Name: Secção óptica e visualização do disco intervertebral do desenvolvimento embrionário à degeneração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda a técnica de secção óptica para visualizar a organização tridimensional de condrócitos no disco intervertebral humano e bovino. Este método revela padrões celulares desde o desenvolvimento embrionário até à degeneração.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos aos nossos coautores das publicações originais pela ajuda e apoio. Agradecemos a Charlotte Emma Bamberger por ajudar a adquirir as imagens do apotome.

Para a análise do desenvolvimento embrionário e da maturação, foram utilizados discos bovinos. Para avaliar a degeneração do IVD, foram analisadas amostras humanas.
O tecido IVD humano foi obtido de pacientes submetidos a cirurgia para degeneração de disco lombar, prolapso discal ou trauma espinhal no Departamento de Cirurgia Ortopédica, Hospital Universitário de Tübingen e no Bg Trauma Centre Tübingen. A aprovação completa do comitê ético foi obtida antes do início do estudo (projeto número 244/2013BO2). O consentimento informado por escrito foi recebido de todos os pacientes antes da participação. Os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.
O tecido bovino foi obtido do Escritório estadual da Baviera para Saúde e Segurança Alimentar/Oberschleißheim e de uma fábrica de renderização em Warthausen (Alemanha). A aprovação das autoridades locais e veterinárias foi recebida para tecidos de animais mortos.
1. Colheita de amostras
<ol><li>Tecido IVD humano: Coloque amostras de IVD obtidas intraoperativamente imediatamente no DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco com 2% (v/v) de penicilina-estreptomicina e 1,2% de (v/v) anfotericina B. Armazenar a 4 °C até novo processamento. Processe o tecido dentro de 48 h. Alternativamente, armazene os tecidos a -20 °C por várias semanas.</li>
	<li>Tecido bovino IVD: Certifique-se de colher o tecido dos animais dentro de 24 horas após a morte. Ressecção dos discos bovinos com as vértebras circundantes dos animais mortos em bloco. Transporte o tecido congelado em gelo seco e armazene a -20 °C até que seja mais processamento. NOTA: Se apenas forem pretendidas análises de fluorescência e não forem planejados outros métodos de quantificação bioquímica, como ELISA ou PCR, realize a fixação tecidual conforme explicado abaixo. Isso permite manter o tecido mais tempo armazenado antes que ele precise ser processado. Para evitar a deterioração da matriz tecidual, realize a fixação dentro de 48 horas após a colheita, a menos que o tecido seja congelado diretamente.</li>
</ol>2. Preparação da amostra
<ol><li>Descongele o tecido congelado à temperatura ambiente. Processe o tecido assim que nenhum cristal de gelo puder ser sentido mais sobre a compressão digital suave do tecido. NOTA: Realize a preparação do tecido em DMEM em uma placa de Petri.</li>
	<li>Identificar a origem do tecido IVD humano (ânulo fibroso, zona intermediária, núcleo pulposus ou placa final cartilaginosa) com base em propriedades macroscópicas como densidade e orientação de colágeno.</li>
	<li>Pegue o segmento de movimento consistindo do disco IVD bovino com suas duas vértebras adjacentes e disseque o disco como um todo do osso subcondral usando uma lâmina cirúrgica (número da lâmina 15).<ol>
<li>Use duas fórceps anatômicas para virar o disco para alcançar áreas mais centradas. Faça a dissecação. Certifique-se de ressecção do núcleo pulposus por último, pois é muito mais fino que o ânulo, propenso a rasgar, e ele não sai de forma definida facilmente.</li>
		<li>Identifique as diferentes áreas da cartilagem.</li>
		<li>Corte a área de interesse de todo o disco usando uma lâmina cirúrgica (lâmina número 20 ou 22). Alternativamente, use uma lâmina criotome. NOTA: Como os discos bovinos vêm em bloco como parte da coluna vertebral, os discos podem ser preparados in-toto. Isso facilita muito a identificação correta dos diferentes tipos de cartilagem. Ao dissecar o disco na forma descrita acima, a placa endplataática cartilaginosa permanece nas vértebras. Se esta área for investigada, é melhor tirar o osso subjacente com um cinzel trabalhando em uma direção tangencial ligeiramente dobrada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No caso de os embriões serem de um comprimento de coroa-garupa de menor que 20 cm, certifique-se de processar os embriões no toto para preservar a arquitetura tecidual do IVD. Não realize nenhuma dissecção das vértebras nesses casos.</li>
	<li>Uma vez que o disco tenha sido ressecado in-toto, identifique as diferentes áreas da cartilagem.<ol>
<li>Realize a decalcificação no ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) (20% (w/v); pH = 7,4) à temperatura ambiente. Escolha o volume dependendo do tamanho da amostra - todo o tecido deve estar bem coberto com EDTA.</li>
		<li>Altere a solução de decalcificação diariamente que pode ir por até 5 dias, dependendo do tamanho do tecido.</li>
		<li>Verifique se a decalcificação é bem sucedida com uma agulha calibre 20 que penetra as vértebras sem resistência notável. NOTA: A mudança diária da solução de descalcificação é importante para evitar que o fichário de quela por saturação seja para manter a efeitoa de reação. Também previne a colonização bacteriana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Classificação da idade amostral, integridade e degeneração
<ol><li>Classificar o tecido do disco humano em uma das cinco categorias seguintes com a ajuda de informações clínicas, bem como raio-X e ressonância magnética18 (Figura 3). NOTA: Categoria I: Servir como ânulo de amostra quase saudável sem qualquer sinal radiológico de degeneração intravenosa derivada de trauma espinhal agudo. Categoria II: Para ilustrar uma situação de inflamação aguda com início da degeneração, use tecido da zona intermediária de pacientes com sintomas clínicos com duração inferior a 4 semanas. Categoria III: Descrever uma situação em que a reação inflamatória já tinha tido tempo de afetar o tecido e as células tiram tecido de pacientes que foram operados para um prolapso nuclear, mas com duração do sintoma superior a 4 semanas. Categoria IV: Para degeneração discal moderada selecione ânulo obtido de cirurgia com fusão intercorpo para doença discal degenerativa com pontuação de Pfirrmann de 3 ou 4 em ressonância magnética19. Categoria V: Para o processo de degeneração em estágio final anulus obtido de cirurgia com fusão intercorpo para doença discal degenerativa com pontuação pfirrmann de 5.</li>
	<li>Classificar o tecido bovino com base no estágio/idade do animal em uma das oito categorias, conforme apresentado na Tabela 1.<ol>
<li>Calcule a idade de gestação no comprimento da coroa-garupa dos embriões com base na fórmula sugerida por Keller: Idade gestacional em meses = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62594/62594eq1v3.jpg"> NOTA: Animais nas primeiras 4 semanas de gestação apresentam um comprimento de coroa-garupa de 0,8-2,2 cm20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Fixação de tecidos
<ol><li>Fixar as amostras em 10x o volume da amostra de 4% (p/v) solução de formaldeído em salina tamponada de fosfato (PBS) durante a noite a 4 °C. NOTA: A solução de formaldeído penetra tecido a uma taxa de cerca de 1 mm/hora de cada direção. Para amostras muito pequenas ou muito grandes, um ajuste do tempo de exposição poderia ser necessário.</li>
