Name: Visualização e Quantificação de TGFβ/BMP/SMAD Sinalizando em diferentes condições de estresse da tesoura de fluidos usando o ensaio de proximidade-ligação-assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a visualizar e quantificar complexos SMAD em células endoteliais sob diferentes condições de estresse de cisalhamento usando ensaio de ligação de proximidade. Este método avança a pesquisa em biologia vascular.

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Agradecemos à Dra. Maria Reichenbach e ao Dr. Christian Hiepen pelo apoio ao sistema de escoamento e Eleanor Fox e Yunyun Xiao por lerem criticamente o manuscrito. P-L.M. foi financiado pela International Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK recebeu financiamento pelo DFG-SFB1444. A Figura 1 foi criada usando BioRender.

1. Cultura celular e exposição ao estresse da tesoura fluida
NOTA: Os CES de veia umbilical humana (HUVECs) foram utilizados como exemplo para estudar a interação induzida por SS de SMADs. O protocolo descrito abaixo pode ser aplicado a todos os tipos de células responsivas SS.
<ol><li>Cubra slide de 6 canais com 0,1% de gelatina de pele suína em PBS por 30 min a 37 °C.</li>
	<li>HuVECs de sementes em slides pré-revestidos de 6 canais a uma densidade de 2,5 x 106 células por mL em 30 μL de m199 meio completo. NOTA: Para obter mais informações sobre como semear células no slide de fluxo, consulte referência24.</li>
	<li>Deixe as células aderirem por 1h a 37 °C em uma incubadora umidificada.</li>
	<li>Adicione 60 μL de M199 médio completo pré-aquecido a cada um dos reservatórios.</li>
	<li>Cultura por 2 dias, com uma troca média suave uma vez por dia, a 37 °C em uma incubadora umidificada.<ol>
<li>Aspire completamente os reservatórios, adicione 120 μL de m199 médio completo pré-aquecido em um dos reservatórios, e aspire do outro lado.</li>
		<li>Adicione 60 μL de m199 médio completo pré-aquecido para ambos os reservatórios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte e inicie a configuração de fluxo conforme detalhado na referência25.<ol>
<li>Montar tubos em unidades fluidas. Aqui, tubos de silicone com diâmetro de 0,8 mm e 1,6 mm são utilizados para aplicar estresse de tesoura de 1 dyn/cm2 e 30 dyn/cm2, respectivamente. NOTA: O material e o comprimento do tubo devem permanecer constantes, pois as mudanças podem influenciar o estresse resultante da tesoura. Em geral, outras combinações de sistemas de bomba e tubos podem ser usadas, desde que o estresse resultante da cisalhamento seja conhecido, e a bomba crie um fluxo laminar constante.</li>
		<li>Encha os reservatórios com uma quantidade adequada de meio completo M199 pré-aquecido (mínimo de 10 mL).</li>
		<li>Conecte unidades fluidas com o tubo ao sistema de bomba e realize um pré-funcionamento sem células para equilibrar o meio e remover qualquer ar restante25.</li>
		<li>Conecte serialmente os canais únicos no slide de 6 canais um ao outro usando tubos de conexão serial. O primeiro e o último canal no slide serão conectados à tubulação montada em 1.6.1 (ver Figura 1A para um esquema). Tenha cuidado para não introduzir qualquer ar no sistema, pois isso pode prejudicar severamente as células. Mais informações sobre a conexão serial podem ser encontradas em referência26.</li>
		<li>Para a exposição das células a altos níveis de estresse de corte (>20 dyn/cm2), use uma fase de rampa, ou seja, aumentar o estresse da tesoura stepwise com fases de adaptação. As etapas podem ser definidas em incrementos de 5 dyn/cm2 por 30 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixação
<ol><li>Desprender slides das bombas após a exposição do fluido SS. Use grampos na tubulação ao se desprender, para evitar o derramamento médio na incubadora.</li>
	<li>Transfira imediatamente as lâminas de fluxo no gelo, enquanto o tubo restante é separado sequencialmente. Ao remover a tubulação dos reservatórios, o reservatório do outro lado deve ser mantido fechado com um dedo para evitar a captura de bolhas de ar no canal. Isso pode interferir com as etapas de fixação.</li>
