Name: Cirurgia e Processamento de Amostras para Imagem Correlativa da Válvula Pulmonar Murina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda a caracterização estrutural multiescala da válvula pulmonar murina usando fixação hidrostática controlada e imagem correlativa por μCT e SBF-SEM. Este protocolo integrado preserva a conformação fisiológica e mapeia dados ultrastruturais de alta resolução para locais anatômicos precisos.

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Este trabalho é apoiado, em parte, pelas subvenções R01HL139796 e R01HL128847 para as bolsas CKB e RO1DE028297 e CBET1608058 para DWM.

O uso de animais neste estudo foi de acordo com o Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil Nacional sob o protocolo AR13-00030.
1. Excisão da válvula pulmonar
<ol><li>Autoclave as ferramentas necessárias para a dissecção do mouse. Isso inclui tesouras finas, micro fórceps, grampos micro vasculares, fórceps de fixação, suportes de microaclese, tesoura de mola e retratores.</li>
	<li>Aclimatar todos os ratos por um mínimo de 2 semanas antes da operação. Remova os camundongos C57BL/6, aproximadamente 1 ano de idade, de suas gaiolas e pese, depois eutanize com um coquetel de cetamina/xilazina (3:1 cetamina:xylazine, 0,01 mL por g) overdose.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma posição de recumbência dorsal em uma bandeja e fixe seus membros com fita. Uma vez assegurado, faça a toracotomia.<ol>
<li>Exponha o coração removendo qualquer excesso de tecido adiposo e fáscia.</li>
		<li>Remova o átrio direito e peruse através do ventrículo esquerdo com solução salina de temperatura ambiente (0,9% NaCl). A perfusão deve levar aproximadamente 20 mL acima de 30 s. Isso resulta na exsanguinação do rato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova todo o coração cortando a veia cava superior, veia cava inferior, artéria pulmonar e aorta. Deve-se tomar cuidado especial para a artéria pulmonar. Corte aproximadamente 2 mm acima da junção ventriculo-arterial, pois este servirá como o canal para pressurização.</li>
	<li>Remova os ventrículos esquerdo e direito para expor câmaras à pressão atmosférica. Certifique-se de que a estrutura do tronco pulmonar não deve ser afetada pela remoção dos ventrículos.</li>
</ol>2. Fixação de pressão da válvula pulmonar
<ol><li>Tubo de pressurização anastomose com artéria pulmonar, deixando aproximadamente 1 mm de distância entre a junção sino-tubular e a extremidade da tubulação para acomodar grandes movimentos dos folhetos e tronco pulmonar.</li>
	<li>Eleve o reservatório a uma pressão fisiológica análoga e preencha-o com a solução salina. Teste o sistema de fluxo para garantir que não haja bloqueios ou bolhas de ar.</li>
	<li>Conecte uma torneira à válvula pulmonar anastomosa e garanta o fluxo adequado através do tubo (ou seja, sem bolhas de ar) trocando o trato de saída. Uma vez que o fluxo seja adequado, mude a vazão para a válvula pulmonar anastomosa e garanta a pressurização do tronco pulmonar. Isso é identificado por distensão pulmonar do tronco.</li>
	<li>Uma vez confirmada a pressurização do tronco pulmonar, incorpore gradualmente a solução fixativa primária (1,25% glutaraldeído, 1,0% paraformaldeído em 0,15 M de cacodilato) até que a solução salina seja purgada. Isso é feito removendo uma porção, aproximadamente 25% da capacidade do reservatório, da solução salina e substituindo-a pelo fixador primário. ATENÇÃO: Os fixativos utilizados (paraformaldeído e glutaraldeído) são altamente tóxicos e equipamentos de proteção individual (EPI) altamente tóxicos devem ser usados para garantir a segurança.</li>
	<li>Coloque uma gaze fixada sobre a amostra de tecido para evitar a secagem.</li>
	<li>Perfunda o fixador por 3h, reabastecendo o reservatório conforme necessário para manter uma pressão constante. Ao longo da fixação, não é incomum que a válvula pulmonar encolha por causa da fixação química. Se for esse o caso, reabastece constantemente o reservatório com fixação primária para manter a pressão fisiológica.</li>
	<li>Armazene a válvula cardíaca na solução fixada a 4 °C até usar. As amostras foram armazenadas por até 1 semana sem qualquer diferença discernível.</li>
</ol>3. Coloração e incorporação da amostra do blocoen 15,16
ATENÇÃO: Os reagentes de coloração utilizados nesta seção (ferrocinídeo de potássio, tetroxida de ósmio, tiocarbohydrazida, aspartato de chumbo e acetato de urisola) são altamente tóxicos e devem ser tratados com extremo cuidado. É aconselhável o uso de um capô de fumaça e EPI adequado.
<ol><li>Mancha<ol>
<li>Lave a amostra fixa da válvula cardíaca por 5 minutos com tampão de cacodilato frio de 0,15 M. Repita a lavagem mais duas vezes.</li>
		<li>Submergir completamente a válvula cardíaca em uma solução de ferrocianida de potássio de 1,5%, 0,15 M de cacodilato, cloreto de cálcio de 2 mM e 2% de tetroxida de ósmio, no gelo por 1h.</li>