	<li>Armazene o tecido em PBS a 4 °C até que seja mais processamento.</li>
</ol>5. Secção histológica
<ol><li>Incorpore as amostras em meio de incorporação solúvel em água no botão criotome.<ol>
<li>Coloque o tecido sobre o botão de tal forma que um plano axial seja gerado ou um plano que corte o colágeno tipo I lamellae perpendicular (por exemplo, um plano de secção sagital mediana). NOTA: O tecido deve estar totalmente coberto pelo meio de incorporação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se sectionia o tecido incorporado a uma espessura de 70 μm em amostras humanas e 40 μm em amostras bovinas usando um criotome padrão. NOTA: A diferença na espessura da seção deve-se à diferença na integridade do tecido entre o disco bovino intacto e o tecido humano altamente degenerado.</li>
	<li>Colete as seções em um slide de vidro.<ol>
<li>Cerque as seções teciduais com uma caneta hidrofóbica.</li>
		<li>Enxágüe as seções 3 vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para remover o meio de incorporação solúvel em água.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Mancha de fluorescência
<ol><li>Adicione 60 μL de 1% (v/v) de DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) bem como 1% (v/v) de coloração actin tracking (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) em PBS e incubar por 5 min a temperatura ambiente. NOTA: O protocolo de coloração descrito aqui é visualizar o núcleo usando a coloração nuclear DAPI (azul) e o citoplasma usando Actin Tracking Stain (vermelho). O IVD tem uma forte autofluorescência devido às fibras de colágeno no canal verde. A quantidade de fluido adicionada às seções deste protocolo destina-se a seções de um tamanho de cerca de 5 mm x 5 mm. Para seções maiores, essa quantidade precisa ser aumentada em conformidade. Realize todos os trabalhos em salas sem exposição direta à luz solar e com luzes escurecidas para evitar branqueamento do corante.</li>
	<li>Remova o fluido de coloração com uma pipeta e lave três vezes com 60 μL de PBS cada vez.</li>
	<li>Adicione um meio de montagem adequado e cubra as seções com um deslizamento de cobertura. NOTA: Certifique-se de que não há bolhas de ar presas ao adicionar o deslizamento de cobertura. Isso é melhor feito iniciando o contato do deslizamento com o slide em uma borda e, em seguida, deixe o deslizamento descer lentamente.</li>
</ol>7. Imagem e processamento microscópicos
<ol><li>Coloque um slide com uma seção manchada no suporte de amostra do microscópio. NOTA: Devido à densa rede de colágeno tipo I do IVD, a luz dispersa dificulta o visual do tecido usando microscopia de fluorescência convencional. Uma maneira de resolver esse problema é realizar seção óptica usando iluminação estruturada. Isso também permite tornar uma projeção tridimensional de toda a amostra em ambos os canais (azul e vermelho). Isso é melhor feito usando o ajuste de iluminação estruturada e o modo Mosaico com uma lente objetiva de ampliação de 10x para obter uma visão geral da amostra, bem como reconstruções 3D de padrões individuais.</li>
	<li>Inicie o dispositivo de iluminação estruturado.<ol>
<li>Realize imagens de campo de visão única com um microscópio de fluorescência adequado, filtros de fluorescência e iluminação adequada. NOTA: Ajuste o tempo de exposição de todos os filtros utilizados para padronizar a aquisição de imagens. Para obter uma representação precisa da amostra em uma imagem de maior resolução, as seções com maior ampliação (por exemplo, objetivo de 20x).</li>
		<li>Pós-processo as imagens otimizando a intensidade e o brilho usando um software de otimização de imagem compatível com o microscópio de fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para visualizar a seção como um todo use a técnica de imagem de mosaico<ol>
<li>Abra as configurações de aquisição (pressione em 6D- Aquisição)a partir do painel da barra de ferramentas.</li>
		<li>Ajuste as configurações do mosaico (no Registro MosaiX) e defina o número de colunas e linhas de imagens de campo de exibição que serão posteriormente incorporadas a uma imagem de visão geral.</li>
		<li>Pressione a configuração e ajuste a correção do foco das telhas individuais. NOTA: É quase impossível para uma grande seção de tecido ter toda a superfície do tecido em um único plano de foco. As telhas de imagem em diferentes níveis focais podem ser tomadas pela 'Aquisição MosaiX'.</li>
		<li>Para iniciar a aquisição das telhas de imagem, pressione Start.</li>
		<li>Costure os azulejos imaged usando a função de costura (botãode costura) com 20% de sobreposição incorporada no software.</li>
		<li>Pós-processo as imagens otimizando a intensidade e o brilho usando um software de otimização de imagem compatível com o microscópio de fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para analisar a organização do condrocito espacial, utilize a função 3D incorporada no software.<ol>
<li>Ajuste as configurações de pilha z. Defina os parâmetros de digitalização: defina as posições de partida e parada no eixo z e a distância da fatia ativando o botão Iniciar/Parar. NOTA: O software calcula automaticamente o número de fatias.</li>
		<li>Para iniciar a aquisição das pilhas z de imagem, pressione Start.</li>
		<li>Pós-processo as imagens otimizando a intensidade e o brilho usando um software de otimização de imagem compatível com o microscópio de fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exporte as imagens com um formato de arquivo compatível com o software de processamento de imagens. NOTA: Exporte as reconstruções 3D como imagens individuais ou/e como um modelo 3D interativo ou em formato de vídeo.</li>
</ol>8. Identificação de padrões celulares e avaliação de densidade
<ol><li>Abra as imagens de mosaico exportado de toda a seção de tecido em um programa apropriado de processamento de imagens.</li>
	<li>Defina as áreas submetidas à avaliação da densidade celular definindo regiões de interesse de 500 μm x 500 μm nas imagens. NOTA: Todas as telhas que não possuem qualidade de imagem adequada são excluídas da análise.</li>
	<li>Identifique padrões celulares individuais. NOTA: As células únicas são definidas como células individuais - totalmente encapsuladas dentro da matriz adjacente. Os pares são definidos como duas células adjacentes próximas (&lt;25 μm) em que as células estão interconectadas através de suas matrizes (ver Figura 2). As formações de cordas são pelo menos três condrócitos alinhados na linha (do meio dos núcleos &lt;25 μm). Essas células são englobadas por uma matriz intacta e interconexões matriciais podem ser vistas entre cada célula. Os clusters representam múltiplas células que estão localizadas em proximidade direta entre si (&lt;25 μm) e são encapsuladas em uma grande lacuna desprovida de matriz.</li>
	<li>Use um plug-in de contagem de células para a análise quantitativa dos padrões celulares. NOTA: A coloração do citoplasma representa um método de verificação para identificar os diferentes padrões espaciais.</li>
	<li>Calcule a densidade celular dividindo as células contadas pelo tamanho da região de interesse escolhida.</li>
</ol>