	<li>Mantendo as células no gelo, aspire o meio cuidadosamente dos reservatórios, mas não do canal onde as células residem. Posteriormente, lave amostras com PBS estéril a frio (4 °C) com três vezes o volume do canal (90 μL). Adicione PBS em um reservatório e aspire cuidadosamente do outro reservatório. Repita esta etapa em cada um dos 6 canais por slide. NOTA: Para todas as etapas de lavagem e incubação, a respectiva solução é adicionada em um dos reservatórios que leva a uma troca de soluções no canal. Para permitir a substituição completa de soluções no canal, a solução em excesso é então aspirada do outro reservatório. A solução na parte superior das células do canal não é removida. As células não devem secar em nenhum momento. Por isso, é importante lavar cuidadosamente sem qualquer inserção de bolha de ar nos slides.</li>
	<li>Fixar as células adicionando 90 μL de solução pfa de 4% tamponada no mesmo reservatório onde o PBS foi adicionado antecipadamente e aspirar o líquido do outro reservatório. Repita esta etapa em cada canal em cada slide. Após a adição da solução PFA, transfira as amostras do gelo para a temperatura ambiente (RT) e incubar por 20 minutos. ATENÇÃO: O PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. Use luvas e trabalhe sob um capô de fumaça.</li>
	<li>Lave as células 3x com PBS (RT) adicionando-a em um reservatório e aspirando cuidadosamente do outro reservatório. Esvazie apenas os reservatórios, garantindo não secar o canal. Repita esta etapa para cada um dos 6 canais por slide.</li>
	<li>Sacie a fixação de PFA adicionando 90 μL de cloreto de amônio ambiente de 50 mM em PBS em um dos reservatórios. Aspirar solução em excesso do outro reservatório. Repita para cada canal no slide. Incubar as amostras por 10 minutos na RT.</li>
	<li>Lave como descrito na etapa 2.5. NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite, ou o protocolo pode ser imediatamente continuado com bloqueio e incubação de anticorpos primários (ver passo 3).</li>
</ol>3. Bloqueio e incubação primária de anticorpos
<ol><li>Para permeabilizar as células, adicione 90 μL de 0,3% Triton-X-100 em PBS em um reservatório esvaziado, e aspire do outro reservatório para cada canal. Incubar por 10 min na RT.</li>
	<li>Lave como descrito na etapa 2.5.</li>
	<li>Adicione 90 μL de solução de bloqueio PLA estéril em um reservatório de um canal e aspire do outro lado. Repita esta etapa para cada canal. Bloqueie por 1h a 37 °C em uma câmara umidificada.<ol>
<li>Para fazer uma câmara umidificada, use um prato de 10 cm com tecido molhado selado com filme de cera e coloque o prato na incubadora. Alternativamente, outros formatos de câmara de umidade podem ser usados que fornecem uma atmosfera úmida. NOTA: Alternativamente, pode-se utilizar solução de bloqueio autodidato (por exemplo, 3% (w/v) BSA no PBS, filtrado estéril).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare anticorpos primários (1:100) em diluente de anticorpos PLA. Prepare 30 μL da solução por canal. Adicione ambos os anticorpos primários simultaneamente e vórtice. NOTA: Alternativamente, pode-se utilizar diluente de anticorpos auto-fabricados (por exemplo, 1% (w/v) BSA na PBS). Os anticorpos utilizados aqui são combinações de SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 e phospho-SMAD1/5-SMAD4. Informações detalhadas podem ser encontradas na Tabela de Materiais.</li>
	<li>Antes da aplicação de anticorpos primários, aspire a solução de bloqueio dos reservatórios e, também, cuidadosamente do canal. Pipeta 30 μL da solução de anticorpos primário imediatamente no canal vazio, inclinando o canal enquanto adiciona a solução. NOTA: Realize a remoção da solução de bloqueio e a adição da solução de anticorpos canal a canal para garantir que as células não sequem no meio.</li>
	<li>Incubar amostras com os anticorpos primários durante a noite em câmaras umidificadas a 4 °C. NOTA: A incubação também pode ser realizada por 1h em temperatura ambiente, se estiver interessada em continuar com as seguintes etapas no mesmo dia.</li>
</ol>4. Incubação da sonda PLA
NOTA: Para todas as etapas da seção 4.1-7.3, os tampões de lavagem A e B são armazenados a 4 °C e precisam ser aquecidos ao RT antes do uso.