		<li>Enquanto a amostra estiver incubando, prepare a solução de tiocarbohydrazida (TCH) dissolvendo 0,1 g de TCH em 10 mL de ddH2O. Coloque a solução em um forno de 60 °C por 1h. Agitar suavemente periodicamente para garantir que o TCH seja completamente dissolvido. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,22 μm imediatamente antes de usar.</li>
		<li>Lave as amostras com ddH2O de temperatura ambiente colocando-as em um tubo de ddH2O por 5 min e agitar-a ligeiramente agitando o recipiente. Repita este processo três vezes.</li>
		<li>Coloque-o na solução TCH filtrada por 20 minutos à temperatura ambiente. Realize a etapa de lavagem três vezes (5 min cada) com ddH2O de temperatura ambiente, conforme descrito na etapa 3.1.4.</li>
		<li>Uma vez feito, coloque a amostra em 2% de tetroxida de ósmio por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave-o novamente por um total de três vezes por 5 min cada com temperatura ambiente ddH2O.</li>
		<li>Incubar a amostra em acetato de 1% de urano durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Durante este período, faça uma solução de 0,066 g de nitrato de chumbo em 10 mL de solução de estoque de ácido aspartc. Ajuste o pH para 5,5 com 1 N KOH. Coloque a solução em um forno de 60 °C para dissolver o nitrato de chumbo.</li>
		<li>Após a incubação durante a noite, realize a etapa de lavagem conforme descrito na etapa 3.1.4. Repita três vezes. Em seguida, incubar o tecido da válvula cardíaca na solução de aspartato de chumbo a partir da etapa 3.1.8 em um forno de 60 °C por 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desidratação<ol>
<li>Lave os tecidos por 5 minutos à temperatura ambiente com ddH2O. Repita três vezes.</li>
		<li>Fazer novas soluções de 20%, 50%, 70%, 90% e 100% de etanol no DDH2O. Mantenha no gelo até o uso.</li>
		<li>Para desidratar o tecido da válvula cardíaca. Realizar tratamentos subsequentes de 20%, 50%, 70% e 90% de etanol no gelo por 5 min cada. Em seguida, realize dois tratamentos subsequentes de 100% de etanol no gelo por 5 min.</li>
		<li>Mova o tecido para acetona gelada por 10 minutos. Em seguida, coloque em acetona fresca à temperatura ambiente por 10 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incorporação<ol>
<li>Faça a mistura de resina (ver Tabela de Materiais) de acordo com as especificações do fabricante: 11,4 g do componente A, 10 g do componente B, 0,3 g do componente C e 0,05-0,1 g do componente D. Inicialmente misture os componentes A e B aquecendo cada um dos componentes a 60 °C antes de adicionar os componentes C e D. A mistura se transformará em uma cor âmbar ao adicionar os componentes C e D. Será uniforme quando bem misturado.</li>
		<li>Faça misturas com proporções de volume de 25:75, 50:50 e 75:25 resina:acetona. Homogeneizar.</li>
		<li>Coloque tecidos em tratamentos subsequentes das 25:75, 50:50 e 75:25 mistura de resina:acetona por 2h cada a temperatura ambiente.</li>
		<li>Coloque tecidos em 100% de resina durante a noite à temperatura ambiente.</li>
		<li>No dia seguinte, coloque tecidos em resina fresca de 100% por 2h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Transfira os tecidos da válvula cardíaca para uma cápsula de incorporação, substitua com resina fresca de 100% e coloque em forno de 60 °C por 48 h para curar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize imagens correlativas conforme mostrado abaixo.</li>
</ol>4. Imagem de tomografia microcomputada
<ol><li>Monte o bloco de amostra de resina em um suporte de amostra μCT com um adesivo (cola ou fita dupla face funciona bem).</li>
	<li>Coloque o suporte na câmara μCT e fixe-o no palco, aparafusando a collet de tal forma que não haja movimento do suporte. O movimento da amostra durante a varredura diminuirá a qualidade da imagem.</li>
	<li>Abra a interface do usuário μCT clicando duas vezes no ícone. Adicione um projeto selecionando o sinal + ao lado de Projetos e preencha os campos necessários.</li>
	<li>Uma vez criado, encontre o projeto criado e selecione-o clicando nele. Isso abrirá uma segunda coluna Aquisições. Selecione o + ao lado de Aquisições e preencha os campos necessários.</li>
	<li>Feche as portas da câmara e arma o sistema apertando o botão de armamento no painel frontal ou no μCT. Aqueça os raios-x da interface do usuário selecionando o botão indicando aquecimento. NOTA: O sistema desligará automaticamente os raios-X após um procedimento de aquecimento bem sucedido. Ligue os raios-X selecionando o botão.</li>
	<li>Ajuste a rotação do estágio de modo que o centro da rotação da amostra não se desvie do centro do monitor (ou seja, a amostra está dentro do campo de visão para toda a varredura). Para o sistema utilizado para este experimento, isso envolve ajustar o estágio de região de interesse (ROI) sob a guia de gotação conforme detalhado abaixo.<ol>