<ol><li>Urban, J. P. G., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+the+intervertebral+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Degeneration of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).</li>
<li>Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiographic+evaluation+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Radiologic+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Radiographic evaluation of osteoarthritis.</a> Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).</li>
<li>Pye, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+disc+degeneration%3A+association+between+osteophytes%2C+end-plate+sclerosis+and+disc+space+narrowing%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).</li>
<li>Humzah, M. D., Soames, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intervertebral+disc%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Human intervertebral disc: structure and function.</a> The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).</li>
<li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle%2C+but+not+knee+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li>
<li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li>
<li>Felka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+spatial+organization+and+destruction+of+the+pericellular+matrix+in+early+osteoarthritis+in+vivo+and+in+a+novel+in+vitro+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).</li>
<li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+preclinical+osteoarthritis%3A+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li>
<li>Aicher, W. K., Rolauffs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+organization+of+joint+surface+chondrocytes%3A+review+of+its+potential+roles+in+tissue+functioning%2C+disease+and+early%2C+preclinical+diagnosis+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).</li>
<li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409(2019).</li>
<li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organization+in+osteoarthritic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li>
<li>Tschaikowsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof-of-concept+for+the+detection+of+early+osteoarthritis+pathology+by+clinically+applicable+endomicroscopy+and+quantitative+AI-supported+optical+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).</li>
<li>Ciapetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+observation+of+human+intervertebral+disc+tissue+and+cells+isolated+from+degenerated+intervertebral+discs%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%3A+Official+Publication+of+the+European+Spine+Society%2C+the+European+Spinal+Deformity+Society+and+the+European+Section+of+the+Cervical+Spine+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs.</a> European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, Suppl 1 10(2012).</li>
<li>Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cluster+formation+in+degenerate+lumbar+intervertebral+discs+is+associated+with+increased+disc+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation.</a> Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).</li>
<li>Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+runt+cow+lumbar+intradiscal+pressures+and+motion+segment+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Spine+Journal%3A+Official+Journal+of+the+North+American+Spine+Society%22%5BJournal%5D)">Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).</li>
<li>Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+in+vivo+measurements+of+pressures+in+the+intervertebral+disc+in+daily+life%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life.</a> Spine. 24 (8), Phila Pa. 755-762 (1999).</li>
<li>Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+and+limitations+of+using+the+bovine+tail+as+a+model+for+the+human+lumbar+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine.</a> Spine. 29 (24), Phila Pa. 2793-2799 (2004).</li>
<li>Hofmann, U. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+death+after+mechanically+overloading+degenerated+human+intervertebral+disk+explants+is+associated+with+a+structurally+impaired+pericellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).</li>
<li>Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+classification+of+lumbar+intervertebral+disc+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration.</a> Spine. 26 (17), Phila Pa. 1873-1878 (2001).</li>
<li>Habermehl, K. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHabermehl%2C+KH+%22Die+Altersbestimmung+bei+Haus-+und+Labortieren%22">Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren</a>. , Paul Parey. Berlin, Hamburg. (1975).</li>
<li>Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+changes+of+the+pericellular+matrix+and+spatial+chondrocyte+organization-Two+highly+interconnected+hallmarks+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).</li>
<li>Bonnaire, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intervertebral+disc+from+embryonic+development+to+disc+degeneration%3A+insights+into+spatial+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Spine+Journal%3A+Official+Journal+of+the+North+American+Spine+Society%22%5BJournal%5D)">The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198(2021).</li>
<li>Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+among+gestation+length+and+health%2C+production%2C+and+reproduction+in+Holstein+cows+and+implications+for+their+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring.</a> Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).</li>
<li>Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Entwicklung+des+schwarzbunten+Niederungsrindes+von+der+Geburt+bis+zum+5.+Lebensjahr+mit+variationsstatistischen+Untersuchungen+einer+Population+solcher+Rinder+von+der+Geburt+bis+zum+3.+Lebensjahr%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Tierz%C3%BCchtung+und+Z%C3%BCchtungsbiologie%22%5BJournal%5D)">Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr.</a> Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).</li>
<li>Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nucleus+of+the+Intervertebral+Disc+from+Development+to+Degeneration1%5BTitle%5D)+AND+%22American+Zoologist%22%5BJournal%5D)">The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1.</a> American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).</li>
<li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration%3A+pain+and+disc+content%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li>
<li>Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+intervertebral+disc+injury+leads+to+organ+level+changes+in+structure%2C+cellularity%2C+and+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).</li>
<li>Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annulus+fibrosus+cell+phenotypes+in+homeostasis+and+injury%3A+implications+for+regenerative+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).</li>
<li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+remodeling+of+the+spatial+organization+of+human+superficial+chondrocytes+distant+from+focal+early+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).</li>
<li>Johnson, W. E., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rumours+of+my+death+may+have+been+greatly+exaggerated%27%3A+a+brief+review+of+cell+death+in+human+intervertebral+disc+disease+and+implications+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy.</a> Biochemical Society Transactions. 35, Pt 4 680-682 (2007).</li>
<li>Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disc+morphology+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Disc morphology in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 30, Pt 6 864-869 (2002).</li>
<li>Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cell+clusters+in+intervertebral+disc+degeneration+and+its+relevance+behind+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+Research%22%5BJournal%5D)">The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair.</a> Spine Research. 03, 15(2017).</li>
<li>Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disc+cell+clusters+in+pathological+human+intervertebral+discs+are+associated+with+increased+stress+protein+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%3A+Official+Publication+of+the+European+Spine+Society%2C+the+European+Spinal+Deformity+Society+and+the+European+Section+of+the+Cervical+Spine+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining.</a> European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).</li>
<li>Freemont, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+pathobiology+of+the+degenerate+intervertebral+disc+and+discogenic+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain.</a> Rheumatology. 48 (1), Oxford. 5-10 (2009).</li>
<li>Müllers, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+F-actin+alterations+in+adherent+human+mesenchymal+stem+cells%3A+Influence+of+slow-freezing+and+vitrification-based+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation.</a> PLoS One. 14 (1), 0211382(2019).</li>
<li>McCann, M. R., Séguin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord+cells+in+intervertebral+disc+development+and+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration.</a> Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Utilizando microscopia de fluorescência aumentada por imagem de mosaico e seção óptica, avaliamos o arranjo espacial de condrocitos no ânulo do IVD lombar durante o desenvolvimento, maturação e degeneração. Enquanto o tecido degenerativo poderia ser colhido de pacientes que receberam cirurgia na coluna para degeneração do disco, a análise do período embrionário e da fase de maturação exigiu o uso de um organismo modelo (bovino). Altas densidades celulares foram notadas no ânulo durante o desenvolvimento embrionário preco...