<ol><li>Diluir as sondas PLA (+)-mouse e (-)-rabbit para 1:5 na solução diluída de anticorpos PLA (ou 1% BSA). Prepare 30 μL por canal.</li>
	<li>Lave amostras 2x por 5 min usando 90 μL do tampão de lavagem A na RT, adicionando-a em um dos reservatórios e aspirando cuidadosamente do outro reservatório. Repita esta etapa para cada um dos 6 canais por slide.</li>
	<li>Aspire o tampão de lavagem A cuidadosamente e adicione 30 μL de solução de sonda PLA (preparada na etapa 4.1), semelhante à adição de anticorpos primários na etapa 3.5.</li>
	<li>Incubar amostras por 1h a 37 °C em uma câmara umidificada.</li>
</ol>5. Ligadura
<ol><li>Lave amostras 2x por 5 min usando 90 μL do tampão de lavagem A na RT, conforme descrito em 4.2.</li>
	<li>Prepare uma diluição de 1:5 do tampão de ligadura em água deionizada. Use este tampão para diluir a enzima ligase para 1:40 (no gelo). Use 30 μL por canal.</li>
	<li>Aspire completamente o tampão de lavagem A e adicione a solução de ligadura conforme descrito em 3.5.</li>
	<li>Incubar amostras por 30 min a 37 °C em uma câmara umidificada.</li>
</ol>6. Amplificação
<ol><li>Lave amostras 2x por 2 min usando 90 μL de tampão de lavagem A na RT, conforme descrito em 4.2.</li>
	<li>Prepare o tampão de amplificação diluindo-o 1:5 em água deionizada e use-o para diluir a enzima polimerase para 1:80 (no gelo). Proteja-se contra a luz. Prepare 30 μL por canal.</li>
	<li>Aspire o tampão de lavagem A adicione completamente e imediatamente a solução de amplificação preparada no canal vazio, conforme descrito em 3.5. Incubar amostras por 100 min a 37 °C em uma câmara umidificada.</li>
</ol>7. Montagem
<ol><li>Lave amostras 2x por 10 min usando 90 μL de Wash Buffer B em RT, conforme descrito em 4.2. Adicionar DAPI (1:500) a partir de 1 mg/mL solução de estoque (em água deionizada) na primeira lavagem para coloração de núcleos. Não seque o canal.</li>
	<li>Diluir o tampão de lavagem B em água desionizada (1:10) e lavar 1x com 90 μL de solução B tampão de 0,1x conforme descrito em 4.2.</li>
	<li>Aspire o tampão de lavagem B completamente e imediatamente adicione 2-3 gotas do meio de montagem líquida em um reservatório. Distribua-o no canal inclinando o slide. Armazene amostras a 4 °C em um ambiente umidificado até a imagem.</li>
</ol>8. Aquisição de imagens
<ol><li>Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência. Certifique-se de que os respectivos filtros que se encaixam nas sondas PLA fluorescentes estejam disponíveis. NOTA: É benéfico fazer uso de um microscópio confocal, se possível, pois as manchas PLA obtidas são mais definidas. Isso também suporta mais processamento de imagens e análise de dados.</li>
</ol>9. Análise e quantificação de imagens usando ImageJ/FIJI
<ol><li>Processar imagens exportadas (.tiff) com um programa de processamento de imagens, como ImageJ27. NOTA: Todos os scripts usados neste estudo e necessários para a contagem automática de eventos celulares, nucleares e todos os PLA (por célula) podem ser encontrados em um repositório do GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Realize análises estatísticas utilizando qualquer programa ou ferramenta adequada.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses.

