mL e adicione 100 μL de Opti-MEM I a cada tubo.</li>
	<li>No primeiro tubo, misture 1,0 μg de DNA plasmídeo (Solução A). No segundo tubo, misture 2,5 μL de Lipofectamina 2000 (Solução B). NOTA: Para manter a eficiência da transfecção, mantenha a quantidade total de DNA a mesma. Para reduzir o nível de expressão para medição de FCS em células vivas, a quantidade fracionária de DNA plasmídeo para expressão proteica deve diminuir (por exemplo, 0,2 μg de pmeGFP-N1-SOD1-G85R e 0,8 μg de mistura pCAGGS). Além disso, mantenha a mesma razão entre o volume de Lipofectamina 2000 e a quantidade de DNA plasmídeo.</li>
	<li>Misture suavemente a Solução A e a B adicionando um em cada tubo e, em seguida, incuba-o por 1 min à temperatura ambiente (Solução C).</li>
	<li>Adicione a solução C ao meio de cultura; e incubar as células por 24 h a 37 °C.</li>
</ol>3. Lise celular e troca média
<ol><li>Verifique a expressão GFP usando um microscópio de rotina.</li>
	<li>Retire o meio no prato.</li>
	<li>Adicione 2 mL de PBS a 25 °C para lavar o meio. Remova o PBS.</li>
	<li>Coloque o prato em uma placa de alumínio em cima do gelo esmagado. NOTA: Usamos uma placa de alumínio de 1 mm de espessura cortada em uma loja de ferramentas de domingo ou comercialmente disponível como equipamento de laboratório.</li>
	<li>Adicione 200 μL de tampão de lise a 4 °C. Agite o prato levemente para que o tampão seja distribuído uniformemente na parte inferior do prato.</li>
	<li>Raspe o prato usando um raspador de células e recupere o lysate com detritos celulares não resolvidos em um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar a solução a 20.400 x g por 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Recupere o supernante em um novo tubo de 1,5 mL e mantenha-o a 4 °C ou no gelo. NOTA: Não congele o lise.</li>
	<li>Para medições de células vivas, substitua o meio antes da medição. Verifique o acessório da célula usando um microscópio de contraste de fase. Confirme a expressão usando um microscópio de fluorescência.</li>
</ol>4. Calibração da espectroscopia de correlação da fluorescência (FCS)
<ol><li>Inicie o sistema e execute o software de operação. Ligue o Argon+ laser (458/477/488/514 nm). Estabilize o sistema pelo menos por 30 minutos.</li>
	<li>Configurar o caminho óptico: Divisor de feixe principal: HFT488; Espelho dicroico: NFT600; Filtro de barreira de fluorescência: um filtro de passagem de banda 505-540 (BP505-540); Detector: fotodiodo de avalanche (APD)).</li>
	<li>Defina o tamanho do orifício digitando diretamente o valor (66 μm; 1 unidade arejada).</li>
	<li>Adicione a solução Rhodamine 6G (Rh6G) em um poço da câmara de vidro de cobertura no palco.</li>
	<li>Adicione a água ultrauso de imersão no objetivo. Não use o óleo de imersão.</li>
	<li>Coloque a câmara no palco do microscópio. Mova o palco para a posição apropriada.</li>
	<li>Concentre-se na superfície superior do vidro medindo a luz dispersa da superfície do vidro. Depois de baixar a lente objetiva para a parte inferior, gire o botão de foco no sentido horário para ajustar. NOTA: Verifique a direção de giro do botão de foco porque é oposta entre as feitas no Japão e na Alemanha.</li>
	<li>Levante o ponto focal 200 μm acima da superfície superior do vidro para observar o interior da solução.</li>
	<li>Clique na taxa De contagem e monitore a taxa de contagem de fótons.</li>
	<li>Aumente gradualmente o valor do tunable tunable acousto-óptico (AOTF) (por exemplo, transmissão a laser de excitação) de modo que o valor da taxa de contagem seja superior a 10 kHz.</li>
	<li>Clique no Ajuste pinhole e abra o assistente de ajuste do orifício. Encontre a posição do orifício com o maior (pico) de fótons tanto no eixo x quanto no eixo y.</li>
	<li>Gire o anel de correção da lente objetiva para que o valor de contagem por molécula (CPM) seja o mais alto. NOTA: Uma vez que a espessura do vidro de cobertura da câmara especificada aqui é de 0,12-0,17 mm, o anel de correção está em torno de seu mínimo ou apenas algumas voltas a partir dele, onde o CPM está no seu máximo.</li>
	<li>Diminua gradualmente o valor aoTF para que o valor do CPM se torne de 2-3 kHz.</li>
	<li>Adquira a função de correção automática (ACF) do Rh6G por 90 s.</li>
	<li>Uma vez concluída a medição, clique em Encaixar para realizar a análise de encaixe da curva.</li>