O disco intervertebral (IVD) é uma estrutura baseada em cartilagem que bioquimicamente e com relação à arquitetura celular, à primeira vista, se assemelha em muitos aspectos à cartilagem articular1. De fato, tanto a degeneração do IVD quanto a osteoartrite (OA) da cartilagem articular são caracterizadas pelo estreitamento do espaço articular devido ao desgaste da cartilagem, formação de cisto subcondral e osteofita, e esclerose subcondral2,3. Apesar dessas semelhanças, a arquitetura e o papel funcional de ambos os tecidos diferem. Enquanto a matriz da cartilagem articular é formada principalmente por uma rede de colágeno formadora de arcade tipo II, o IVD consiste em três tipos diferentes de tecido: o núcleo pulposus rico em colágeno no centro ocupa cargas axiais e as transmite para um anel abrangente de fibras de colágeno circular densamente embaladas tipo I, que é chamado de fibroso anuloso. Sua função é absorver as pressões axiais traduzidas recebidas pelo núcleo proteoglycano e rico em água com sua resistência à fibra longitudinal. Na parte superior e inferior de cada núcleo e anulus uma placa endplata-tolina cartilaginosa hialina forma a junção com as vértebras adjacentes4 (Figura 1).
Na cartilagem articular, podem ser encontrados quatro padrões de condácito espacial distintos: pares, cordas, cordas duplas, pequenos aglomeradosgrandes 5,6,7 (Figura 2). Alterações nesse padrão estão associadas ao início e progressão de OA8,9. A organização de condrócitos espaciais também é indicativa para uma propriedade funcional direta da cartilagem, ou seja, sua rigidez, sublinhando a relevância funcional desta abordagem de classificação baseada em imagem10,11. Esses padrões podem, além disso, ser identificados com a tecnologia já existente clinicamente disponível12. Devido às semelhanças entre o IVD e a cartilagem articular, pode-se supor que padrões de condrocitos característicos também estão presentes no IVD. A formação de aglomerados é um fenômeno também observado no IVD degenerado13,14.
Ao tentar analisar a organização celular espacial no IVD, é necessário superar várias dificuldades técnicas que não estão presentes na investigação da cartilagem articular:
Em primeiro lugar, o processamento do tecido em si é muito mais desafiador do que com a cartilagem hiline homogênea que é em grande parte composta de colágeno tipo II. O principal componente de fibra do IVD é o colágeno tipo I, o que torna muito mais difícil gerar seções histológicas finas. Enquanto na cartilagem articular hialina mesmo seções grossas podem ser facilmente analisadas devido à natureza "semelhante ao vidro" do tecido, a rede de colágeno tipo I do IVD é opticamente altamente impenetrável. Por essa razão, um forte ruído de fundo é um problema comum na histologia do IVD. Uma maneira rápida e barata de penetrar neste tecido opticamente denso é o uso de um dispositivo de seção óptica, por exemplo, por meio de um Apotome. Em tal Apotome, uma grade é inserida na via de iluminação de um microscópio de fluorescência convencional. Na frente da grade é colocada uma placa de vidro paralela do avião. Isso inclina-se para frente e para trás, projetando assim a grade na imagem em três posições diferentes. Para cada posição z, três imagens brutas com a grade projetada são criadas e sobrepostas. Por meio de software especial, a luz fora de foco pode ser calculada. O princípio subjacente é que, se a grade é visível, essa informação está em foco, se não é considerada fora de foco. Com esta técnica, imagens bem focadas e de alta resolução podem ser adquiridas em um período razoável de tempo.
Em segundo lugar, o tecido é difícil de encontrar de doadores humanos. Ao fazer a substituição total do joelho, toda a superfície da articulação pode ser obtida para análise posterior durante a cirurgia. Embora a osteoartrite de uma articulação diarthrodial também seja uma doença de toda a articulação, há, no entanto, fortes diferenças focais na qualidade da cartilagem com geralmente algumas áreas da articulação ainda intactas, por exemplo, devido à redução do carregamento nessa área. Esta situação é diferente no IVD, onde a cirurgia geralmente só é realizada quando o disco é destruído globalmente. Ao obter tecido de doadores humanos da sala de operação, o tecido também é altamente fragmentado e é necessário alocar corretamente o tecido para um dos três tipos de cartilagem do IVD antes de fazer novas análises. Para permitir análises mais detalhadas de seções de tecido também maiores e olhar para o desenvolvimento embrionário do IVD a escolha de um organismo modelo animal é, portanto, necessária.
Ao escolher tal organismo modelo é importante ter um sistema que seja comparável ao disco humano em relação à sua anatomia e dimensões, seu carregamento mecânico, a população celular atual, bem como sua composição tecidual. Para efeitos da técnica apresentada aqui, sugerimos o uso de tecido discado lombar bovino: Uma propriedade crítica do disco humano resultando em seu baixo potencial regenerativo é a perda de células notootordas durante a maturação no núcleo. No entanto, em numerosos organismos modelos, células notochordal podem ser detectadas a vida toda. A maioria dos poucos animais que perdem suas células notochordal, como ovelhas, cabras ou cães de conndrodystrophig, têm um IVD muito menor do que os discos humanos. Apenas discos bovinos lombares apresentam um diâmetro de disco sagital comparável aos dos IVDs humanos15.
Um fator-chave que leva à degeneração precoce do disco é o carregamento mecânico excessivo. As pressões intradiscais de uma vaca em pé na coluna lombar são em torno de 0,8 MPa com a coluna alinhada horizontalmente. Surpreendentemente, essas pressões são comparáveis às pressões intradiscais lombares relatadas para a coluna humana ereto (0,5 MPa)15,16. Além disso, a quantidade de água e proteoglycans em discos bovinos é comparável à do IVD de jovens humanos17. Portanto, embora o padrão real de movimento dos segmentos de movimento possa diferir em animais quadrúpedes do humano bipedal, no que diz respeito ao carregamento total e características do disco, a vaca está muito mais próxima da biologia humana do que outros modelos animais estabelecidos para o IVD, como ovelhas e cães.
Neste protocolo apresentamos uma técnica de como analisar as mudanças no IVD do ponto de vista da organização condrócito espacial desde o desenvolvimento embrionário precoce até a degeneração em estágio final.

