Name: Avaliação multifatorial do comportamento motor em ratos após lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: Aprenda a avaliar o comportamento motor em ratos após lesão unilateral do nervo ciático usando testes validados como CatWalk, campo aberto e caminhada em trave. Este protocolo padronizado permite medir déficits e recuperação neuromotora.

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Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal alemão da Educação e Pesquisa (BMBF DysTract to C.W.I.) e pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) da Universidade de Würzburg (N-362 a C.W.I.; Z2-CSP3 para L.R.). Além disso, este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover to J.V.), e da Fundação VERUM. Além disso, a C.W.I. é financiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295, pela Deutsche Stiftung Neurologie and ParkinsonFonds. L.R. é adicionalmente apoiado pela Dystonia Medical Reseach Foundation.
Os autores agradecem a Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel e Louisa Frieß por sua assistência técnica, bem como Helga Brünner pelo cuidado com os animais.

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<li>Metz, G. A., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+subcortical+lesions+impair+skilled+walking+in+the+ladder+rung+walking+test%3A+a+new+task+to+evaluate+fore-+and+hindlimb+stepping%2C+placing%2C+and+co-ordination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination.</a> Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).</li>
<li>Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment%2C+social+interaction%2C+and+physical+activity+as+determinants+of+functional+outcome+after+cerebral+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat.</a> Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo de avaliação comportamental fornece uma visão geral das vantagens e desvantagens, bem como possíveis leituras da bateria de teste comportamental selecionada em um modelo de roedor após lesão de esmagamento do nervo ciático. 
Para obter um resultado comparativo da lesão do esmagamento do nervo ciático, uma técnica consistente de esmagamento é obrigatória. O uso de um grampo não serrilado (Hemostat Ultra Fino) em vez de fórceps pode melhorar a consistência do esmagamento. Use o mesmo grampo, bem como a mesma posição de esmagamento para garantir a igual compressão do nervo. O uso exclusivo do grampo para a lesão do esmagamento e manuseio do grampo com cuidado melhora a consistência. Além disso, realize o procedimento da lesão do esmagamento com cuidado. Danos adicionais ao nervo durante a cirurgia, como a tração indesejada do nervo, podem levar a efeitos colaterais indesejados, como a automutilação. Portanto, recomenda-se uma preparação cuidadosa do nervo, bem como uma administração de um analgésico por um mínimo de dois dias. 
A avaliação multifatorial do comportamento motor pode caracterizar o fenótipo após lesão de esmagamento nervoso em ratos em vários níveis. Usamos a análise de marcha OFT, CatWalk XT, tarefa de caminhada de feixe e tarefa de caminhada de degraus de escada. Um procedimento experimental cego e a análise de dados para grupos experimentais são essenciais para esses experimentos. Antes da avaliação do comportamento, os animais foram aclimatados na sala de testes em condições de teste por pelo menos 30 minutos. Todos os testes comportamentais aqui aplicados têm a vantagem de que a privação de alimentos ou água não é necessária. O mesmo grupo de animais foi utilizado em todos os testes comportamentais descritos. Foram realizados no máximo dois testes comportamentais diferentes por dia para cada animal. Se os testes comportamentais forem realizados em intervalos regulares, preste atenção a um procedimento comparável, como a realização do teste na mesma ordem animal e na mesma hora do dia. Outro aspecto importante para a análise comportamental é o ciclo diurno dos ratos. Considere um ciclo diurno invertido para obter níveis mais naturais e mais altos de atividade no ciclo diurno (ciclo escuro). Isso deve ser considerado especialmente para a medição do comportamento espontâneo, como o OFT. Neste experimento, não foi possível implementar um ciclo diurno invertido, mas foi assegurada uma aclimatação adequada às condições de teste. Uma iluminação perfeita é essencial para vídeos de alta resolução para a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada da escada. Essa alta qualidade de vídeo não pode ser alcançada ao realizar experimentos no escuro. 