	<li>Selecione um modelo para difusão tridimensional (3D) de um componente com um estado trigêmeo. NOTA: O Rh6G é monodisperse e difuso de um componente com um estado trigêmeo.</li>
	<li>Ajuste o tempo de início de montagem movendo a linha vermelha. Clique em encaixar tudo e verifique o desvio de ajuste. Após a realização do encaixe da curva, certifique-se de que o tempo de difusão (DT) e o parâmetro da estrutura (SP) estejam aproximadamente na faixa de 20-30 μs e 4-8, respectivamente.</li>
	<li>Lembre-se do valor do parâmetro estrutural. Use o valor de SP para análise de encaixe de curva de todos os ACFs medidos no mesmo dia, sob as mesmas condições ópticas, e usando o mesmo tipo de prato de base de vidro ou conjunto de vidro de cobertura no estágio do microscópio.</li>
</ol>5. Medição de FCS em lise celular
<ol><li>Prepare os lises celulares (veja acima).</li>
	<li>Coloque o lise na câmara de vidro da tampa. Coloque uma tampa para evitar a secagem e a tampa do palco para sombreamento leve.</li>
	<li>Defina a condição de aquisição, potência laser, tempo de medição e repetições.</li>
	<li>Clique na taxa de contagem e ajuste o valor AOTF do laser para que o valor do CPM se torne superior a 1 kHz.</li>
	<li>Realize uma medição de ensaio por 1 min. Verifique se o ACF calculado mostra uma amplitude positiva e uma decadência suave.</li>
	<li>Realize a medição principal por 5 minutos. NOTA: O tempo total de medição é gradualmente aumentado até que a forma do ACF não mude mesmo que o tempo de medição seja aumentado.</li>
	<li>Clique em Fit para realizar a análise de encaixe da curva.</li>
	<li>Selecione um modelo para difusão 3D de dois componentes com um estado trigêmeo. Lembre-se de digitar o valor de SP e alterar sua configuração para "Fixo" e não "Livre" antes de clicar em Encaixar tudo.</li>
	<li>Exporte a tabela equipada como um arquivo de texto delimitado por guias.</li>
	<li>Se necessário, exporte o registro de taxa ACF e Contagem como um arquivo de texto delimitado por guias.</li>
</ol>6. Medição de FCS em células vivas
<ol><li>Substitua o meio por um novo antes da medição.</li>
	<li>Use uma incubadora de estágio de calor. Coloque o prato de cultura celular no estágio do microscópio.</li>
	<li>Confirme o foco e a posição usando o micrope confocal. Selecione a célula de medição. Amplie e ajuste a posição do celular. Adquira imagens de fluorescência de uma célula expressante por GFP usando o modo de velocidade de varredura lenta.</li>
	<li>Selecione uma posição de medição fcs usando posição na seção "FCS".</li>
	<li>Selecione pelo menos um ponto de medição FCS usando uma mira(Figura 1).</li>
	<li>Meça o ACF por 1 min. NOTA: Como as proteínas fluorescentes tendem a ser fotobleachadas em células vivas devido ao movimento lento em comparação com a solução, o tempo de medição deve ser mínimo. É geralmente difícil obter ACF na célula tão suavemente quanto as medidas de solução, porque a medição prolongada levará à fotoblemação de proteínas fluorescentes.</li>
	<li>Clique em Fit para realizar a análise de encaixe de curva usando um modelo para difusão 3D de dois componentes com um estado trigêmeo. NOTA: Para medições de células vivas, um modelo de difusão 3D de dois componentes com um estado trigêmeo seria melhor porque é empiricamente difícil diminuir o valor qui-quadrado com um modelo de difusão 3D de um componente devido à existência de vários componentes móveis na célula viva. Mas mesmo usando um modelo para difusão 3D de três componentes, os componentes de difusão geralmente não são separados em comparação com o uso do modelo para dois componentes.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).</li>
<li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li>
<li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li>
<li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li>
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<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230(2016).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li>
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<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li>
<li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).</li>
<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