<table><tbody><tr><td>Anfotericina B</td><td>Merck KGaA,&nbsp; Alemanha</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de adesão SuperFrost Plus</td><td>R. Langenbrinck, Alemanha</td><td>03-0060</td><td></td></tr><tr><td>ApoTome</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemanha</td><td>462000115</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision Rel. 4.8 com Modul MosaiX</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellMask Actin Tracking Stain</td><td>Thermo Fischer Scientific, US</td><td>A57249</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica Biosystems, EUA</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific, EUA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco, Life Technologies, Alemanha</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>60004</td><td></td></tr><tr><td>Miscoscópio de fluorescência - Axio Observer Z1 com Axio Cam MR3 e Colibri</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemanha</td><td>3834000604</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Merck KGaA,&nbsp; Alemanha</td><td>104002</td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.53a, com plugin de contador de células</td><td>Instituto Nacional de Saúde (NIH), US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin</td><td>Thermo Fischer Scientific, US</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de Cobertura Microscópica</td><td>R. Langenbrinck, Alemanha</td><td>01-1818/1</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen Liquid Blocker</td><td>Science Sevices&nbsp; GmbH, Alemanha</td><td>N71310</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich,US</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>pf medical AG, Alemanha</td><td>2023-01</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Holanda</td><td>SA6255012</td><td></td></tr></tbody></table>

