Teste de ativação basófila para diagnóstico de alergia

O teste de ativação basófila é um teste de diagnóstico in vitro complementar para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE que se mostraram úteis para reações induzidas por drogas, alimentos ou inalantes, bem como em algumas formas de urticária crônica. Este teste baseia-se na determinação da resposta basófila a uma ativação de IgE de ligação cruzada de alérgenos ou fármacos através da medição de marcadores de ativação por citometria de fluxo. O teste de ativação basófilo pode ser uma ferramenta útil e complementar para evitar testes de desafio controlados para confirmar o diagnóstico de alergia, especialmente em indivíduos que experimentam reações graves com risco de vida.

Além disso, este teste tem a vantagem de ser capaz de analisar a resposta contra qualquer droga ou alérgeno em comparação com outros métodos in vitro que só estão disponíveis para alguns medicamentos e alérgenos. As principais limitações do teste estão relacionadas à sensibilidade não ótima, especialmente na alergia a medicamentos. A necessidade de realizar o teste não mais de 24 horas após a extração da amostra e a falta de padronização entre laboratórios e algoritmos de diagnóstico.

Comece coletando sangue periférico em tubos heparinizados de nove mililitros e coloque as amostras em um rotor para mantê-las à temperatura ambiente até que sejam necessárias para o protocolo experimental. Rotule dois tubos de citômetro de cinco mililitros cada para controle negativo e controle positivo. Também rotule um tubo cada para as diferentes concentrações de alérgenos ou drogas que estão sendo testadas.

Em seguida, coloque os tubos em um rack para que os tubos se encaixem perfeitamente sem escorregar. Para o primeiro controle positivo, preparar uma solução micromolar de N-Formilmetionil-leucil-fenilalanina ou fMLP em 0,05%PBS-T Para confirmar a qualidade dos basófilos. Para o segundo controle positivo, prepare uma solução anti-IgE de 0,05 miligramas por mililitro usando PBS-T.

Prepare a mistura de coloração adicionando um microlitro cada de anticorpos CCR3-APC, CD203c-PE e CD63-FITC por 20 microlitros do tampão de estimulação. Em seguida, adicione 23 microlitros desta mistura de coloração a cada tubo. Adicione 100 microlitros de PBS-T aos tubos de controle negativo.

Adicione 100 microlitros de fMLP a um dos tubos de controle positivo e adicione 100 microlitros de anti-IgE E ao outro ao resto dos tubos. Adicione 100 microlitros das diferentes concentrações de alérgenos ou drogas e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, adicione 100 microlitros de sangue a cada tubo suavemente para evitar a hemólise.

Em seguida, suavemente vórtice os tubos e incube-os por 25 minutos a 37 graus Celsius no banho termostático com agitação média. Mantenha os tubos a quatro graus Celsius por pelo menos cinco minutos para parar a degranulação. Para cada tubo, adicione dois mililitros de tampão lisante para lisar os eritrócitos.

Vórtice cada tubo e, em seguida, incubar os tubos por cinco minutos à temperatura ambiente. Centrifugar os tubos a 300 g a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, vire o rack para a pia para decantar o sobrenadante enquanto as células permanecem no fundo dos tubos.

Adicione três mililitros de PBS-T a cada tubo para lavar as células e vórtice os tubos. Execute uma segunda rodada de centrifugação usando o mesmo conjunto de parâmetros e decante o sobrenadante derrubando o rack na pia. Em seguida, mantenha as amostras a quatro graus Celsius protegidas da luz até a citometria de fluxo.

Conecte o citômetro de fluxo ao software do computador e aguarde até que o citômetro esteja pronto. Carregue as configurações do modelo e do instrumento conforme descrito no manuscrito do texto. Inicie o processo de aquisição da amostra.

Para selecionar basófilos ativados, primeiro, pare os linfócitos do gráfico de dispersão lateral-para frente. Em seguida, pegue os basófilos da população de linfócitos como CCR3 + CD203c + células e adquira pelo menos 500 basófilos por tubo. Defina o limiar de CD63 para aproximadamente 2,5% usando os tubos de controle negativo e analise as amostras.

As reações de hipersensibilidade dependentes de IgE foram investigadas através da realização de um teste de ativação basófilo, ou BAT, usando alérgenos e drogas. A sensibilidade basófila foi analisada medindo-se a reatividade em múltiplas concentrações decrescentes de alérgenos que ajudam a determinar a concentração alérgica que induz a resposta de 50% de basófilos ou CE50. Primeiro, os linfócitos foram fechados a partir do gráfico de dispersão lateral de dispersão para a frente.

Em seguida, os basófilos foram isolados da população de linfócitos como células CCR3+CD203c+. Em seguida, um gráfico de CCR3-CD63 foi usado para analisar a ativação basófila usando CD63 como marcador de ativação para duas drogas e diferentes concentrações de um alérgeno. O teste é realizado com sangue total fresco e deve ser realizado não mais de 24 horas após a extração do sangue.

O estímulo utilizado no teste não deve incluir excipientes e as características químicas dos fármacos precisam ser consideradas. Outros métodos in vitro adicionais para o diagnóstico de reações alérgicas mediadas por IgE, ou a determinação de sIgE, ou o teste de liberação de histamina.