Name: Seleção de nanomá corpos inibitórios direcionados ao transporte por eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a triagem de nanobodies inibitórios usando eletrofisiologia de membrana suportada em estado sólido (SSM) para transportadores eletrogênicos. Este método permite determinar constantes de inibição (IC50) sem substratos marcados.

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Agradecemos a Cedric A. J. Hutter e Markus A. Seeger do Instituto de Microbiologia Médica da Universidade de Zurique, e Gonzalo Cebrero, da Biozentrum, da Universidade de Basileia, pela colaboração na geração de nanomá corpos sintéticos (sybodies). Agradecemos a Maria Barthmes e Andre Bazzone da NANION Technologies pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (SNSF) (PP00P3_170607 e naNION Research Grant Initiative to C.P.).

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<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li>
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<li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317(2018).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li>
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<li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaLi-H1%3A+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228(2016).</li>
<li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).</li>
<li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li>
<li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li>
<li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li>
<li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li>
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<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
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<li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li>
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<li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+of+electrogenic+sugar%2FH%2B+symport+in+MFS+sugar+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392(2016).</li>
<li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183(2020).</li>
<li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li>
<li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064(2020).</li>
<li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

A técnica aqui apresentada classifica os nano corpos com propriedades inibitórias e não inibitórias voltadas aos transportadores eletrogênicos. A avaliação do transporte de substratos é possível devido à detecção do movimento de cargas através do transportador embutido na membrana de proteoliposomes. Algumas das etapas críticas durante a configuração de um experimento são a reconstituição de proteína ativa em lipossomos, a preparação de monocamadas estáveis em chips SSM e a recuperação das condições iniciais após a aplic...

Os anticorpos são compostos de duas correntes pesadas idênticas e duas correntes leves que são responsáveis pela ligação de antígeno. Os camelados possuem anticorpos de cadeia pesada que exibem afinidade semelhante ao seu antígeno cognato em comparação com os anticorpos convencionais1,2. O domínio variável único (VHH) de anticorpos de cadeia pesada apenas retém o potencial total de ligação de antígeno e mostrou-se muito estável1,2. Essas moléculas isoladas de VHH ou "nano corpos" foram implementadas em estudos relacionados à bioquímica de proteínas de membrana como ferramentas para estabilizar as conformações3,4, como inibidores5,6, como agentes de estabilização7, e como dispositivos para determinação da estrutura8,9,10 . Os nanocorpos podem ser gerados pela imunização de camelds para o pré-enriquecimento de células B que codificam nanocorpos específicos do alvo e posterior isolamento de células B, seguidos pela clonagem da biblioteca de nanocorpos e seleção por exibição phage11,12,13. Uma forma alternativa de gerar nano corpos baseia-se em métodos de seleção in vitro que dependem da construção de bibliotecas e seleção por exibição de phage, display de ribossomo ou display de levedura14,15,16,17,18,19,20. Esses métodos in vitro exigem grandes tamanhos de biblioteca, mas se beneficiam de evitar a imunização animal e favorecem a seleção de nano corpos direcionados a proteínas com estabilidade relativamente baixa.
O pequeno tamanho dos nano corpos, sua alta estabilidade e solubilidade, forte afinidade de antígeno, baixa imunogenicidade e produção relativamente fácil, fazem deles fortes candidatos ao desenvolvimento da terapêutica21,22,23. Em particular, os nanocomas que inibem a atividade de múltiplas proteínas de membrana são ativos potenciais para aplicações clínicas5,24,25,26. No caso dos transportadores de membrana, para avaliar se um nanocorpo tem atividade inibitória, é necessário desenvolver um ensaio que permita a detecção de substratos transportados e/ou co-substratos. Tais ensaios geralmente envolvem moléculas rotuladas ou o desenho de métodos de detecção específicos de substrato, que podem não ter uma aplicação universal. Além disso, a identificação de nano corpos inibitórios geralmente requer a triagem de um grande número de aglutinantes. Assim, um método que pode ser usado em um modo de alta produtividade e que não conta com substratos rotulados é essencial para esta seleção.
A eletrofisiologia baseada em SSM é uma técnica extremamente sensível e altamente resolvida pelo tempo que permite a detecção de movimento de cargas através de membranas (por exemplo, ligação/transporte de íons)27,28. Esta técnica tem sido aplicada para caracterizar transportadores eletrogênicos, que são difíceis de estudar utilizando outras técnicas de eletrofisiologia devido à relativa baixa rotatividade dessas proteínas29,30,31,32,33,34,35. A eletrofisiologia SSM não requer o uso de substratos rotulados, é adequado para triagem de alto rendimento, e ou proteoliposomes ou vesículas de membrana que contenham o transportador de interesse podem ser usados. Aqui, demonstramos que a eletrofisiologia baseada em SSM pode ser usada para classificar os nanomutos direcionados ao transportador com propriedades inibitórias e não inibitórias. Como prova de princípio, descrevemos a reconstituição de um transportador de colina bacteriana em lipossomos, seguido de passos detalhados para a imobilização de proteoliposomes nos sensores SSM. Em seguida, descrevemos como realizar medições de eletrofisiologia baseadas em SSM no transporte de colina e como determinar a concentração efetiva semi-máxima (EC50). Em seguida, mostramos como usar a eletrofisiologia baseada em SSM para rastrear vários nanomá corpos e identificar inibidores do transporte de colina. Finalmente, descrevemos como determinar as concentrações inibitórias semi-máximas (IC50) de nano corpos inibitórios selecionados.