Esses autores não têm conflitos de interesse.

Quanto à calibração do sistema antes das medições, devem ser utilizados os mesmos vidros utilizados para medir a amostra (por exemplo, a câmara de vidro de 8 poços para lise celular e a antena de base de vidro de 35 mm para células vivas). Devido à adsorção de Rh6G no vidro, sua concentração efetiva pode às vezes diminuir. Nesse caso, uma solução Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, deve ser usada apenas para o ajuste do pinhole. Taxas de contagem de fótons extremamente altas devem ser evitadas para proteger o detector...

Agregações proteicas envolvendo distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e assim pordiante 1 são conhecidas por serem tóxicas e perturbariam a homeostase proteico (proteostase) nas células e órgãos, que poderiam então levar ao envelhecimento2. Espera-se o desembaraço da agregação de proteínas como estratégia terapêutica; no entanto, produtos químicos que previnem a formação de agregação de proteínas e degradam agregados proteicos (por exemplo, pequenas moléculas ou drogas) ainda não foram estabelecidos. Além disso, como a agregação de proteínas exerce toxicidade permanece indescritível. Portanto, para promover projetos de pesquisa relacionados à agregação de proteínas, é importante introduzir procedimentos de alto rendimento para simplesmente detectar a agregação de proteínas. A detecção de agregação de proteínas usando anticorpos que reconhecem a conformação da agregação de proteínas e do corante fluorescente específico para agregação tem sido amplamente utilizada3. No entanto, é difícil detectar a agregação, especialmente em células vivas usando tais procedimentos clássicos. 
A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um procedimento para detectar agregação de proteínas e mudanças estruturais. No entanto, o FRET é incapaz de analisar a dinâmica proteica (por exemplo, difusão e oligomerização da proteína em células vivas)3. Por isso, introduzimos aqui um protocolo simples para detectar a agregação de proteínas em solução (por exemplo, lisato celular) e células vivas utilizando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que mede a propriedade de difusão e brilho de moléculas fluorescentes com sensibilidade de molécula única4. FCS é um método de contagem de fótons usando um microscópio confocal de varredura a laser (LSM). Utilizando um detector de fótons altamente sensível e o cálculo da função de autocorrelação (ACF) do tempo de chegada do fóton, a passagem pelo tempo e brilho das moléculas fluorescentes no volume de detecção é medida. A difusão diminui com o aumento do peso molecular; assim, a interação intermolecular pode ser estimada usando FCS. Ainda mais fortemente, um aumento no brilho da molécula fluorescente indica homo-oligomerização das moléculas. Portanto, a FCS é uma ferramenta poderosa para detectar tal agregação de proteínas.

<table><tbody><tr><td>0,25% (p/v) Tripsina-1 mmol/L EDTA&middot; Solução 4Na com Vermelho de Fenol (Tripsina-EDTA)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de plástico de 100 mm</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Prato com base de vidro de 35 mm</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>Para medição de células vivas</td></tr><tr><td>Pratos de plástico de 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Placa de alumínio</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apocromático 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Raspador de células objetivas</td></tr><tr><td></td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana filtrante de acetato de celulose (0,22 mm)</td><td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de vidro de cobertura 8 poços</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>Para medição da solução</td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>meio basal</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>biosera</td><td></td><td>Verificação de lote necessária</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Sistema FCS</td></tr><tr><td>Neuroblastoma murino Células Neuro2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>Linha celular</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>DNA plasmídico para o transportador de transfecção</td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina (&times; 100)</td> <td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>DNA de plasmídeo para TDP25 marcado com eGFP monomérico</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>DNA de plasmídeo para expressão de monômero eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>DNA de plasmídeo para mutante G85R ligado a ALS de SOD1 marcado com eGFP monomérico</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de agregação de proteínas usando espectroscopia de correlação de fluorescência

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer (DA), Doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (HD), e assim por diante. Para detectar e analisar oligômeros ou agregados de proteínas solúveis ou difusas, foi utilizada espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que pode detectar a velocidade de difusão e o brilho de uma única partícula com uma única sensibilidade de molécula. No entanto, o procedimento adequado e o know-how para a detecção de agregação de proteínas não foram amplamente compartilhados. Aqui, mostramos um procedimento padrão de medição de FCS para propriedades de difusão de proteínas propensas à agregação em células de lise celular e vivas: fragmento terminal de carboxíl de 25 kDa associado à ALS de tar DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) e superóxido dismutase 1 (SOD1). Os resultados representativos mostram que uma parte dos agregados de TDP25 com proteína fluorescente verde (GFP) foi ligeiramente incluída na fração solúvel do neuroblastoma neuroblastoma neuroblastoma neuro2a lysate celular. Além disso, o SOD1 com marca GFP que carrega mutação associada à ELA mostra uma difusão mais lenta em células vivas. Assim, introduzimos aqui o procedimento para detectar a agregação de proteínas através de sua propriedade de difusão usando FCS.