<li>Ajuste o ajuste do estágio do ROI definindo o ângulo de rotação para 0° e marcando a borda da amostra. A amostra é então girada para 180° e a borda da amostra é marcada novamente.</li>
		<li>Ajuste a posição do estágio DO ROI x-eixo de modo que a borda da amostra esteja entre esses dois extremos. Repita este processo para ângulos de rotação de 90° e 270° para a posição y.</li>
		<li>No caso de a rotação da amostra fazer com que as bordas se movam para fora do campo de visão, diminua a ampliação das necessidades de μCT até que as bordas da amostra sejam visíveis nos ângulos definidos acima e um ajuste grosseiro do estágio do ROI possa ser feito.</li>
		<li>Uma vez ajustado na ampliação inferior, mova a amostra ou o detector para aumentar a ampliação e as posições do ROI podem ser ajustadas bem. NOTA: Este processo pode precisar ser repetido para garantir o alinhamento. O alinhamento adequado resulta em uma amostra que mostra pouco ou nenhum movimento horizontal através de todos os ângulos de rotação da amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste o μCT aos parâmetros de varredura desejados usando o software do fabricante. Esses parâmetros incluem potencial do tubo, corrente do tubo, distância do detector, distância amostral, tempo de exposição, trajetória e número de projeções (ver Tabela S1 para os parâmetros de aquisição de μCT utilizados neste estudo). NOTA: Os parâmetros de calibração, como varreduras de campo claro e de campo escuro, devem ser mantidos nas especificações do fabricante, a menos que seja indicado de outra forma. Por exemplo, se uma amostra é muito grande e o sistema não pode mover a amostra para fora da visão de campo, então a amostra precisa ser removida para realizar varreduras claras de calibração de campo.</li>
	<li>Uma vez definidos os parâmetros, uma aproximação da duração da varredura pode ser vista apertando o botão Estimativa de Tempo. Selecione o botão Iniciar para iniciar a varredura.</li>
	<li>Após a conclusão da varredura, certifique-se de que os raios-X estão desligados, desaparafusar a collet e remover cuidadosamente a amostra da câmara μCT.</li>
</ol>5. Processamento de amostras e correlação de imagem
<ol><li>Reconstrua projeções μCT usando um algoritmo de projeção de volta filtrado com o software fornecido pelo fabricante (ver Tabela de Materiais).<ol>
<li>Selecione a guia Recon na parte superior da tela. Selecione a guia Projeto e Aquisição. </li>
		<li>Selecione o modelo de reconhecimento associado à projeção de volta filtrada. Aperte o botão Iniciar reconhecimento. </li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifique e segmente a válvula pulmonar usando o software de processamento de imagens. Isso requer conhecimento prévio da anatomia da válvula pulmonar17. Em pressões arteriais elevadas, os folhetos coapt e bloqueiam o lúmen da válvula pulmonar.</li>
	<li>Identifique a orientação de corte em relação à direção de digitalização e amostra. Reoriente a amostra de modo que a direção de corte esteja alinhada com o eixo desejado.</li>
	<li>Identifique regiões de interesse para imagens de alta resolução. Neste experimento, foi escolhida a barriga (meio) do folheto e a junção arterio-valvular.</li>
	<li>Remova o excesso de resina e amostra por lâmina de barbear ou lixamento para grandes pedaços de material, ou por microtoma para peças mais finas.</li>
	<li>Uma vez em um local de interesse, compare a amostra física com fatias virtuais de μCT para confirmar a localização. Isso foi feito comparando características anatômicas na seção transversal.</li>
</ol>6. Microscopia eletrônica de varredura facial de bloco serial18
<ol><li>Reduza a seção transversal da amostra para acomodar o SBF-SEM, aproximadamente 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.</li>
	<li>Monte a amostra aparada no stub de alumínio SBF-SEM usando epóxi.</li>
	<li>Cubra o bloco de espécimes com 35 nm de ouro. Gire a amostra na plataforma para aplicar uma camada uniforme de revestimento.</li>
	<li>Desfocar a câmara SBF-SEM e ajustar a altura da lâmina da faca à altura eucêntrica do microscópio.</li>
	<li>Insira a amostra e nivele o stub amostral.</li>
	<li>Imagem em condições de vácuo baixo para evitar o carregamento e com detector de contra-teto (consulte tabela S2 para parâmetros de aquisição SBF-SEM).</li>
	<li>Imagem e costuram várias regiões de interesse em diferentes ampliações usando software automatizado (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A remoção dos ventrículos serve a dois propósitos. Primeiro, expondo o lado ventrículo à pressão atmosférica, precisando, assim, apenas aplicar uma pressão transvalvular do lado arterial da válvula pulmonar para fechar, e segundo, fornecendo uma base estável para evitar a torção do tronco pulmonar. Durante a pressurização, o tronco pulmonar distendida radialmente e inferiormente, tornando-o propenso a torção, causando o colapso do tronco pulmonar. A pré-carga da válvula pulmonar com uma solução salina oferece uma verific...