A avaliação da marcha requer um desempenho contínuo da tarefa. O primeiro aspecto importante de um desempenho contínuo da tarefa é convencer os animais a atravessar a configuração. Para aumentar a motivação, coloque pequenas pelotas de alimentos (45 mg) no final da configuração. Para que os animais se familiarizem com as pelotas de alimentos, as pelotas devem ser alimentadas com eles antes dos testes. Além disso, uma caixa de gol no final da configuração pode ser útil. A configuração do CatWalk já inclui uma caixa de gol, mas os ratos às vezes hesitam em entrar na caixa de gol. Alternativamente, você pode adicionar uma pequena gaiola na caixa de gol, mas a gaiola de casa de ratos não cabe na caixa de gol. Deixe o rato habituar na gaiola por alguns minutos antes da aquisição. Além disso, outro rato da mesma gaiola doméstica pode ser colocado na caixa de gol ou na gaiola dentro da caixa de gol. Certifique-se de que o segundo rato permaneça na caixa e não bloqueie a entrada da caixa de gol. Além disso, também é possível remover a caixa de gol do sistema CatWalk e colocar a gaiola de rato no final da passarela, o que permite que o rato entre em seu "território de origem" após cada corrida. Para a configuração da tarefa de caminhada do feixe e da tarefa de caminhada do degrau da escada, recomendamos adicionar uma caixa de gol ou a gaiola doméstica no final da configuração. Para garantir a consistência, o CatWalk, a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada do degrau da escada devem ser realizados pelo menos uma vez por semana com seis a dez corridas.
Embora nem todas as análises tenham apresentado diferenças significativas neste estudo, considere que a inclusão de animais geneticamente modificados ou grupos de tratamento poderia produzir dados valiosos que possam distinguir entre grupos dos mesmos testes comportamentais. 
A lesão por esmagamento nervoso não teve efeito na atividade locomotor do rato, que foi medida em cinco minutos de OFT. A análise da marcha da passarela XT é uma ferramenta mais objetiva e sensível para analisar a colocação da marcha, pata e dedo do dedo do dedo. Após um treinamento intensivo, os ratos aprendem a atravessar a passarela do aparelho CatWalk XT para as configurações padrão. A lesão nervosa não reduz a capacidade dos ratos de atravessar a passarela. A computação automática de vários parâmetros apresenta os dados objetivamente. Informações adicionais podem ser obtidas usando o módulo "Medidas interativas de pegada" e, de fato, essas análises produziram diferenças significativas em vários parâmetros de propagação do dedo do pé, comprimento de impressão e ângulo da pata ao eixo corporal comparando ratos com e sem lesão nervosa.
Ratos podem ser treinados facilmente para a tarefa de andar de feixe. Diferenças no tempo de latência para atravessar o feixe e no número de deslizamentos de pé por passo da perna traseira lesionada pelo nervo foram detectadas comparando-se ingênuas com ratos feridos por esmagamento. Uma desvantagem de analisar ratos feridos pelo nervo com a tarefa de andar de viga é o tamanho da viga. Nas duas primeiras semanas após a lesão do nervo ciático, os ratos precisam de assistência para atravessar a trave, pois seu equilíbrio é prejudicado. Embora alguns ratos possam ser capazes de atravessar a viga, o risco de ferimentos causados por uma queda é alto. Os animais esmagados pelos nervos devem, portanto, ser auxiliados a atravessar o feixe durante as duas primeiras semanas após lesão de esmagamento do nervo ciático ou mais, se necessário. No entanto, é difícil comparar corridas com e sem assistência. Além disso, o equilíbrio motor é um parâmetro importante avaliado pela tarefa de caminhada do feixe. Consideramos este parâmetro não relevante para o nosso modelo de rato de esmagamento nervoso. Portanto, pontuações descritas por Ohwatashi et al. e Johansson & Ohlsson não puderam ser utilizadas e corridas com uma travessia de feixe incompleta foram excluídas para análise de dados18,19.
A escala de 7 categorias de Metz et al. pode analisar os preços dos antees e traseiros e distinguir entre diferentes níveis de gravidade de erros de todos os membros durante a tarefa de caminhada do degrau da escada16,17. Analisando os erros mais proeminentes, que incluem as categorias de 0 a 2, não foram detectadas diferenças de erros por etapa na etapa traseira ao comparar ratos wt feridos pelo nervo com ratos ingênuos. Além disso, o tempo de latência de atravessar o aparelho de degrau da escada não difere entre ratos wt feridos pelo nervo e ratos ingênuos. Modelos de aprendizagem profunda podem melhorar e acelerar a análise de dados da tarefa de caminhada de degraus de escada através de uma abordagem automatizada. 
É importante mencionar que a lesão por esmagamento nervoso, bem como todos os testes comportamentais descritos podem facilmente traduzir para camundongos, adaptando as configurações e tamanhos das configurações. O uso de camundongos como organismo modelo tem o efeito benéfico de que existem modelos transgênicos para muitas doenças humanas.

