Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

O protocolo demonstra um método rápido de identificação de proteínas bacterianas usando indução de antibióticos e espectrometria de massa. A principal vantagem da técnica é sua velocidade e simplicidade. A preparação da amostra não é complicada.

A técnica pode ser estendida à caracterização de qualquer bactéria patogênica, como fatores de virulência ou resistência a antibióticos para melhor informar o tratamento adequado para uma infecção bacteriana. Para começar, use um laço microliter estéril para colher bactérias de colônias únicas cultivadas em placa de ágar LB. E transfira para um tubo de microcentrifuge da linha de rosca da linha O-ring de dois mililitros contendo 300 microlitros de água de grau HPLC.

Em seguida, brevemente vórtice do tubo e pelota as células por centrifugação, a uma água relíquia microliter de 0,75 microliter da amostra supernante no Alvo MALDI de aço inoxidável, e permitir que ele seque. Sobreponha o ponto de amostra seca com 0,75 microlitres de uma solução saturada de ácido sinapúrico preparado em acetonitrilo de 33%, 67% água e ácido trifluoroacético de 0,2%, e permita que o local seque. Uma vez que a mancha esteja seca, carregue o alvo no espectrômetro de massa.

Abra o software de aquisição e clique em MS Linear Mode Acquisition ou faixa de carga em massa e massa para carregar dos limites inferior e superior em seus respectivos campos. Clique no local de amostra para ser analisado no modelo de destino MALDI. Em seguida, pressione o botão esquerdo do mouse e arraste o cursor sobre o local da amostra para especificar a região retangular a ser amostrada para uma ablação ou ionização a laser.

Solte o botão do mouse para iniciar a aquisição e colete 1000 tiros a laser para cada ponto de amostra. Se os íons não forem detectados, aumente a intensidade do laser ajustando a barra de escala deslizante sob intensidade de laser até que o sinal de íons proteicos seja detectado. Após a conclusão da Aquisição do Modo Linear MS, clique na Aquisição do Modo Refletiron MS/MS.

Insira a massa precursora para ser analisada no campo de massa precursora. Em seguida, insira uma largura de isolamento em daltons na janela de massa precursora para o lado de massa baixa e alta da massa precursora. Clique no botão CID Off.

Em seguida, clique no botão Supressor Metastable On. Ajuste a intensidade do laser para pelo menos 90% do seu valor máximo ajustando a barra de escala deslizante como demonstrado. Clique no local da amostra a ser analisado no modelo de destino MALDI e, em seguida, deprimir o botão do mouse esquerdo e arraste o cursor sobre o local da amostra para especificar a região retangular a ser amostrada para ablação ou ionização a laser, solte o botão do mouse para iniciar a aquisição e colete 10.000 tiros laser para cada ponto de amostra, conforme demonstrado.

Clique duas vezes no Arquivo Executável Do Buscador de Proteínas e na janela gráfica da interface do usuário. Digite a massa do biomarcador de proteínas no campo de massa de proteína madura, e o erro de medição de massa no campo de Tolerância em Massa. Opcionalmente, clique no botão Cortesia b/y ion Protein Mass Calculator para calcular a massa proteica de um par de íons de fragmentos de cortesia putativo, e a janela pop-up da Ferramenta calculadora de massa de proteína aparecerá.

Digite a proporção de massa para carga do par de íons de fragmentos de cortesia putativo, clique no botão Adicionar par e a massa de proteína da calculadora aparecerá. Copie esse valor no campo de massa de proteínas maduras e feche a janela da ferramenta pasta de massa de proteínas. Clique na caixa De restrição de resíduos.

Selecione o comprimento do peptídeo de sinal terminal final, e o pop-up com uma escala deslizante e cursor aparecerá e mova o cursor para o comprimento do peptídeo de sinal desejado. Se o comprimento do peptídeo de sinal não for selecionado, uma truncação de sequência irrestrita será realizada pelo software. Sob a Condição de Íon de Fragmento, selecione o decote de espinha dorsal de resíduos para polipeptídeo clicando nas caixas de um ou mais resíduos, D-E-N e/ou P.E.E clique no botão Enter Fragment Ions Plus One para ser botão de pesquisa e a página de fragmento pop-up aparecerá.