Realizamos a medição fcs de GFP-TDP25 em lisesto celular e SOD1-G85R-GFP em células vivas. Em ambos os casos, foram capazes de ser adquiridas uma amplitude positiva e acfs suaves. Mostramos que uma parte do GFP-TDP25 expressa em células Neuro2a foi recuperada na fração solúvel sob a condição indicada6. Na fração solúvel do liseto celular, foram detectadas moléculas de fluorescência extremamente brilhantes no registro da taxa de contagem de fótons usando FCS (Figura 2A...

Aqui introduzimos um procedimento para medir oligômeros proteicos e agregação em células lisato celular e células vivas usando espectroscopia de correlação de fluorescência.

Detecção de Agregação de Proteínas usando Espectroscopia de Correlação de Fluorescência

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

O melhor princípio da espectroscopia de correlação da fluorescência, FCS, foi inventado inicialmente na década de 1970. Na década de 1990, importantes e muitas melhorias para a FCS foram estabelecidas pela combinação com uma microscopia de aparelho confocal. Desde então, a FCS tem sido usada para muitas aplicações químicas e de cura de vírus, como interações moleculares e análise de agregação de proteínas.A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativos. Brilho de fluorescência são partículas únicas em ação de tamanhos moleculares explicados por propriedades de difusão. É muito importante medir agregações proteicas porque pode determinar ciclos de vida projetados de moléculas, mas também distinguir a polimerização homo ou hetero.Aqui, introduzimos um procedimento para medir a difusão da esclerose lateral amiotrófica associada à proteína de forma agregada utilizando FCS em células lísatos e células vivas. Prepare 100 milímetros de prato plástico cultivando células Neuro2a sentadas confortavelmente no meio de crescimento normal. Confirme a confluência celular.Remova o meio. Adicione 3,5 mililitros de solução Trypsin-EDTA no terceiro prato de cartucho e incuba-os a 37 graus celsius por um minuto. Adicione 9,5 mililitros de crescimento normal no prato e suspenda-os.A suspensão celular é misturada com azul trypan para manchar as células mortas. Adicione suspensão ao slide de contagem de células. Conte o número de células usando o contador de células, ou manualmente.Verifique o número do celular ao vivo e sua viabilidade. Diluir a célula no meio contado em 1,0 vezes 10 para a potência de 5 por mililitro. Adicione dois mililitros de suspensão celular na antena plástica de 35 milímetros para lise celular ou prato de espaço de crescimento para medição de células vivas.Incubar o prato a 37 graus celsius por um dia. No dia seguinte, prepare a mistura de DNA plasmídeo e os reagentes de transfecção. Adicione a mistura de transfecção ao meio contado por células e incubar as células por 24 horas.Um dia depois. Verifique a expressão GFP usando um microscópio de rotina. Você pode ver os corpos de ingredientes TDP25 muito brilhantes nas células.A lise celular deve ser realizada no banco bioquímico. Retire o meio no prato. Adicione dois mililitros de PBS a 25 graus celsius para lavar como meio.Remova o PBS. Coloque o prato em uma placa de alumínio no topo do gelo esmagado. Imediatamente, adicione o tampão de 200 microliter lysis no prato.Raspe o prato usando um raspador de células. Recupere o lise com detritos celulares não resolvidos em um novo tubo de 1,5 milímetros. Centrifugar o lise a quatro graus celsius.Para medições de células vivas, substitua o meio por um fresco antes da medição. Verifique o acessório da célula usando um microscópio de contraste de fase. Além disso, verifique a expressão GFP usando um microscópio de fluorescência.Use um sistema FCS combinado com microscópio confocal. Ligue o laser de 488 nanômetros. Estabilize o sistema, pelo menos, por 30 minutos.Configure o caminho óptico. Use um laser de 488 nanômetros para a luz instantânea. Use um divisor de vigas apropriado e medidoresdicróicos.E também, fusores de fluorescência. Normalmente, usaremos câmaras de vidro para calibração e medições de soluções. Com cuidado, pegue a câmara de vidro de cobertura.Coloque a superfície de vidro no papel de triagem da lente. Despeje a calibração FCS. Adicione a solução Rhodamine 6G também.Adicione a água ultrauso no objetivo. Não use o óleo. Coloque a câmara no palco do microscópio.Mova o palco para a posição apropriada. Crie o ajuste do orifício e abra o assistente de ajuste do orifício. Monitore a taxa de contagem de fótons como movimento grosseiro do pinhole para a direção x.A posição mais brilhante foi justamente determinada. Em seguida, monitore a taxa de contagem de fótons como movimento fino. A posição mais brilhante foi determinada com sucesso Esta é a posição pinhole para x-direção.Da mesma forma, procure a posição mais brilhante do pinhole para y-direção. A posição mais brilhante para a direção y também foi determinada com sucesso. Compondo a posição x e y do orifício.