O protocolo baseado em PLA descrito aqui oferece uma maneira eficiente de determinar a proximidade de duas proteínas (por exemplo, sua interação direta) em CEs expostas ao estresse de tesoura com resolução quantitativa e espacial. Usando slides de fluxo com múltiplos canais paralelos, várias interações proteicas diferentes podem ser examinadas ao mesmo tempo em células sob condições mecânicas idênticas. Em contraste, os sistemas de câmara de fluxo de construção personalizada geralmente fazem uso de um único canal que é c...

Proteínas dos fatores transformadores de crescimento beta (TGFβ) superfamília são citocinas pleiotrópicos com uma variedade de membros, incluindo TGFβs, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) e Activins1,2. A ligação ligante induz a formação de oligômeros receptores que levam à fosforilação e, assim, ativação do SMAD regulatório citomúmico (R-SMAD). Dependendo da subfamo de ligantes, diferentes R-SMADs são ativados1,2. Enquanto TGFβs e Activins induzem principalmente fosforilação de SMAD2/3, os BMPs induzem a fosforilação SMAD1/5/8. No entanto, há evidências acumuladas de que os BMPs e TGFβs/Activins também ativam R-SMADs da respectiva outra subfamo, em um processo denominado como 'sinalização lateral'3,4,5,6,7,8 e que existem complexos SMAD mistos compostos por ambos, SMAD1/5 e SMAD2/3, membros3,9 . Dois R-SMADs ativados formam posteriormente complexos triméricos com o mediador comum SMAD4. Esses complexos de fator de transcrição são então capazes de translocar para o núcleo e regular a transcrição dos genes-alvo. Os SMADs podem interagir com uma variedade de diferentes co-ativadores e co-repressores transcricionais, levando à diversificação das possibilidades de regular genes-alvo10. A desregulamentação da sinalização SMAD tem sérias implicações em uma variedade de doenças. De acordo com isso, a sinalização TGFβ/BMP desequilibrada pode levar a patologias vasculares graves, como hipertensão arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditária ou aterosclerose3,11,12,13,14.
As células endoteliais (CE) formam a camada mais interna dos vasos sanguíneos e são, portanto, expostas ao estresse da cisalhamento (SS), uma força de atrito exercida pelo fluxo viscoso do sangue. Curiosamente, os CEs residentes nas partes da vasculatura, que são expostos a altos níveis de uniforme, laminar SS, são mantidos em um estado homeostático e quiescente. Em contraste, as CES que experimentam SS baixas e não uniformes, por exemplo, em bifurcações ou na menor curvatura do arco aórtico, são proliferativas e ativam vias inflamatórias15. Por sua vez, os locais de ECs disfuncionais são propensos a desenvolver aterosclerose. Curiosamente, os CES nessas áreas de atheroprone exibem níveis aberrantemente altos de SMAD2/3 ativados e SMAD1/516,17,18. Nesse contexto, verificou-se que a sinalização TGFβ/BMP aprimorada foi um evento inicial no desenvolvimento de lesões ateroscleróticas19 e a interferência na sinalização de BMP foi encontrada para reduzir significativamente a inflamação vascular, a formação de atheroma e calcificação associada20.
O Ensaio de Ligadura de Proximidade (PLA) é uma técnica bioquímica para estudar interações proteína-proteína em situ21,22. Ele se baseia na especificidade de anticorpos de diferentes espécies que podem ligar proteínas-alvo de interesse, permitindo detecção altamente específica de interações proteicas endógenas a um nível unicelular. Aqui, os anticorpos primários têm que se ligar ao seu epítope alvo a uma distância inferior a 40 nm para permitir a detecção23. Portanto, o PLA é muito benéfico em relação às abordagens tradicionais de co-imunoprecipitação, onde vários milhões de células são necessárias para detectar interações proteicas endógenas. No PLA, anticorpos secundários específicos da espécie, covalentemente ligados a fragmentos de DNA (denominados sondas Plus e Minus), ligam os anticorpos primários e se as proteínas de interesse interagirem, as sondas Plus e Minus se aproximam. O DNA é ligado na etapa seguinte e a amplificação do círculo de rolamento do DNA circular é possível. Durante a amplificação, oligonucleotídeos complementares rotulados fluorescente se ligam ao DNA sintetizado, permitindo que essas interações proteicas sejam visualizadas pela microscopia de fluorescência convencional.