Os roedores são excelentes organismos modelo para aprofundar a compreensão das doenças humanas1,2, testando hipóteses em múltiplos níveis biológicos. Um nível biológico fundamental para a caracterização dos modelos de roedores é o nível de fenótipo, medido por avaliações comportamentais. Dependendo do modelo animal e da questão da pesquisa científica, a seleção de uma poderosa e confiável bateria de teste comportamental é essencial para cobrir uma ampla gama de aspectos comportamentais, como para modelos animais da doença de Parkinson e distonia3,4,5,6.
O nervo ciático é o maior nervo do corpo humano com motor, bem como fibras sensoriais. Lesões do nervo ciático podem resultar facilmente de uma variedade de eventos, como acidentes de trânsito e cirurgias7,8. Portanto, as atividades de pesquisa utilizando modelos de roedores com lesões no nervo ciática, são de valor traduções relevantes. Embora o aspecto translacional da regeneração nervosa de rato para humano tenha que ser considerado criticamente9, a lesão do esmagamento do nervo ciático (axonotmesis) em modelos de roedores é um método comumente usado para analisar processos de degeneração e regeneração dos nervos periféricos10,11. Em caso de lesão por esmagamento, o nervo não é completamente transcectado. Danifica o axônio, resultando em bloqueio de condução logo após lesão por esmagamento seguido de processos regenerativos 4,12,13.
Além disso, na pesquisa da distonia, a lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático é um método estabelecido para desencadear movimentos semelhantes à distonia (DLM) em modelos de roedores de distonia geneticamente predispostos, que não mostram DLM por se4,14. Supõe-se que o trauma nervoso periférico perturba a integração sensorial afetando as fibras nervosas ciáticas, responsáveis pelas funções motoras e sensoriais15.
Nós fornecemos aqui uma descrição detalhada para uma lesão de esmagamento padronizada do nervo ciático e uma bateria de avaliações de comportamento motor que é composta do teste de campo aberto (OFT), análise de marcha CatWalk XT, tarefa de caminhada do feixe e tarefa de caminhada de degrau de escada em ratos selvagens ingênuos (wt) e ratos wt cinco semanas após lesão unilateral do nervo ciático (n= 10). O OFT fornece informações sobre a atividade locomotor geral, enquanto uma análise detalhada da marcha é realizada pelo sistema automatizado de análise de marcha CatWalk XT. A tarefa de caminhada do feixe é usada para avaliar a coordenação motora, avaliando o tempo para atravessar a viga e o número de erros de colocação do pé. Para análise de desempenho de marcha, a tarefa de caminhada de degraus da escada fornece informações sobre a colocação do pé ou da pata e erros em um aparelho de degrau horizontal da escada com um padrão de degrau constante, mas irregular.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético, &ge; 99,8%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>33209-1L</td><td></td></tr><tr><td>Appose ULC grampeador de pele 35W</td><td>Covidien</td><td>8886803712</td><td></td></tr><tr><td>Beam</td><td>auto feito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen creme para os olhos</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>81552983</td><td></td></tr><tr><td>Caixa para OFT</td><td>auto feito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filmadora GC-PX100</td><td>JVC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catwalk XT</td><td>Noldus</td><td></td><td>&nbsp; configuração e software</td></tr><tr><td>Câmara para isofluran</td><td>GT-Labortechnik</td><td></td> bisturi descartável <td>feito sob medida</td></tr><tr><td>No. 11</td><td>Feather</td><td>20.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Dr&auml; sistema de isoflurano ger Vapor 19.3</td><td>Dr. Wilfried M&uuml; ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 - pinça de laminectomia</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinça</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>pellets de precisão superfinos</td></tr> sem <tr><td>poeira 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0021</td><td></td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus</td><td></td><td>&nbsp; configuração e software</td></tr><tr><td>Fórceps 160 mm</td><td>Hartenstein</td><td>PZ09</td><td></td></tr><tr><td>Máscara de anestesia a gás, rato</td><td>Dr. Wilfried M&uuml; ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixa de baliza para aparelho de tarefa de caminhada de degrau de escada</td><td>feito</td><td></td><td></td>por conta própria</tr><tr><td>Máquina de cortar cabelo Magnum 5000</td><td>Wahl GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina endurecida</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aquecimento</td><td>MEDAX</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml</td><td>cp-pharma</td><td>1214</td><td>receita necessária</td></tr><tr><td>Kinovea</td><td>www.kinovea.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de tarefa de caminhada com degrau de escada</td><td>feito por conta própria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>KLS Martin</td><td>20-526-14-07</td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm</td><td>Sch&uuml; lke</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl 50 mg/ml, injetável</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Carprofeno, prescrição necessária</td></tr><tr><td>Afastadores elásticos</td><td>auto-fabricados</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espaçador para feixe</td><td>auto-feito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espaçador para escada degrau andando tarefa aparelho</td><td>auto-feito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura Silkam 4/0 DS 19</td><td>B. Braun</td><td>C0762202</td><td></td></tr><tr><td>Hemostáticos ultrafinos (grampo não serrilhado)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13020-12</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação multifatorial do comportamento motor em ratos após lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático

Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

A indução de uma lesão nervosa periférica é um método amplamente utilizado na neurociência para a avaliação de mecanismos de reparação e dor, entre outros. Além disso, no campo de pesquisa de distúrbios do movimento, a lesão por esmagamento ciático foi empregada para desencadear um fenótipo semelhante à distonia em modelos de roedores DYT-TOR1A geneticamente predispostos de distonia. Para alcançar resultados consistentes, reprodutíveis e comparáveis após uma lesão de esmagamento do nervo ciático, um método padronizado para induzir o esmagamento nervoso é essencial, além de uma caracterização fenotípica padronizada. Deve-se prestar atenção não apenas à variedade específica de testes comportamentais, mas também aos requisitos técnicos, à execução correta e à análise de dados consecutivas. Este protocolo descreve em detalhes como realizar uma lesão de esmagamento do nervo ciático e fornece uma bateria de teste comportamental para a avaliação de déficits motores em ratos que inclui o teste de campo aberto, a análise da marcha CatWalk XT, a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada de degraus da escada.

Os resultados representativos dos cinco minutos de OFT mostram que a lesão por esmagamento nervoso de cinco semanas após a cirurgia não tem efeito sobre a atividade locomotor(Figura 1).
A análise da marcha com o sistema CatWalk XT(Figura 2)gera muitos parâmetros diferentes. Os parâmetros seletivos foram estatisticamente analisados comparando-se ratos ingênuos wt com ratos wt feridos pelo nervo cinco semanas após o esmagamento do nervo(Figura 2D). Alterações significativas podem ser detectadas para a velocidade média de corrida, o comprimento do passo e a área de impressão da pata traseira lesionada (direita). Uma análise mais detalhada da pata traseira lesionada pelo nervo foi realizada com o módulo "Medidas interativas de pegada". Uma redução significativa dos parâmetros de propagação do dedo do dedo, propagação intermediária do dedo do dedo e comprimento de impressão foram observados em ratos wt feridos nervosos em comparação com ratos ingênuos wt. Além disso, o eixo do corpo do ângulo da pata e o vetor de movimento do ângulo da pata diferem significativamente quando comparamos ratos wt feridos pelo nervo com ratos ingênuos wt(Figura 2E).
A Figura 3 apresenta dados de coordenação motora obtidos através da avaliação da tarefa de caminhada do feixe. Ratos wt feridos por nervos mostraram um tempo de latência significativamente aumentado para atravessar o feixe em comparação com ratos ingênuos wt cinco semanas após lesão(Figura 3B). Como uma leitura adicional da tarefa de caminhada do feixe, foram contados deslizes completos e meio deslizes da barra traseira lesionada pelo nervo e considerados como um erro para análise estatística. A porcentagem de erros por passo da escalada de posteriores (direita) lesionada pelos nervos foi significativamente aumentada em ratos wt feridos pelo nervo em comparação com ratos ingênuos wt.
Os dados representativos da tarefa de caminhada do degrau da escada (Figura 4) não mostram alterações significativas no tempo de latência para atravessar a passarela do aparelho de degrau da escada (Figura 4C) ou na porcentagem de erros por passo do posterior de lesão nervosa (direita)(Figura 4D). A análise do percentual de erro por etapa do posterior lesado por nervo considerou apenas o escore de 0 a 2 da escala de 7 categorias de Metz et al. A distribuição de todas as categorias de pontuação por passo da escala de 7 categorias do hindlimb lesionado nervoso e do posterior lesionado não-nervoso (esquerda) é ilustrada na Figura 4E.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig01.jpg"> Figura 1: Avaliação da atividade locomotor durante o teste de campo aberto. (A) Imagem da configuração do teste de campo aberto. Imagem selecionada subtraída de um vídeo gravado durante o teste de campo aberto mostrando um rato na arena de campo aberto sem (B) e com (C) rastreamento. (D) A velocidade durante uma gravação de teste de campo aberto de cinco minutos foi investigada em ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. Os dados são apresentados como média ± SEM. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste t não pago dos dados normalmente distribuídos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig02.jpg"> Figura 2: Análise de marcha com o sistema CatWalk XT. (A) Imagem do aparelho CatWalk XT. (B) Exemplos da visualização de impressão mostrando as impressões da pata rotulada no modo de cor falsa e exemplos da visualização de tempo mostrando o diagrama de marcha baseado no tempo de ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após a lesão do esmagamento do nervo. (C) Exemplos da classificação do dedo do pé mostrando o spread do dedo do pé (TS), a propagação intermediária do dedo do pé (ITS) e o comprimento da impressão (PL), bem como exemplos da visão do eixo do corpo mostrando o eixo do corpo (linha branca) e o vetor de movimento (linha vermelha) de ratos ingênuos wt e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. (D) Dados dos parâmetros selecionados da classificação "padrão" comparando ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão por esmagamento nervoso. (E) Dados dos parâmetros selecionados do "Módulo de Medição de Pegada Interativa" comparando ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após a lesão do esmagamento nervoso. Os dados são mostrados como médias ± SEM. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste t não pago dos dados normalmente distribuídos, teste t não pago com a correção de Welch de dados normalmente distribuídos com variância desigual e teste Mann-Whitney U dos dados distribuídos não normais. O valor P &lt; 0,05 foi definido como estatisticamente significativo rotulado como *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig03.jpg"> Figura 3: Análise de marcha com a tarefa de caminhada do feixe. (A) Desenhos de imagem e esquema da configuração da tarefa de caminhada do feixe. O tempo de latência para atravessar o feixe (B) e os erros percentuais de deslizamento do pé por passo da lesão traseira lesionada pelo nervo durante a tarefa de caminhada do feixe (C) foi analisado em ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. Imagem representativa para a posição de tempo de partida (D) e a posição de tempo final (E) da tarefa de caminhada do feixe. Sequência de imagem representativa de um erro de deslizamento completo (F) e um erro de deslizamento de meio (G) da tarefa de caminhada do feixe. Os dados são mostrados como ± médias A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste Mann-Whitney U dos dados distribuídos não normais. O valor P &lt; 0,05 foi definido como estatisticamente significativo rotulado como *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig04.jpg"> Figura 4: Análise de marcha usando a tarefa de caminhada do degrau da escada. Desenho (A) e desenhos esquemáticos (B) da configuração da tarefa de caminhada do degrau da escada. O tempo de latência de atravessar o aparelho de degrau da escada (C) e os erros percentuais de deslizamento do pé por passo do traseiro ferido pelo nervo durante a tarefa de caminhada da escada (D) foi avaliado em ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. (E) A distribuição percentual da categoria de pontuação por etapa de acordo com a escala de 7 categorias de Metz et al. para a escalada traseira esquerda e direita de ratos ingênuos e ratos wt cinco semanas após lesão de esmagamento nervoso. Os dados são mostrados como ± médias DA SEM. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste t não pago dos dados normalmente distribuídos e o teste de Mann-Whitney U dos dados distribuídos não normais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig05.jpg"> Figura 5: Representação exemplar de cada categoria de acordo com a escala de 7 categorias de Metz et al. durante a tarefa de caminhada degrau da escada. Sequência de imagem representativa da divisão traseira direita da categoria 0 - erro total, categoria 1 - deslizamento profundo, categoria 2 - leve deslizamento, categoria 3 - substituição, categoria 4 - correção, durante a tarefa de caminhada de degrau de escada. Fotos representativas para categoria 5 - colocação parcial e categoria 6 - colocação correta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Fornecemos um protocolo para a avaliação do comportamento motor através de uma bateria de teste comportamental em ratos após lesão de esmagamento do nervo ciático.