secção óptica e visualização do disco intervertebral do desenvolvimento embrionário à degeneração

Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

A degeneração do disco intervertebral (IVD) é uma das principais causas de dor lombar e implica um alto grau de comprometimento para os indivíduos afetados. Para decodificar a degeneração do disco e ser capaz de desenvolver abordagens regenerativas é essencial uma compreensão completa da biologia celular do IVD. Um aspecto dessa biologia que ainda permanece sem resposta é a questão de como as células são espacialmente dispostas em um estado fisiológico e durante a degeneração. As propriedades biológicas do IVD e sua disponibilidade dificultam a análise desse tecido. O presente estudo investiga a organização do condrócito espacial no ânulo fibroso desde o desenvolvimento embrionário precoce até a degeneração em estágio final. Um método de secção óptica (Apotome) é aplicado para realizar análises de coloração de alta resolução usando tecido embrionário bovino como modelo animal e tecido disc humano obtido de pacientes submetidos a cirurgia na coluna. A partir de uma densidade de condrocitos muito alta no disco bovino embrionário inicial, o número de células diminui durante a gestação, crescimento e maturação. Nos discos humanos, o aumento da densidade celular acompanhou a progressão da degeneração tecidual. Como já havia sido demonstrado na cartilagem articular, a formação de aglomerados representa uma característica característica da degeneração avançada do disco.

