Visualização e Quantificação de TGFβ/BMP/SMAD Sinalizando em diferentes condições de estresse da tesoura de fluidos usando o ensaio de proximidade-ligação-assay

Este protocolo permite que os cientistas comparem quantitativamente o número de complexos de fatores de transcrição em diferentes condições de estresse de tesoura, e será benéfico para pesquisas em biologia vascular. A principal vantagem deste protocolo é o uso de canais de fluxo microfluido que permitem investigações de diversos pares de anticorpos, incluindo os respectivos controles simultaneamente. Para começar, cubra o slide de seis canais adicionando 0,1% de gelatina de pele suína preparada em PBS nos canais por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Esvazie os canais da solução de gelatina e dos Huvecs de sementes nos slides pré-codificados de seis canais a uma densidade de 2,5 vezes 10 para a sexta células por mililitro em 30 microlitrais de M199 meio completo. Permita que as células aderam por uma hora a 37 graus Celsius na incubadora umidificada. Adicione 60 microliters de M199 pré-avisados meio completo para cada um dos reservatórios.

Cultuize as células a 37 graus Celsius por dois dias em uma incubadora umidificada com substituição média após 24 horas. Monte a tubulação de silício nas unidades fluidas, encha os reservatórios com um mínimo de 10 mililitros de meio completo M199 pré-avisado. Conecte as unidades fluidas com tubos ao sistema de bomba e realize o pré-funcionamento sem células para equilibrar o meio e remover qualquer ar restante.

Conecte os canais únicos no slide de seis canais usando a tubulação de conexão serial. Conecte o primeiro e o último canal no slide aos tubos montados na unidade fluidica. Para exposição das células a altos níveis de estresse absoluto, aumente o passo de estresse com fases de adaptação, definindo os passos em incrementos de cinco dynes por centímetro quadrado por 30 minutos.

Use os aglomerados na tubulação para separar os slides das bombas após a exposição ao estresse da cisalhamento do fluido, evitando derramamento médio na incubadora e transferir lâminas de fluxo no gelo. Ao retirar a tubulação dos reservatórios, use o dedo para fechar o outro lado do reservatório para evitar prender as bolhas de ar no canal. Mantendo o fluxo deslizando sobre o gelo, aspire o meio cuidadosamente dos reservatórios, mas não do canal onde as células residem.

Lave as amostras com 90 microliters de PBS estéreis a frio adicionando PBS a um reservatório e aspirando cuidadosamente do outro reservatório, depois repita para todos os canais. Fixar as células adicionando 90 microliters de solução 4%PFA tamponadas ao mesmo reservatório onde o PBS foi adicionado e aspirar o líquido do outro reservatório como demonstrado. Depois de fixar as células em todos os seis canais, transfira as amostras do gelo para a temperatura ambiente, e incubar por 20 minutos.

Lave as células três vezes com PBS adicionando PBS a um reservatório e aspirando-a cuidadosamente do outro reservatório em todos os canais, tomando cuidado para não secar os canais. Saciar o acesso pfa adicionando 90 microlitadores de cloreto de amônio ambiente de 15 mililamiliar preparado em PBS a um dos reservatórios. Aspire do outro reservatório e incuba as células por 10 minutos.

Permeabilize as células adicionando 90 microlitrais de 0,3% Triton X 100 preparados em PBS no reservatório vazio. Aspire do outro reservatório para cada canal e incubar por 10 minutos, depois lavado três vezes com PBS como demonstrado anteriormente. A 90 microliters de solução de bloqueio PLA estéril para um reservatório.

Aspire do outro lado para cada canal e incuba por uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada. Adicione anticorpos primários em anticorpos PLA diluentes e vórtices. Aspire cuidadosamente a solução de bloqueio dos reservatórios e canais.

Adicione 30 microliters da solução de anticorpos primários imediatamente no canal vazio inclinando o slide enquanto adiciona a solução. Repita para todos os canais e incubar a quatro graus Celsius na câmara umidificada durante a noite ou a 37 graus Celsius por uma hora. Diluir menos coelho e mais sondas PLA de mouse de um a cinco no diluído de anticorpos PLA.

Lave todos os canais duas vezes adicionando 90 microliters de tampão de lavagem A e aspirando como demonstrado. Após aspirar o tampão de lavagem, adicione 30 microliters da solução de sonda PLA e incubar na câmara umidificada. Diluir o tampão de ligadura de um a cinco em D água ionizada e diluir a enzima lygus de um a 40 no tampão de ligadura diluída.

Depois de lavar e aspirar completamente o tampão de lavagem A, adicione 30 microliters de solução de ligadura aos canais vazios enquanto inclina o slide e incuba na câmara umidificada. Diluir o tampão de amplificação de um a cinco em água deionizada e, em seguida, diluir a enzima polimerase de um a 80 no tampão de amplificação diluída no gelo. Depois de lavar e aspirar completamente o tampão de lavagem A, adicione 30 microliters de solução de amplificação aos canais vazios enquanto inclina o slide e incuba-o na câmara umidificada.

Diluir o DAPI de um a 500 no tampão de lavagem B e lavar todos os canais uma vez adicionando 90 microliters de DAPI contendo tampão de lavagem B, e aspirando como demonstrado para vaporizar os núcleos. Em seguida, lave todos os canais uma vez com o tampão de lavagem B sem DAPI. Diluir o tampão de lavagem B de 1 a 10 em água deionizada e lavar todos os canais uma vez com 90 microliters de tampão de lavagem diluído B.Após aspirar o tampão de lavagem B, adicione imediatamente duas a três gotas do meio de montagem líquida para um reservatório, e incline o slide para distribuir o meio de montagem em todos os canais.

Armazene as amostras a quatro graus Celsius em um ambiente umidificado até a imagem. Huvecs foram expostos a alto e baixo estresse. O baixo estresse de cisalhamento aumentou as interações proteicas SMAD nos citos e núcleos.

Controles de anticorpos únicos mostraram não a poucos sinais, provando o sucesso do experimento. O aumento da concentração de anticorpos resultou em um maior número de eventos de PLA por célula, mas a diferença nos sinais pla entre células expostas de alto e baixo estresse foi reduzida. Tampões auto-fabricados para bloqueio e diluição de anticorpos podem ser usados como uma alternativa para buffers comerciais.

A quantificação de eventos PLA para soluções comerciais e auto-feitas diluientes e de bloqueio mostrou o mesmo padrão de sinais PLA nas áreas citosolicas e nucleares. No entanto, o número total de eventos pla por célula foi maior com soluções comerciais. Uma combinação de anticorpos SMAD Two/Three, SMAD Four foi usado onde o anticorpo SMAD Four não era adequado para experimentos de imunofluorescência.

Não houve diferença nos eventos pla na condição experimental versus controle, indicando a importância de selecionar a combinação correta de anticorpos para detectar os eventos PLA. O protocolo descrito pode ser adaptado para detectar as interações de complexos de fatores de transcrição diferentes dos SMADs e, portanto, ajudar a entender a regulação genética em condições de proteção athero e athero.