<table><tbody><tr><td>solução de 1-octadecanetiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorvente (grânulos adsorventes de poliestireno)</td> <td>BioRad</td> <td># 152-3920</td><td></td></tr><tr><td>PD 10 Colunas de dessalinização</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro 200 nm membrana</td><td>Whatman Nucleopore</td><td>WHA800282</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>33539-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8034051000</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecil-&szlig;-D-maltosídeo (DDM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850520P-25g</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr><tr><td>(configuração SSM) SURFE2R N1</td><td>Nanion</td><td>----- </td><td></td></tr><tr><td>SURFE2R N1 Único Sensor Chips</td><td>Nanion</td><td># 161001</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Extrato Lipídico Polar</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>Ovo PC L-&alfa;-fosfatidilcolina </td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>840051C</td><td></td></tr></tbody></table>

seleção de nanomá corpos inibitórios direcionados ao transporte por eletrofisiologia baseada em membrana sólida (ssm)

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Anticorpos de domínio único (nano corpos) têm sido amplamente utilizados em estudos mecanicistas e estruturais de proteínas e representam um enorme potencial como ferramentas para o desenvolvimento de terapias clínicas, muitas das quais dependem da inibição de proteínas de membrana, como transportadores. No entanto, a maioria dos métodos utilizados para determinar a inibição da atividade de transporte são difíceis de executar em rotinas de alto rendimento e dependem da disponibilidade de substratos rotulados, complicando assim a triagem de grandes bibliotecas de nanocorpos. A eletrofisiologia da membrana de suporte sólido (SSM) é um método de alta produtividade, usado para caracterizar transportadores eletrogênicos e medir sua cinética de transporte e inibição. Aqui mostramos a implementação da eletrofisiologia baseada em SSM para selecionar nano corpos inibitórios e não inibitórios visando um transporte secundário eletrogênico e calcular constantes inibitórias de nano corpos. Esta técnica pode ser especialmente útil para selecionar nano corpos inibitórios direcionados aos transportadores para os quais substratos rotulados não estão disponíveis.

A eletrofisiologia baseada em SSM tem sido amplamente utilizada para a caracterização de transportadores eletrogênicos. No protocolo aqui apresentado, mostramos como usar a eletrofisiologia baseada em SSM para classificar os nanomá corpos direcionados a um transportador secundário (aqui um simportador de colina bacteriana) com base em suas propriedades inibitórias e não inibitórias. Uma das características mais úteis desta técnica é que ela permite a triagem de alto rendimento de múltiplas condições de buffer. Esta carac...