Utilizando imagens de mosaico, a arquitetura do IVD com sua densa rede de fibra de colágeno no ânulo e no núcleo mais suave pode ser claramente reconhecida(Figura 4). Uma diminuição contínua da densidade celular pode ser observada durante o desenvolvimento embrionário(Figura 5). Enquanto nos estágios iniciais do desenvolvimento do IVD uma densidade celular de 11.435 células/mm² no ânulo bovino fibroso e 17.426 células/mm² no núcleo bovino pulposo pode ser encont...

Apresentamos um método para investigar a organização do condrócito espacial no ânulo fibroso do disco intervertebral utilizando um método de seção óptica.

Secção óptica e visualização do disco intervertebral do desenvolvimento embrionário à degeneração

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

A degeneração do disco intervertebral leva a um alto grau de comprometimento e dor. Nosso protocolo nos permite investigar o desenvolvimento de discos morfologicamente e suas mudanças na degeneração. A densa rede tipo um de colágeno torna geralmente difícil analisar o Disco Intervertebral por microscopia.Com a secção óptica, podemos investigar o arranjo 3D de condrócitos dentro dos diferentes tecidos. Comece colocando amostras de Disco Intervertebral ou IVD em DMEM complementadas com volume de 2%por volume Penicillin-Streptomycin, e 1,2% de volume por volume A anfotericina B, imediatamente pós-coleta, armazenar amostras de IVD a quatro graus Celsius até um processamento posterior. Se congelado descongelar as amostras de IVD humanos à temperatura ambiente e identificar a origem do tecido IVD humano com base em propriedades microscópicas como;densidade e orientação universitária.Para coletar o tecido do disco bovino, pegue o segmento de movimento constituído pelo IVD com suas duas vértebras adjacentes e usando uma lâmina cirúrgica número 15, disseque todo o disco bovino do osso subcondral, gire o disco para alcançar as áreas centradas. Após identificar as diferentes áreas da cartilagem, use uma lâmina cirúrgica número 20 ou 22 para cortar a área de interesse de todo o disco. Os IVDs de embriões bovinos com comprimento de alcatra menor que 20 centímetros devem ser processados sem dissecção.Realizou a decalcificação do tecido conforme descrito no manuscrito. Confirme a decalcificação bem sucedida, se uma agulha de calibre 20 penetrar no tecido do disco, ou se for aplicável as vértebras sem notável resistência. Exatamente as amostras de tecido no volume de dez vezes da solução de formaldeído de 4% na PBS durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, coloque o tecido em um meio de incorporação solúvel em água no botão Cryotome, de tal forma que um plano axial ou um plano que perpendicularmente corta o tipo de colágeno um normalmente é gerado. Use o Cryotome padrão para secionar o tecido incorporado a uma espessura de 70 micrômetros em amostras humanas e 40 micrômetros em amostras bovinas. Colete as seções em um slide de vidro antes de enxaguar as seções três vezes com PBS, adicione um corante fluorescente adequado seguido do meio de montagem e cubra as seções com um deslizamento de cobertura.Coloque um slide com uma seção de tecido de manchas no porta-amostras do microscópio florescence, iniciando o dispositivo de iluminação da estrutura realizar uma única imagem de campo de visão com filtros fluorescentes e iluminação adequada. Usando um software de otimização de imagem compatível com o microscópio florescence, processe as imagens otimizando a intensidade e o brilho. Para visualizar a seção como um todo, utilize a técnica de imagem de mosaico, abrindo as 60 configurações de aquisição do painel da barra de ferramentas e ajustando as configurações do mosaico no registro de mosaicos.Para isso, defina o número de colunas e linhas de imagens de campo de exibição que depois serão incorporadas em uma imagem de visão geral, pressione a configuração e ajuste a correção do foco das telhas individuais. Pós-processe as imagens otimizando a intensidade e o brilho. Para analisar a organização do condrocito espacial use a função 3d incorporada no software ajustando as configurações de pilha Z com o botão start/stop, defina os parâmetros de varredura como as posições de partida e parada no eixo Z e na distância da fatia.Identificar padrões celulares individuais e usar um plugin de contagem celular para a análise quantitativa dos padrões celulares, calcular a densidade celular dividindo as células contadas pelo tamanho da região escolhida de interesse. A arquitetura do IVD com sua densa rede de fibra de colágeno no anômulo e o núcleo mais suave pode ser reconhecida nas imagens de mosaico tiradas no plano axial e sagital. Em áreas ampliadas a partir das imagens do mosaico, diferentes padrões organizacionais espaciais de condrócitos como;células individuais, pares e cordas foram notados.O estudo de diferentes estágios de desenvolvimento e maturação da fibrose do anulô bovino apresentou uma diminuição contínua da densidade celular durante o desenvolvimento do disco embrionário. Por outro lado, observou-se uma densidade celular crescente e formação de aglomerados no disco humano adulto durante a degeneração. A densidade celular nos estágios iniciais do desenvolvimento do IVD na fibrose do anulô bovino e no núcleo bovino pulposo diminuiu rapidamente até o nascimento.Por meio de imagens de canal do IVD com o Epítome permitiram a visualização da arquitetura 3D dos padrões espaciais como o citoplasma e o núcleo, no single IVD intacto, bem como pares de condrócitos foram avistados. Enquanto nos aglomerados de células ulus degenerados foram encontrados. A parte mais desafiadora é alocar o tecido à sua origem e corrigir o incorporado para secção.Isso é essencial para obter resultados confiáveis. Ter corretamente dissecado e selecionado tecido IVD de diferentes estágios e origens nos permite aprofundar a análise por mais análises bioquímicas e biomecânicas, como a ELISA ou microscopia de força atômica.