Avaliação multifatorial do comportamento motor em ratos após lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever os procedimentos envolvidos na realização de esmagamento irreprodutível do nervo ciático, e fornecer um protocolo para a avaliação do comportamento motor após o trauma periférico. A seleção de uma poderosa e confiável bateria de teste comportamental é essencial para cobrir uma ampla gama de aspectos comportamentais, e depende do modelo animal usado e da questão da pesquisa científica. Este protocolo descreve em detalhes como realizar uma lesão de esmagamento do nervo ciático e fornece uma bateria de teste comportamental para a avaliação de déficits motores em ratos, que inclui o teste de campo aberto, a análise da marcha catwalk, a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada de degraus da escada.Os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais aplicáveis para o cuidado e o uso dos animais. Mantenha um ambiente estéril durante todo o procedimento cirúrgico. Coloque a mesa de cirurgia com o equipamento necessário.Anestesia profundamente o rato em um armário fechado com isoflurane e raspe uma extensa área do membro traseiro direito. Em seguida, posicione o rato na máscara de anestesia e continue anestesia profunda com isoflurano. Conserte o tronco e os dois membros traseiros do rato com fita.Coloque ambos os membros traseiros em uma posição simétrica e estendida e gire cada pata plana sobre a mesa de cirurgia. Desinfete a pele da área raspada com um antisséptico apropriado. Procure o entalhe ciático do íleo.Faça uma incisão da pele do entalhe ciático na direção da pata com um bisturi. Se os membros traseiros estiverem fixos e a incisão da pele for realizada corretamente, pode-se ver uma cavidade no plano fascial entre o músculo glúteo máximo e o músculo fêmio femoral que se assemelha a uma linha branca. Insira fórceps hemostáticos super finos fechados na cavidade e espalhe os fórceps.O avião fascial deve se abrir sem ferir nenhum tecido muscular. Coloque os retráteis do elástico sob os músculos para manter a incisão da pele aberta. Remova suavemente qualquer tecido circundante e vasos sanguíneos do nervo ciático até que o nervo esteja completamente exposto.É importante não esticar ou puxar o nervo durante todo o procedimento. Esmague o nervo ciático com um grampo não serrilado com pressão constante e rápida utilizável. Para isso, abra o grampo, coloque o nervo sobre a mandíbula inferior do grampo e feche o grampo travando-o na primeira posição por 3 x 10 segundos.Após a lesão da queda, reabra o grampo cuidadosamente. o local de esmagamento do nervo ciático parece translúcido. Remova os retratores do elástico.Feche a incisão do avião fascial com uma sutura resorbável. Feche a incisão da pele com grampos de pele corporal. A atividade locomotor, bem como a atividade comportamental dos ratos podem ser analisadas por um teste de campo aberto.A configuração do campo aberto, que deve ser localizado em um ambiente escuro e silencioso, consiste no sistema automatizado de rastreamento de vídeo, EthoVision XT, e uma arena com uma superfície preta resistente a riscos e limpa. Coloque a arena e a câmera na posição correta e configure o software EthoVision XT. Coloque o rato suavemente no meio da arena de testes.Durante a gravação, o experimentador deve ficar longe do campo aberto configurado, a fim de evitar distrair o rato. Para a análise dos dados do teste de campo aberto, vá até a seção de análise na barra lateral esquerda e escolha Acompanhar a Visualização"sob a guia Resultados". Em seguida, exporte os parâmetros necessários para XL.Dentro do software, escolha uma série de variáveis de diferentes categorias para análise de dados.Uma análise de marcha pelo sistema CatWalk XT pode ajudar a avaliar muitos parâmetros diferentes sobre as pegadas, postura e marcha dos modelos animais. Uma passarela de vidro é iluminada com luz verde e a luz espalhada pelas pegadas dos animais é capturada com uma câmera de vídeo de alta velocidade, que está localizada sob a passarela. Os sinais podem ser analisados com o software CatWalk XT.O experimento tem que ser realizado em condições escuras. Comece configurando o sistema CatWalk XT. Escolha as configurações experimentais.Coloque a câmera em posição e ajuste o foco. Configure as configurações de detecção. Configure as paredes do corredor do sistema CatWalk e certifique-se de que as paredes permaneçam paralelas à passarela.Defina o comprimento da passarela e calibrar a passarela. Em seguida, tire uma imagem de fundo. Uma passarela limpa e vazia é necessária para a imagem de fundo.O rato deve atravessar a passarela sem qualquer interrupção. De acordo com os critérios de execução definidos, três execuções compatíveis por rato são necessárias para análise de dados. Treine animais por pelo menos oito dias antes de começar com o experimento real.O CatWalk deve ser realizado pelo menos uma vez por semana, com 6 a 10 corridas para garantir um desempenho contínuo da tarefa. Para análise de dados, apenas avalie as corridas compatíveis. Classifique as impressões da pata automaticamente com o software CatWalk XT.Revise manualmente as etiquetas de impressão da pata. Corrija as etiquetas de impressão da pata errada, adicione etiquetas de impressões de patas não detectadas e exclua qualquer ruído e etiquetas erradas. Os resultados numéricos exibidos em uma folha XL, mostrando uma série de parâmetros básicos.Para obter informações mais detalhadas sobre cada pegada, classifique os dedo dos dedo das patas traseiras. Esta análise requer o módulo de medição de pegada interativa. Ajuste os marcadores para a análise da pegada manualmente.Analise cada impressão da pata traseira nas três corridas compatíveis. Desenhe uma linha do centro do primeiro dedo do dedo para o centro do quinto dedo do dedo para medir a propagação do dedo do dedo. Desenhe uma linha do centro do segundo dedo para