Os nano corpos são importantes ferramentas na biologia estrutural e representam um grande potencial para o desenvolvimento de terapias. No entanto, a seleção de nano corpos com propriedades inibitórias pode ser desafiadora. Aqui demonstramos o uso de eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM) para a classificação de nano corpos inibitórios e não inibitórios visando transportadores de membrana eletrogênica.

Seleção de nanomá corpos inibitórios direcionados ao transporte por eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

O protocolo apresentado é utilizado para triagem de alto rendimento e identificação de nano corpos inibitórios e não inibitórios visando transportadores eletrogênicos reconstituídos em proteoliposomes ou presentes em vesículas de membrana. Projetar ensaios de transferência pode ser difícil em vários casos, especialmente se substratos rotulados não estiverem disponíveis. Se a mesma eletrofisiologia permite estudar o efeito de nano corpos no transporte para praticamente qualquer transporte eletrogênico, uma vez que a eletrofisiologia SSM não requer substratos rotulados.Nano corpos foram investigados por seu uso em aplicações médicas. Esta técnica pode ajudar a tela potenciais inibidores visando transportadores eletrogênicos específicos de humanos ou patógenos humanos. Para começar, pegue 10 tubos limpos e transfira 10 mililitros da membrana não ativada de sólido, ou SSM, tampão em cada tubo.Para preparar os buffers SSM ativados, adicione o substrato nos tubos usando uma série de concentrações em torno da concentração máxima de metade esperada. Inicie o software SSM e deixe a máquina inicializar automaticamente. Defina o caminho de salvamento para dados.Confirme apertando o botão OK. Selecione o protocolo de limpeza inicial padrão nas opções de fluxo de trabalho e clique em executar. Em seguida, monte o chip revestido de proteoliposome na tomada.Mova o braço para travar o chip. Inclua o chip montado com a tampa. Selecione o CapCom do programa no fluxo de trabalho e deixe-o executado para determinar a condutividade e a capacitância.Confirme que a condutividade está abaixo de cinco nanosiemens e a capacitância está entre 15 e 35 nanofarad antes de usá-lo para a medição. Transfira as soluções de ativação em frascos e posicione os buffers no sampler do teste. Transfira o tampão não ativado para um reservatório e coloque-o ao lado do suporte do chip na posição do reservatório à direita.Crie um protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência de sequência de solução não ativada, ativada e não ativante, ou uma sequência BAB, em um loop que executa três medições e se move para o próximo buffer de ativação para todos os 10 buffers. Use a taxa de fluxo padrão de 200 microliters por segundo com um segundo, um segundo, um segundo de fluxo para a sequência BAB e clique em reprodução para iniciar a medição. Salve o protocolo e deixe o fluxo de trabalho ser executado clicando no botão reproduzir.Em seguida, realize o mesmo experimento usando lipossomos livres de proteínas. Use qualquer software preferencial para análise de dados para traçar a corrente medida versus tempo e use a função para estimativa de altura máxima na faixa de adição do buffer de ativação. Plote a corrente máxima contra a concentração do substrato para determinar o efeito meio máximo da concentração, ou EC50, do substrato através de regressão não linear.Transfira 50 mililitros do buffer SSM não ativado para um tubo limpo. Adicione a colina do substrato a uma concentração final de cinco milimiliar e use-a para uma medição positiva de controle. Transfira 10 mililitros do buffer SSM não ativador para um tubo limpo.Adicione colina substrato a cinco milimólares e nanocorpo a 500 nanôes de concentração final. Repita o passo para cada nanocorpo preparar as soluções de ativação como demonstrado. Inicie a máquina SSM e meça a capacitância e condutividade do chip revestido de proteoliposome, como demonstrado anteriormente.Transfira a solução de ativação sem um nanocorpo em um frasco e coloque o buffer no sampler da sonda. Transfira o buffer não ativador sem um nanocorpo em um reservatório e posicione-o no sampler da sonda. Em seguida, repita este processo para todas as soluções que contenham nano corpos com solução ativadora e não ativante.Crie um protocolo para o fluxo de