A válvula pulmonar (PV) serve para garantir o fluxo sanguíneo unidirecional entre o ventrículo direito e a artéria pulmonar. Malformações da válvula pulmonar estão associadas a várias formas de doença cardíaca congênita. O tratamento atual para doença da válvula cardíaca congênita (HVD) é o reparo valvular ou substituição da válvula, que pode exigir múltiplas cirurgias invasivas ao longo da vida1do paciente . Tem sido amplamente aceito que a função da válvula cardíaca é derivada de sua estrutura, muitas vezes referida como a correlação estrutura-função. Mais especificamente, as propriedades geométricas e biomecânicas do coração ditam sua função. As propriedades mecânicas, por sua vez, são determinadas pela composição e organização do ECM. Ao desenvolver um método para determinar as propriedades biomecânicas das válvulas cardíacas murinas, modelos animais transgênicos podem ser usados para interrogar o papel do ECM na função da válvula cardíaca e disfunção2,3,4,5.
O modelo animal murino tem sido considerado como o padrão para estudos moleculares porque modelos transgênicos estão mais facilmente disponíveis em camundongos em comparação com outras espécies. Os modelos transgênicos de Murine fornecem uma plataforma versátil para pesquisar doenças relacionadas à válvula cardíaca6. No entanto, os requisitos de perícia cirúrgica e instrumentação para caracterizar tanto a geometria quanto a organização do ECM têm sido um grande obstáculo no progresso da pesquisa de HVD. Os dados hstológicos na literatura fornecem uma imagem no conteúdo de matriz extracelular da válvula cardíaca murina, mas apenas na forma de imagens 2D, e são incapazes de descrever sua arquitetura 3D7,8. Além disso, a válvula cardíaca é espacial e temporalmente heterogênea, dificultando a tiração de conclusões entre experimentos relativos à organização do ECM se a amostragem e a conformação não forem corrigidas. Métodos convencionais de caracterização 3D, como ressonância magnética ou ecocardiografia 3D, não fornecem a resolução necessária para resolver os componentes ECM9,10.
Este trabalho detalha um fluxo de trabalho totalmente correlativo onde a heterogeneidade temporal devido ao ciclo cardíaco foi abordada pela fixação da conformação do Pv murina com pressão transvalvular hidrostática. A heterogeneidade espacial foi controlada precisamente por regiões de amostragem de interesse e registro de conjuntos de dados de diferentes modalidades de imagem, especificamente μCT e microscopia eletrônica de varredura facial de blocos seriais, em diferentes escalas de comprimento. Este método de exploração com μCT para orientação da amostragem a jusante foi proposto anteriormente, mas como a válvula pulmonar apresenta variação temporal, foi necessário um nível adicional de controle no nível cirúrgico11.
Estudos in vivo descrevendo a biomecânica da válvula cardíaca murina são esparsas e, em vez disso, dependem de modelos computacionais ao descrever o comportamento de deformação. É de fundamental importância que os dados extracelulares locais sobre a escala de comprimento do nanômetro estejam relacionados com a geometria e localização da válvula cardíaca. Isso, por sua vez, fornece distribuições quantificáveis e espacialmente mapeadas de proteínas ECM que contribuem mecanicamente, que podem ser utilizadas para reforçar os modelos de válvula cardíaca biomecânica existentes12,13,14.