o centro do quarto dedo para medir o spread intermediário do dedo do dedo.Desenhe uma linha do centro do terceiro dedo do pé até o calcanhar da pata traseira para medir o comprimento manual de impressão. Revise os resultados numéricos das medidas de pegada interativa exibidas em uma folha separada. Os déficits de marcha podem ser determinados pela tarefa de andar no feixe.O foco da tarefa de caminhada do feixe neste tópico específico de pesquisa será a análise da coordenação motora e não a avaliação do equilíbrio motor. Para a tarefa de andar de viga, é necessário um feixe, espaçador, mesa, fundo uniforme e uma filmadora. Use um feixe de madeira de 90 centímetros de comprimento, 1,7 centímetros de largura e 2 centímetros de altura.Treine os animais por sete dias. Coloque o rato na plataforma inicial da viga. O rato deve atravessar a viga três vezes sem qualquer interrupção.Mesmo que o rato atinja três corridas compatíveis nas três primeiras corridas, um mínimo de 6 a 10 corridas deve ser realizado para desempenho contínuo da tarefa. Selecione as sequências de vídeo de três corridas compatíveis da gravação. Defina o ponto de tempo de partida e o ponto de tempo final das três corridas compatíveis selecionadas.Aqui, o ponto de partida é rotulado por uma linha preta na trave, e a colocação do primeiro membro traseiro atrás da linha preta é definida como o ponto de partida da corrida. A colocação do primeiro membro traseiro na plataforma no final do feixe define o ponto de tempo final. Em seguida, calcule o tempo necessário para o rato atravessar o feixe.Marque o número de passos e erros de três corridas compatíveis para ambos os membros traseiros separadamente, usando a função zoom e câmera lenta do software. Os erros incluem deslizamentos totais do pé e deslizamentos de meio pé. Um deslizamento total do pé é definido como uma colocação do pé que é seguida por deslizamento profundo, causando uma perda de contato da pata afetada com a viga.Um meio deslize é definido como a pata deslizando para fora da parede lateral da viga sem perder contato completo. Calcule a porcentagem de deslizamentos de pé em relação ao número de passos para atravessar a viga. A tarefa de caminhada do degrau da escada pode avaliar a função motora, a colocação de membros dianteiros e membros traseiros e a coordenação entre membros.Um aparelho de degrau de escada, espaçador, mesa, fundo uniforme e filmadora são necessários para este teste comportamental. O aparelho de degrau de letra horizontal consiste em degraus metálicos e paredes laterais de policarbonato claros. Treine os animais por oito dias.Coloque o rato na zona de partida dos operadores de degraus de escada. O rato tem que atravessar a passarela de 100 centímetros do aparelho de degrau da escada três vezes sem interrupção, a fim de que ele se qualifique como uma corrida compatível. Selecione as sequências de vídeo de três corridas compatíveis da gravação.Defina o ponto de tempo de partida e o ponto de tempo final das três corridas compatíveis selecionadas. A colocação do membro traseiro atrás da primeira linha preta na parede lateral do aparelho define o ponto de partida da corrida. A colocação do primeiro membro dianteiro atrás da segunda linha preta na parede lateral do aparelho define o ponto final da corrida.Em seguida, calcule a duração da corrida através da passarela. Marque as três corridas compatíveis com a escala de 7 categorias de Mets e colegas usando a câmera lenta ou a função quadro por quadro do software. Determine o número de etapas e o número de erros de acordo com as categorias da escala para cada membro separadamente.A escala distingue entre as seguintes categorias. Total falta. Deslizamento profundo.Um pequeno deslize. Substituição.Correção. Colocação parcial. E corrigir a colocação.Em seguida, calcule os erros por etapa. Os resultados representativos do teste de campo aberto de cinco minutos mostram que a lesão por esmagamento nervoso, cinco semanas após a cirurgia, não tem efeito na atividade locomotor. A análise de marcha com o sistema CatWalk XT gera muitos parâmetros diferentes.Alterações significativas podem ser detectadas para a velocidade média de corrida, o comprimento do passo e a área de impressão da pata traseira direita lesionada pelo nervo. Ratos selvagens feridos pelos nervos mostraram um aumento significativo do tempo de latência para atravessar a trave, em comparação com ratos ingênuos do tipo selvagem cinco semanas após a lesão. Como uma leitura adicional da tarefa de caminhada do feixe, foram contados deslizes completos e meio deslizes do membro traseiro ferido pelo nervo e considerados como um erro para análise estatística.A porcentagem de erros por passo do membro traseiro direito ferido pelo nervo foi significativamente aumentada em ratos selvagens feridos pelo nervo, em comparação com ratos ingênuos do tipo selvagem. Os dados representativos da tarefa de caminhada do degrau da escada não mostram alterações significativas no tempo de latência para atravessar a passarela do aparelho degrau da escada, ou na porcentagem de erros por passo do membro traseiro direito ferido pelo nervo. A análise do percentual de erro por passo do membro traseiro lesionado do nervo considerou apenas o escore de 0 a 2 da escala de categoria 7 de Mets e colegas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma lesão de esmagamento do nervo ciático, e como implementar uma avaliação multifatorial do comportamento motor em ratos após a queda unilateral do nervo ciático. Para alcançar resultados consistentes, reprodutíveis e comparáveis após uma lesão de esmagamento do nervo ciático, um método padronizado para induzir o esmagamento nervoso é essencial, bem como uma caracterização fenotipicamente padronizada. O treinamento adequado para um teste de comportamento específico oferece as vantagens de economizar tempo durante a avaliação do experimento e obter melhores resultados.

