Ativação e Conjugação de Polissacarídeos Solúveis usando 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Polissacarídeos são pouco imunogênicos, a menos que estejam ligados à proteína e precisem ser ativados para derivação ou conjugação de proteínas. Neste método, o CDAP é usado como reagente de embarque de areia. O CDAP ativa hidróxia de polissacarídeo para derivação ou para ser ligado a proteínas para uso em vacinas ou reagentes diagnósticos.

CDAP substituiu em grande parte o brometo de cianogênio como um reagente de polissacarídeo e de embarque. CDAP é mais simples de usar, mais eficiente, e pode ser usado em um pH mais baixo do que brometo de cianogênio. É muito melhor ativar reagente.

O CDAP pode ser usado com a maioria dos polissacarídeos, ao contrário do que diz a aminação redutiva, que requer hidroxíxils vicinais. A química pode ser usada para conjugar direta e indiretamente proteínas, e pode ser usada para fazer reagentes diagnósticos. A reação de ativação do CDAP, como descrito originalmente, foi muito rápida e difícil de controlar.

O protocolo aqui fornecido torna a química muito mais fácil de executar e muito mais reproduzível. Antes de iniciar o experimento, ajuste o pH da solução de polissacarídeo para 9 adicionando 200 microliters de solução de estoque de dimetilaaminopyridina de forma dropwise enquanto mexe. Mantenha a reação resfriada em um banho de água gelada durante todo o processo de ativação.

Prossiga com a ativação ciano-dimetilaminopyridina-tetrafluoroborate ou CDAP transferindo 100 microliters de CDAP para a solução de polissacarídeo durante a agitação. Inicie o temporizador e monitore a troca de pH durante toda a ativação por 15 minutos. Mantenha a reação no pH alvo adicionando prontamente incrementos de 10 microliteres de hidróxido de sódio molar de 0,1 molar.

Quando o tempo ideal de ativação for atingido, adicione dois mililitros de dihidrazida álpica molar de 0,5 de uma só vez ao polissacarídeo ativado. Verifique se o pH está na faixa necessária para a funcionalização do hidróxido. Após a agitação contínua da mistura de reação por pelo menos uma hora, transfira a mistura de reação para quatro graus Celsius.

Para reduzir a concentração de ADH do produto, dilize a solução de polissacarídeo derivatizado bruto usando o dispositivo de diálise. Recupere o polissacarídeo derivatizado da diálise e determine a concentração dos polissacarídeos e hidrazida para calcular a razão hidrazida e polissacarida. Prepare uma solução de polissacarídeo não modificada por mililitro para ser usada como padrão.

Pré-aqueça o bloco de aquecimento a 140 graus Celsius por um mínimo de uma hora para alcançar uma temperatura uniforme estável. Use uma almofada protetora por baixo e ao redor do bloco de aquecimento em caso de derramamento de ácido. Adicione volumes variados de um miligrama por mililitro padrão de carboidratos ao rotulado 13 por 100 tubos de ensaio borossilicato em triplicados e compense o volume de 100 microlitres com água para alcançar as concentrações padrão desejadas.

Da mesma forma, configure ensaios amostrais adicionando um volume contendo cinco microgramas do polissacarídeo derivatizado a três tubos de amostra. Adicione 100 microliters de seis miligramas recém-preparados por resorcinol mililitro em cada tubo. Usando uma pipeta repetição, adicione 300 microliters do ácido 75% sulfúrico preparado a cada tubo, vórtice dos tubos vigorosamente, apontando o tubo para longe, em seguida, coloque todos os tubos em um bloco de aquecedor em um ritmo constante em ordem sequencial e imediatamente defina o temporizador por três minutos.

Em três minutos, remova os tubos na mesma ordem e coloque-os diretamente em um rack em um banho de água gelada. Remova os tubos frios de gelo para permitir que eles se equilibrem à temperatura ambiente por cinco minutos. Leia a absorvência de todos os tubos em um espectrofotômetro UV-Vis a 430 nanômetros usando um cuvette de comprimento de caminho de 10 milímetros.

Para configurar as reações de ensaio, classifique e organize os tubos padrão rotulados no rack do tubo, em ordem de maior concentração. Usando uma micropipette calibrada, adicione 100 microliters dos padrões a cada tubo correspondente. Para o padrão zero, use 100 microliters do buffer amostral.

Da mesma forma, prepare e organize os tubos de amostra. Em seguida, usando um micropipette calibrado de 1.000 microliter, adicione 875 microliters de tampão de ensaio a todos os tubos de ensaio. Para iniciar a reação do ensaio, adicione 25 microliters de ácido sulfônico de 1%trinitrobenzene a cada tubo de ensaio na ordem pré-determinada dentro de cinco minutos.

Vórtice os tubos de ensaio por dois segundos em alta velocidade, certificando-se de que o líquido gira a uma altura de meia polegada de abertura do tubo. Regisso tempo de início do ensaio e defina o temporizador para duas horas. Em seguida, coloque o rack do tubo de ensaio no escuro à temperatura ambiente por duas horas.

Quando o tempo acabar, vórtice os tubos e proceder à coleta de dados. O dextran ADH foi testado para dextran utilizando o ensaio de ácido sulfúrico resorcinol. Um tubo padrão típico usando glicose como padrão de açúcar foi plotado.

O teor de hidrazida em polissacarídeo ou dextran derivatizado foi determinado utilizando o ensaio TNBS. O nível de derivatização foi calculado como hidretos por 100 kilodaltons de dextran para facilitar a comparação entre polímeros de diferentes pesos moleculares médios. O protocolo descrito aqui pode precisar ser adaptado para um polissacarídeo específico.

A química CDAP pode ser usada para funcionalizar polissacarídeos para uso com uma grande variedade de reagentes de conjugação. Pode ser usado, por exemplo, para biotinilar polissacarídeos para uso em ELISAs. As proteínas podem estar diretamente ligadas a polissacarídeos ativados pelo CDAP, mas isso geralmente requer alguma otimização para um polissacarídeo específico.

O rendimento da conjugação pode ser superior a 75% O uso da química CDAP permitiu vacinas conjugadas de baixo custo, como as feitas, por exemplo, pelo Instituto Soro da Índia.