<table><tbody><tr><td>25% glutaraldeído (aq)</td><td>EMS</td><td>16210</td><td>Componente fixador primário</td></tr><tr><td>0,9% de injeção de cloreto de sódio</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>200 etanol à prova</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 22G</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>torneira de 3 vias</td><td>Smiths Medical ASD, Inc.</td><td></td><td></td>MX5311L</tr><tr><td>tetróxido de ósmio a 4%</td><td>EMS</td><td>19150</td><td>Componente de coloração</td></tr><tr><td>4% paraformaldeído (aq)</td><td>EMS</td><td>157-4-100</td><td>Componente fixador primário</td></tr><tr><td>Hemostático absorvível</td><td>Ethicon</td><td>1961</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>EMS</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de monofilamento de poliamida preta, 10-0</td><td>AROSurgical instruments Corporation</td><td></td><td></td>TI38402</tr><tr><td>Sutura de monofilamento de poliamida preta, 6-0</td><td>AROSurgical instruments Corporation</td><td>SN-1956</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 camundongos</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>Aproximadamente 1 ano</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de cálcio Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Pinça aplicando pinça</td><td>FST</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de ponta de algodão</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fórceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 fórceps</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 pinça fina</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan resina ACM</td><td>EMS</td><td>14040</td><td>Para embutir</td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Heliscan microCT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Micro-CT</td></tr><tr><td>Injeção de cloridrato de cetamina</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-84-8</td><td>Componente de coloração</td></tr><tr><td>Nitrato de chumbo</td><td>EMS</td><td>17900</td><td>Componente de coloração</td></tr><tr><td>detector de retrodifusão de baixo vácuo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VSDBS</td><td>Detector de retrodifusão SEM</td></tr><tr><td>Pinça Micro-adson</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millex-GP, 0,22 um, PES 33mm, EMD não estéril</td><td>Millipore</td><td>SLGP033NS</td><td></td></tr><tr><td>Non-woven songes</td><td>McKesson Corp.</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>Hexacianoferrato de potássio (II) trihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14459-95-1</td><td>Componente de coloração</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Linha de monitoramento de pressão</td><td>Smiths Medical ASD, Inc.</td><td>Solução salina MX562</td><td></td></tr><tr><td>(cloreto de sódio estéril a 0,9%)</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-0138-22</td><td></td></tr><tr><td>Tamanho 3 Cápsula BEEM</td><td>EMS</td><td>69910-01</td><td>Recipiente de incorporação</td></tr><tr><td>Cacodilato de sódio trihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6131-99-3</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Retractores Solibri</td><td>FST</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Revestidor por pulverização catódica, carbono e feixe de elétrons</td><td>Leica</td><td>EM ACE600</td><td>Revestimento de ouro</td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbohidrazida (TCH)</td><td>EMS</td><td>21900</td><td>Componente de coloração</td></tr><tr><td>Tish porta-agulhas/pinça</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Aparador</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>Componente de coloração</td></tr><tr><td>Volumescope microscópio eletrônico de varredura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VOLUMESCOPESEM</td><td>Microscópio eletrônico de varredura facial de bloco serial</td></tr><tr><td>Solução estéril de xilazina</td><td>Akorn Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