multifactorial-assessment-motor-behavior-rats-after-unilateral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste relatório nós descrevemos um método para esmagamento do nervo ciático do rato. Este método usa prontamente disponíveis pinça hemostática e facilmente reproduzível e produz esmagamento do nervo ciático completa. Além disso, nós descrevemos um método para preparar montagens de músculos inteiros adequados para análise da regeneração do nervo após esmagamento do nervo ciático.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Fonte: Li, Q., et al. Investigando a regeneração do axônio de mamíferos: eletroporação in vivo do gânglio da raiz dorsal de camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o processo de regeneração axonal em um nervo ciático de camundongo após uma lesão por esmagamento. O nervo isolado é fixado e preparado para imagens, com proteínas fluorescentes expressas em neurônios para visualizar o crescimento do axônio. Usando um microscópio de epifluorescência, a regeneração do axônio é...

Regeneração axonal no nervo ciático de um camundongo após uma lesão por esmagamento

Três novos testes comportamentais (membro anterior passo a alternância, teste instabilidade postural, teste de manipulação de massas) para avaliar a função do membro torácico após lesão medular cervical em roedores são descritos.

Avaliação da Função Membro Anterior após Unilateral Cervical SCI usando tarefas Novel: Membro Passo alternância, instabilidade postural e Pasta Manipulação

O trato corticoespinhal, uma das principais vias sensório-motores, pode ser lesionado unilateralmente no tronco cerebral de roedor, a fim de testar terapias de indução neuroplasticidade para o sistema nervoso central. Este procedimento cirúrgico ("pyramidotomy") e avaliação pós-operatória são descritos neste protocolo.

Unilateral Pyramidotomy do Corticospinal Tract em Ratos de Avaliação de Terapias de indução de neuroplasticidade

Aqui descrevemos procedimentos cirúrgicos para produzir uma hemiseção lateral medular confiável (HX) no nível9 torácico em ratos adultos e avaliações neurocomportamentais projetadas para detectar déficits assimétricos após tal lesão unilateral.

Hemiseção Lateral da Medula Espinhal e Avaliações Comportamentais Assimétricas em Ratos Adultos

O hemisection espinal torácico do rato é um modelo valioso e reprodutível de ferimento unilateral da medula espinal para investigar os mecanismos neural da recuperação locomotora e da eficácia do tratamento. Este artigo inclui um guia detalhado passo a passo para realizar o procedimento de hemisection e avaliar o desempenho locomotor em uma arena de campo aberto.

Cirurgia do Hemisection da medula espinal torácica e avaliação do locomotor do aberto-campo no rato

Introduzimos um método de análise cinemática que usa um aparelho de captura de movimento tridimensional contendo quatro câmeras e software de processamento de dados para realizar avaliações funcionais durante pesquisas fundamentais envolvendo modelos de roedores.

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

A análise automatizada da marcha é uma ferramenta viável para avaliar a recuperação funcional em modelos de roedores de lesão nervosa periférica e lesão de contusão medular. Embora exija apenas uma configuração para avaliar a função locomotor em vários modelos experimentais, o ajuste meticuloso e macio e o treinamento dos animais é altamente importante.

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

A avaliação da recuperação motora continua sendo a medida de desfecho de referência em estudos experimentais de nervos periféricos. A medição da força tetanica isométrica do músculo tibialis anterior no rato é uma ferramenta inestimável para avaliar os resultados funcionais após a reconstrução de defeitos do nervo ciático. Os métodos e nuances estão detalhados neste artigo.

Medição máxima da Força Tetanica Isométrica do Músculo Tibialis Anterior no Rato

Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.

Uso do MouseWalker para Quantificar a Disfunção Locomotora em um Modelo de Lesão Medular em Camundongos

Aprenda a avaliar o comportamento motor em ratos após lesão unilateral do nervo ciático usando testes validados como CatWalk, campo aberto e caminhada em trave. Este protocolo padronizado permite medir déficits e recuperação neuromotora.

Avaliação multifatorial do comportamento motor em ratos após lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático

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