optical-sectioning-visualization-intervertebral-disc-from-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo ilustra uma técnica de colheita, para coccígea bovina discos intervertebrais para a cultura de órgãos...

Preparação de Intact Discos cauda bovina Intervertebral de Cultura de Órgãos

Este vídeo demonstra uma técnica de cultura de discos intervertebrais bovinos em biorreatores para desenvolver um modelo tridimensional de cultura de órgãos. Meios específicos privados de nutrientes e condições de pressão degenerativa são aplicados aos discos, imitando o microambiente pró-inflamatório e degenerativo observado durante a doença do disco intervertebral em estágio inicial. As alturas dos discos são medidas após o tratamento para analisar os efeitos da privação de nutrientes e da...

Gerando um modelo de cultura de órgãos pró-inflamatórios para simular uma doença precoce do disco intervertebral

Organização celular dos ossos craniofaciais tem sido a hipótese, mas nunca diretamente visualizado. Rotulagem célula multi-espectral e in vivo ao vivo   imaging permite a visualização do comportamento das células dinâmica no peixe-zebra maxilar inferior. Aqui, nós detalhe o protocolo para manipular Zebrabow peixes transgénicos e observar diretamente intercalação celular e alterações morfológicas de condrócitos na cartilagem de Meckel.

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

cultura de órgão inteiro do disco intervertebral (IVD) preserva a matriz extracelular nativa, fenótipos celulares, e interacções de matriz celular. Aqui nós descrevemos um sistema de cultura IVD utilizando lombar do mouse e IVDs caudal em suas unidades da coluna vertebral funcionais e várias aplicações que utilizam este sistema.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

A degeneração do disco intervertebral é um contribuinte significativo para dor nas costas e uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo. Existem numerosos modelos animais de degeneração de disco intervertebral. Demonstramos um modelo ovino de degeneração de disco intervertebral, utilizando uma broca, o que atinge uma lesão de disco consistente e nível reprodutível de degeneração de disco.

Modelo de Degeneração de Disco Intervertebral Lumbar Ovino Utilizando uma lesão retroperitoneal lateral

Um protocolo é apresentado combinando limpeza tecidual com microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) para obter imagens tridimensionais e de resolução celular dos vasos linfáticos e linfonodos (LNs) coletando o fluido cefalorraquidal (CSF) e fluido peridural espinhal.

Imagen tridimensional da Vasculatura e Drenagem Linfática Vertebral usando iDISCO+ e Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação

Este protocolo apresenta um novo modelo experimental de cultura de órgãos bovinos proinflammatórios e degenerativos para simular a degeneração do disco intervertebral em estágio inicial.

Um modelo de cultura de órgãos proinflamatório e degenerativo para simular a doença do disco intervertebral em estágio inicial.

Apresentamos uma abordagem passo a passo para identificar e abordar os problemas mais comuns associados às micro-indentações por microscopia de força atômica. Exemplificamos os problemas emergentes em explantes de cartilagem articular humana nativa caracterizados por vários graus de degeneração impulsionada pela osteoartrite.

Abordando Questões Práticas em Micro-Indentação Baseada em Microscopia de Força Atômica em Explantes de Cartilagem Articular Humana

Mantendo o microscópio óptico limpa é importante para a alta qualidade de imagem. Poeira, impressões digitais, óleo de imersão em excesso, ou em meio de montagem ou em um microscópio provoca redução no contraste e resolução. DIC é especialmente sensível à contaminação e arranhões na superfície da lente. Este protocolo detalha o procedimento para manter o microscópio limpa.

Cuidados e limpeza do microscópio

Aprenda a técnica de secção óptica para visualizar a organização tridimensional de condrócitos no disco intervertebral humano e bovino. Este método revela padrões celulares desde o desenvolvimento embrionário até à degeneração.

Secção óptica e visualização do disco intervertebral do desenvolvimento embrionário à degeneração

Explorar mais vídeos