cirurgia e processamento de amostras para imagem correlativa da válvula pulmonar murina

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

As causas subjacentes da doença relacionada à válvula cardíaca (HVD) são evasivas. Os modelos animais murinos fornecem uma excelente ferramenta para estudar HVD, no entanto, a perícia cirúrgica e instrumental necessária para quantificar com precisão a estrutura e a organização em múltiplas escalas de comprimento têm prejudicado seu avanço. Este trabalho fornece uma descrição detalhada da dissecção de murina, coloração em bloco, processamento de amostras e procedimentos de imagem correlativo para a representação da válvula cardíaca em diferentes escalas de comprimento. A pressão transvalvular hidrostática foi usada para controlar a heterogeneidade temporal fixando quimicamente a conformação da válvula cardíaca. A tomografia microcomputada (μCT) foi usada para confirmar a geometria da válvula cardíaca e fornecer uma referência para o processamento da amostra a jusante necessária para a microscopia eletrônica de varredura facial do bloco serial (SBF-SEM). Imagens sem em série de alta resolução da matriz extracelular (ECM) foram tiradas e reconstruídas para fornecer uma representação 3D local de sua organização. Os métodos de imagem μCT e SBF-SEM foram então correlacionados para superar a variação espacial através da válvula pulmonar. Embora o trabalho apresentado seja exclusivamente sobre a válvula pulmonar, essa metodologia poderia ser adotada para descrever a organização hierárquica em sistemas biológicos e é fundamental para a caracterização estrutural em múltiplas escalas de comprimento.

A anastomose da artéria pulmonar à tubulação de pressurização é mostrada na Figura 1A. Após a aplicação da pressão hidrostática, o tronco pulmonar distends radialmente(Figura 1B) indicando que os folhetos da válvula pulmonar estão em uma configuração fechada. A conformação da válvula pulmonar foi confirmada por μCT. Neste caso, os folhetos foram coapt (fechado) e o anulo foi circular(Figura 2A). Figura 2B</stron...

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho correlativo para a excisão, pressurização, fixação e imagem da válvula pulmonar murina para determinar a conformação bruta e as estruturas da matriz extracelular local.

Cirurgia e Processamento de Amostras para Imagem Correlativa da Válvula Pulmonar Murina