É melhor ajustar a posição do orifício antes da medição de cada dia. Quando o caminho ao vivo é alterado, a posição do orifício deve ser ajustada novamente. Crie uma taxa de contagem e monitore a taxa de contagem de telefones.Altere para o modo de monitoramento do CPM. Conte o anel de correção do objeto que você executou para que o valor do CPM seja o mais alto. Feche a janela de taxa de contagem.Comece com a medição da solução Rhodamine 6G. Após a conclusão da medição, clique no ajuste para realizar a Análise de Montagem da Curva. Selecione um modelo para montagem da antiga função de correlação.Para Rhodamine 6G, selecione o modelo para difusão tridimensional de 1 componente com um estado trigêmeo. Ajuste o tempo de início de montagem movendo a linha vermelha. Clique em Encaixar Tudo, para iniciar o cálculo de encaixe.Verifique o desvio de ajuste. Certifique-se de que os lados estão postados e negativos, em torno de zero. Verifique os valores ajustados.Certifique-se de que o tempo de difusão esteja aproximadamente na faixa de 20-30 microsegundos. Além disso, o parâmetro estrutural é de quatro a oito. Abra o painel de ajuste e selecione um modelo para a medição.Digite o mesmo valor de parâmetro estrutural no modelo para a amostra no painel de ajuste. Certifique-se de que o tipo deve ser definido como Fixo. Medição GFP-TDP25 em lise celular.Coloque o lise na câmara de vidro de cobertura. Coloque a tampa para evitar secar o lise. Coloque a tampa do palco para sombreamento leve.No painel de aquisição, defina a potência do laser, o tempo de medição e suas repetições. Comece a aquisição. Um pico foi observado.Um pico foi observado novamente. O pico indica moléculas brilhantes passadas pelo corpo de detecção. Picos indicam oligômeros solúveis ou agregados.Crie um ajuste para realizar a análise de ajuste de curva. Selecione o modelo para difusão tridimensional de 2 componentes com estado trigêmeo. Ajuste a hora de início da montagem.Clique no Fit All. Verifique os valores ajustados. SOD1-G85R marcado com medição GFP em uma célula viva.Ao contrário da medição da solução, recomendo o uso da incubadora do estágio de calor. Coloque o prato de cultivo de células no estágio do microscópio. Confirme o foco e a posição usando o ocular.Selecione uma célula de medição. Zoom-in e ajuste a posição da célula usando um modo de varredura rápida. Adquira o instantâneo das células usando o modo de velocidade de varredura lenta.Selecione uma posição de medição FCS usando a ferramenta Posição. A mira indica a posição de medição. Comece a medição.A ligeira diminuição do registro da taxa de contagem de fótons sugere fotobleaching de GFP. Realize o encaixe da curva. Resultados representativos de GFP-TDP25 no lysate celular são mostrados.O gráfico superior um registro de taxa de contagem de fótons. Onde há flechas é um pico, sugerindo oligômeros solúveis e agregados. O gráfico médio representa a antiga função de correlação.A linha cinza mostra a função de correlação baixa e antiga. A linha magenta mostra a função instalada. As linhas pontilhadas indicam os tempos de partida e fim para a montagem.A tabela inferior mostra o valor ajustado. Em seguida, resultados representativos de SOD1-G85R-GFP em uma célula viva são mostrados. O gráfico superior representa um registro da nossa taxa de contagem de fótons.Observou-se a diminuição gradual da taxa de contagem de fótons registrada, sugerindo fotoblema do crescimento do GFP para diferentes medições. Isso é por causa da velocidade de difusão lenta em células vivas. O gráfico médio representa a antiga função de correlação do SOD1.A linha cinza mostra a função de correlação baixa e antiga. A linha magenta mostra a função montada. As linhas pontilhadas indicam os tempos de partida e fim com a montagem.A tabela inferior mostra valores ajustados. Aqui mostramos este procedimento para medir a difusão de cada célula associada ao TDP-25 em lise celular e tudo o que é mutante de SOD1 em células vivas usando FCS. Os oligômeros solúveis e a agregação no lysato celular podem ser frequentemente observados como picos ou rajadas.Por outro lado, em células vivas, tais picos raramente são observados, exceto por estruturas vivas possivelmente óbvias. Uma espécie de SOD1 mutante adiciona brilho médio para partículas únicas como a homopolimerização SOD1 dentro para nós. O procedimento aqui mostrado é simples e vale a pena.FcS não contém radiação;estado diretamente adormecido. É só sua empatia e imaginação.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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