trabalho Usando uma sequência BAB. Crie um loop que realize três medições da sequência BAB usando buffers sem nanocorpos, duas medidas da sequência BAB com buffers contendo um nanocorpo, 120 segundos de incubação de tempo de atraso com o nanocorpo, e três medidas da sequência BAB com buffers contendo o nanocorpo. Salve o fluxo de trabalho e deixe-o rodar clicando no botão reproduzir.Em seguida, crie um novo protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência BAB e um loop de cinco medidas para lavar o corpo nano reversivelmente ligado. Salve o fluxo de trabalho e deixe-o rodar clicando no botão reproduzir. Compare a última corrente de pico das medições com a medição inicial somente do substrato.Se a corrente máxima atingir o valor inicial, o nanocorpo foi lavado com sucesso e as condições iniciais foram restabelecidas. Caso contrário, repita o fluxo de trabalho ou mude para um novo chip. Repita este processo usando chips individuais para cada tela de nanocorpo, ou repita com vários nanocorpos usando o mesmo chip.Use qualquer software preferencial para análise de dados para traçar a corrente medida versus o tempo. Em seguida, o software seleciona automaticamente a função para estimativa de altura máxima na faixa de adição do buffer de ativação. Normalize a corrente máxima e a presença do nanocorpo com base na medição apenas do substrato.Plote as correntes máximas no histograma e compare as correntes máximas das medições apenas do substrato com as correntes de pico medidas na presença de nano corpos para identificar nano corpos inibitórios. Transfira 50 mililitros do buffer SSM não ativador em um tubo limpo e adicione a colina do substrato a uma concentração final de cinco mililitros, e use-o como solução de ativação para controle positivo. Adicione cinco mililitros da solução não ativante a oito tubos limpos, em seguida, adicione colina substrato e nanocorpo inibitório aos tubos em concentrações na faixa de IC50 esperada.Adicione 10 mililitros da solução não ativante aos oito tubos e adicione nanocorpo inibitório a cada tubo correspondente ao tampão de não ativação. Inicie a configuração SSM e meça a capacitância e condutividade do chip revestido de proteoliposome. Transfira a solução de ativação sem nanocorpo para um frasco e coloque-a no sampler da sonda.Em seguida, transfira o tampão não ativado sem nanocorpo para um reservatório e posicione-o na posição do reservatório ao lado do suporte do chip à direita. Transfira as soluções ativantes e não ativantes contendo nano corpos em frascos e posicione os buffers no sampler da sonda. Crie um protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência BAB.Inclua um loop para medir cada concentração duas vezes, incubar por 120 segundos e medir mais três vezes. Use qualquer software preferencial para análise de dados para traçar a corrente medida versus tempo e selecione a função para a estimativa de altura máxima na faixa de adição do buffer de ativação. Plote as correntes de pico contra a concentração de nanocorpo para determinar o IC50 através de regressão não linear.Para determinar a concentração de substrato a ser utilizada durante uma triagem de nano corpos, o transporte eletrogênico foi medido sob diferentes concentrações de substrato para determinar o EC50. Uma concentração de substrato correspondente a condições saturadas, cinco milimiliar, foi selecionada e mantida constante em todos os buffers de ativação. O efeito dos nanomutos inibitórios no transporte eletrogênico foi visualizado a partir da diminuição das amplitudes das correntes de pico.Após executar o protocolo de lavagem para permitir a desvinculação de nanocorpos, observou-se uma recuperação de 80 a 95% da amplitude inicial de corrente de pico. Ao mudar de condições não ativadas para ativação, nenhuma corrente de artefato significativa foi introduzida por nano corpos presentes nestes buffers. Após a seleção de nanomá corpos com propriedades inibitórias, foram determinados os valores IC50 para nanocas individuais.É crucial dar tempo suficiente para a calibração dos proteoliposomes no chip com o tampão contendo o nanocorpo. Uma vez que a ligação é reversível, o nanocorpo precisa estar presente tanto em buffers de ativação quanto não ativantes.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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