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Este protocolo é significativo porque é projetado para responder perguntas sobre a função estrutural correlaciona da válvula pulmonar murina, o que é geralmente complicado devido à sua heterogeneidade inerente. A fixação controlada e a imagem correlativa foram utilizadas para capturar a estrutura em múltiplas escalas de comprimento. Imagens locais de alta resolução podem então ser mapeadas de volta para o local anatômico preciso na válvula pulmonar.O médico que demonstrará o procedimento será o Dr. Tai Yi, diretor de Microcirurgia do Centro de Medicina Regenerativa do Hospital Infantil Nacional. Comece autoclavando as ferramentas necessárias para a dissecção do mouse, incluindo tesoura fina, microforceps, grampos microvasculares, fórceps de fixação, suportes de microavalente, tesoura de mola e retrações. Depois de eutanásia de um rato C57BL/6 adulto, coloque-o em uma posição dorsal recumbent em uma bandeja, fixe seus membros com fita e realize a toracotomia.Exponha o coração removendo qualquer excesso de tecido adiposo e fáscia, em seguida, remova o átrio direito e persutilize o ventrículo esquerdo com solução salina de temperatura ambiente. Remova todo o coração cortando a veia cava superior, veia cava inferior, artéria pulmonar e aorta, e corte aproximadamente dois milímetros acima da junção ventriculoatrial, que servirá como o conduíte para pressurização. Remova os ventrículos esquerdo e direito para expor as câmaras à pressão atmosférica, garantindo que a estrutura pulmonar do tronco não seja afetada pela remoção dos ventrículos.Tubo de pressurização anastomose com a artéria pulmonar, deixando uma distância de aproximadamente um milímetro entre a junção sinotubular e a extremidade da tubulação para acomodar grandes movimentos dos folhetos e tronco pulmonar. Eleve o reservatório a uma pressão fisiológica análoga e preencha-o com a solução salina. Teste o sistema de fluxo para garantir que não haja bloqueios ou bolhas de ar.Conecte uma torneira à válvula pulmonar anastomosa e garanta o fluxo adequado através da tubulação, comutando o trato de saída. Uma vez que o fluxo seja suficiente, troque a vazão para a válvula pulmonar anastomosa e garanta a pressurização do tronco pulmonar identificado pela distensão do tronco. Após a confirmação da pressurização do tronco pulmonar, incorpore gradualmente a solução fixativa primária até que 25% da capacidade do reservatório da solução salina seja expurgada.Coloque uma gaze fixada sobre a amostra de tecido para evitar a secagem. Perfunda o fixador por três horas, reabastecendo o reservatório para manter uma pressão constante. Após a perfusão, armazene a válvula cardíaca na solução fixativa a quatro graus Celsius até usar por até uma semana.Para coloração, lave a amostra fixa da válvula cardíaca três vezes com tampão de cacodilato molar frio de 0,15 por cinco minutos e submerse completamente a válvula cardíaca em uma solução de ferrocineto de potássio de 1,5 potássio, 0,15 cacodilato molar, dois cloreto de cálcio milimolar e 2% de tetroxida de ódio no gelo por uma hora. Lave as amostras com água destilada dupla à temperatura ambiente colocando-as em um tubo por cinco minutos com leve agitação. Depois de mais três lavagens, coloque a amostra em solução de tiocarbohydrazida filtrada à temperatura ambiente.Após 20 minutos, lave a amostra três vezes com água como demonstrado anteriormente. Em seguida, coloque a amostra em 2% de tetroxida de ósmio à temperatura ambiente. Após 30 minutos, lave-a com água três vezes por cinco minutos cada e incubar a amostra em acetato de 1%uranyl durante a noite a quatro graus Celsius.Enquanto isso, prepare uma solução de nitrato de chumbo. No dia seguinte, realize a etapa de lavagem três vezes como demonstrado anteriormente, em seguida, incubar o tecido da válvula cardíaca na solução de aspartato de chumbo a 60 graus Celsius por 30 minutos. Lave as amostras mais três vezes, depois realize um tratamento de desidratação em série nos tecidos da válvula cardíaca com 20, 50, 70 e 90% de etanol no gelo por cinco minutos cada, seguido por dois tratamentos subsequentes com 100% de etanol.Após a desidratação, mova os tecidos para acetona gelada e coloque-o em acetona fresca à temperatura ambiente por 10 minutos. Para incorporar, faça a mistura de resina de acordo com as especificações do fabricante. Coloque tecidos em tratamentos subsequentes de 25 a 75, 50 a 50 e 75 a 25 resina à mistura de acetona por duas horas cada.Por fim, coloque os tecidos em 100% de resina durante a noite. No dia seguinte, coloque tecidos em resina fresca de 100%. Após duas horas, transfira os tecidos para uma cápsula de incorporação, adicione resina fresca de 100% e coloque-a em um forno Celsius de 60 graus por 48 horas para curar.A artéria pulmonar anastomosada excizada antes e seguindo a aplicação da pressão hidrostática é mostrada aqui. O tronco pulmonar distends radialmente indicando que os folhetos da válvula pulmonar estão em uma configuração fechada. A tomografia microcomputada confirmou a confirmação da válvula pulmonar.Os folhetos foram fechados e o anulô foi circular enquanto foram observados graus variados de pressurização inadequada da válvula pulmonar por fixação ou colapso arterial. O volume micro CT que renderiza seções transversais virtuais foi correlacionado com imagens ópticas para confirmar a direção e localização do corte. Imagens SBF SEM de alta resolução foram tiradas em uma região local dentro de um folheto quando o bloco de espécimes estava no local e orientação desejados.Imagens correlacionadas entre o volume micro CT que renderiza fatia virtual, imagens SBF SEM de baixa resolução e alta resolução são mostradas aqui. Na representação 3D de uma região segmentada da válvula pulmonar, podem ser identificados componentes extracelulares como células endoteliais, células intersticiciais valvulares e fibras extracelulares. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que realizar a pressurização é fundamental e garantirá que o rendimento seja o mais alto possível.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

Alta freqüência de ultra-som Doppler é uma nova tecnologia para avaliar a função miocárdica regional. Este trabalho apresenta primeira evidência demonstrando aplicabilidade desta plataforma de imagem versátil para a medida repetida de tensão do miocárdio, dp / dt, e regurgitação mitral na isquemia-reperfundidos coração (IR) murina.