Clique em seguida no botão Adicionar íon fragmento, e um campo suspenso aparecerá para que cada íon de fragmento seja inserido. Digite a massa por taxas de carga dos íons de fragmento e sua massa associada pela tolerância de carga. Em seguida, clique no botão Salvar e Fechar.

Na caixa lateral direita de Quantos íons de fragmento precisam ser correspondidos, role para selecionar o número mínimo de íons de fragmento que devem ser combinados para identificação e selecione os resíduos de cisteína em seu estado oxidado. Se as proteínas não forem identificadas após a busca, repita a busca com cisteínas em seu estado reduzido. De acordo com a configuração de arquivo, clique no ícone de arquivo Select FASTA para navegar e selecione o arquivo FASTA contendo as sequências de proteína silico em silico da cepa bacteriana anteriormente construída.

Em seguida, selecione uma pasta de saída e crie um nome de arquivo de saída. Clique no ícone "Pesquisar em entradas de arquivos". Uma janela pop-up aparecerá intitulada Confirmar parâmetros de pesquisa exibindo os parâmetros de pesquisa antes que a pesquisa seja iniciada.

E se os parâmetros de pesquisa estiverem corretos, clique em Iniciar pesquisa. Se os parâmetros estiverem incorretos, clique em Cancelar e reinsira os parâmetros corretos. Uma vez iniciada a pesquisa, a janela do parâmetro será fechada e uma nova janela pop-up com uma barra de progresso aparecerá, mostrando o progresso da pesquisa e uma contagem de execução do número de identificações encontradas.

Após a conclusão da pesquisa, a barra de progresso será fechada automaticamente, e um resumo da pesquisa será exibido no campo de registro da interface gráfica do usuário, juntamente com uma nova janela pop-up exibindo as identificações de proteínas encontradas. No presente estudo, as culturas bacterianas foram cultivadas em LB com duas concentrações diferentes de mitomicina-C. O espectro de massa da cultura bacteriana cresceu com uma concentração de mitomicina-C.

Proteína de choque frio C, proteína de choque frio E, e uma proteína transmitida por plasmídeos de função desconhecida foram identificados. O íon proteico desconhecido em 9780 foi analisado pela MS/MS, e o íon precursor foi isolado com uma janela seletora de íons de tempo de aproximadamente 100 daltons. O íon fragmento em massa para carregar 9675,9 é derramado a partir da dissociação do íon proteico metastável em 9655.

A sequência da proteína de imunidade para colicina E3 contém resíduos básicos possíveis locais de ionização. Os íons fragmentos detectados a partir do decote da coluna vertebral do polipeptídeo, quando a forma reduzida de cisteína foi usada durante a busca. A methionina terminal N é removida como uma modificação pós-tradução.

Quando a cultura bacteriana foi cultivada em uma alta concentração de micomicina-C, a proteína de imunidade da bacteriocina foi identificada. O pico desconhecido em 9651 foi analisado por MS/MS, e o íon precursor foi isolado com uma janela TIS mais estreita e assimétrica de menos 75 mais 60 daltons. A sequência da proteína de imunidade da bacteriocina contém resíduos básicos possíveis locais de ionização.

Os íons fragmentos detectados a partir do decote da coluna vertebral do polipeptídeo, quando a forma reduzida de cisteína foi usada durante a busca. com as diferentes concentrações de antibióticos, a abundância relativa de proteínas pode variar. E estes foram analisados usando espectrometria de massa.

Ao colher células bacterianas, observe a morfologia da colônia e o crescimento bacteriano em relação aos antibióticos e à concentração. Um loop de um microliter de células é necessário para detectar proteínas.