De alta freqüência Ecocardiografia de alta resolução: primeira evidência de não-invasivos Medida repetida de Strain miocárdico, contratilidade, e regurgitação mitral no coração Isquemia-reperfundidos murino

Neste vídeo, descrevemos o procedimento para isolar e fixar quimicamente o valor pulmonar do camundongo em conformação fechada por meio de pressurização de perfusão.

Fixação por pressão da valva pulmonar murina isolada: um procedimento para isolar e fixar quimicamente a valva pulmonar de camundongo em conformação fechada

Ventrículo direito (VD) disfunção é fundamental para a patogênese da doença cardiovascular, ainda metodologias limitados estão disponíveis para a sua avaliação. Recentes avanços em ultra-sonografia fornecer uma opção não invasiva e precisas para o estudo RV longitudinal. Aqui, temos um método ecocardiográfico passo-a-passo através de um modelo murino de sobrecarga de pressão RV detalhes.

Avaliação da Estrutura e Função do Ventrículo Direito em modelo de camundongo Pulmonary Artery constrição por Ecocardiografia transtorácica

De modo a compreender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes neotissue formação e desenvolvimento de estenose em válvulas cardíacas de engenharia de tecidos, foi desenvolvido um modelo murino de transplante heterotópico de válvula cardíaca. A válvula cardíaca pulmonar foi transplantado para destinatário usando o coração técnica de transplante heterotópico.

O transplante de válvula pulmonar Usando um modelo do rato de Heterotópica Transplante de Coração

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da abordagem ecocardiográfica para fenotipagem abrangente do coração e da função da válvula cardíaca em camundongos.

Abordagens ecocardiograma e protocolos de Comprehensive Caracterização fenotípica de doença cardíaca valvular em ratos

Aqui, nós fornecemos uma aproximação útil para estudar o mecanismo da falha ventricular direita. Uma aproximação mais conveniente e mais eficiente à constrição da artéria pulmonaa é estabelecida usando instrumentos cirúrgicos feitos inhouse. Além disso, são fornecidos métodos para avaliar a qualidade dessa abordagem por ecocardiografia e cateterismo.

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Um modelo de roedor de sobrecarga de volume do coração esquerdo da regurgitação mitral é relatado. A regurgitação mitral da gravidade controlada é induzida pelo avanço de uma agulha de dimensões definidas no folheto anterior da válvula mitral, em um coração pulsante, com orientação de ultrassom.

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Apresentado aqui é um protocolo para preservar a contração vascular do tecido pulmonar murino PCLS, resultando em uma imagem tridimensional sofisticada da vasculatura pulmonar e das vias aéreas, que pode ser preservada por até 10 dias suscetíveis a inúmeros procedimentos.

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Este protocolo demonstra isolamento guiado por microscopia e coloração por imunofluorescência de veias pulmonares murinas. Preparamos amostras de tecido contendo o átrio esquerdo, veias pulmonares e pulmões correspondentes e as coramos para troponina cardíaca T e Conexina 43.

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Descrevemos um modelo murino de sobrecarga de pressão do ventrículo direito induzida por bandagem do tronco pulmonar. Protocolos detalhados para intubação, cirurgia e fenotipagem por ecocardiografia estão incluídos no artigo. Instrumentos feitos sob medida são usados para intubação e cirurgia, permitindo uma reprodução rápida e barata do modelo.

Um modelo murino de hipertrofia ventricular direita induzida por sobrecarga de pressão e falha por bandagem do tronco pulmonar

Aprenda a caracterização estrutural multiescala da válvula pulmonar murina usando fixação hidrostática controlada e imagem correlativa por μCT e SBF-SEM. Este protocolo integrado preserva a conformação fisiológica e mapeia dados ultrastruturais de alta resolução para locais anatômicos precisos.

Cirurgia e Processamento de Amostras para Imagem Correlativa da Válvula Pulmonar Murina

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