O protocolo descrito aqui permite que os cientistas comparem quantitativamente o número de complexos ativos de transcrição SMAD em condições de SS atheroprotetor e atheroprone in vitro usando PLA. O SS é gerado através de um sistema de bomba pneumática programável que é capaz de gerar fluxo direcional laminar de níveis definidos e permite aumentos stepwise das taxas de fluxo. Este método permite a detecção de interações entre SMAD1/5 ou SMAD2/3 com SMAD4, bem como complexos mistos-R-SMAD. Ele pode ser facilmente expandido para analisar interações de SMADs com co-reguladores transcricionais ou para complexos de fatores de transcrição que não sejam SMADs. A Figura 1 mostra os principais passos do protocolo apresentado abaixo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do protocolo descrito. (A) As células semeadas em slides de 6 canais são expostas ao estresse da cisalhamento com um sistema de bomba pneumática. (B) As células fixas são utilizadas para o experimento PLA ou para condições de controle. (C) As imagens dos experimentos pla são adquiridas com um microscópio de fluorescência e são analisadas por meio do software de análise ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>&micro;-Slide VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>6-channel slide</td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Carl Roth</td><td>K298.1</td><td>Têmpera</td></tr> de <tr><td>albumina de soro bovino</td><td>Carl Roth</td><td>8076.4</td><td>Bloqueio</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>D9542</td><td>Mancha DNA/Núcleos</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Duolink In Reagentes de detecção situ Green</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92014</td><td>PLA kit contendo ligase, tampão de ligação, polimerase e tampão de amplificação (com oligonucleotídeos marcados em verde)</td></tr><tr><td>Sonda PLA In Situ Duolink Anti-Mouse MINUS</td><td>Sonda Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92004</td><td>MINUS</td></tr><tr><td>Sonda Duolink In Situ PLA Sonda Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sonda</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sigma Aldrich/ Merck DUO92002 PLUSDuolink Tampões de lavagem in situ, Fluorescência</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO82049</td><td>PLA tampões de lavagem A e B</td></tr><tr><td>Suplemento de crescimento de células endoteliais Suplemento</td><td>Corning</td><td></td><td>para médio (ECGS)</td></tr><tr><td>Suplemento de soro</td><td></td><td></td> de bezerro fetal <td>para meio</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Software de análise de imagem</td>Solução</tr><tr><td>de formaldeído 4% tamponado</td><td>KLINIPATH/VWR</td><td>VWRK4186. BO1</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Meio</td><td></td><td></td> completo <td>M199 meio basal +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&nbsp; 25 &micro; g/mL Hep +&nbsp; &nbsp; 50 &micro; g/mL ECGS</td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína, Tipo A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>Use 0,1% em PBS para revestimento de canais de fluxo</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7</td><td>GarphPad</td><td></td><td>Programa Estatístico usado para os Gráficos e cálculos estatísticos Sal</td></tr><tr><td>de heparina sódica da mucosa intestinal suína</td><td>Suplemento Sigma Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>para médio (Hep)</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem ibidi</td><td>ibidi</td><td>50001</td><td>Meio de montagem líquida</td></tr><tr><td>Sistema de bomba ibidi</td><td>Bomba pneumática</td><td>ibidi</td><td>10902</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Microscópio confocal</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>suplemento para meio (L-Glu)</td></tr> <tr><td>Médio 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td>Base média</td></tr><tr><td>anticorpo SMAD1</td><td>Abcam</td><td>ab53745</td> do rato <td>Serido para</td></tr><tr><td>o anticorpo SMAD2/3 do rato do PLA</td><td>BD Bioscience</td><td>610843</td><td>Não serido para o PLA em combinação com</td></tr><tr><td>o anticorpo SMAD4 de Sanata Cruz do rato</td> de CST 9515 <td>Sanata Cruz Biotechnology</td><td>sc-7966</td><td>Serido para</td></tr><tr><td>a penicilina 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td><td>do PLA Suplemento da biotecnologia</td><td>P06-07100</td> de PAN <td>para o meio (P/ S)</td></tr> <tr><td>Conjunto de Perfusão BRANCO</td><td>ibidi</td><td>10963</td><td>Tubos usados para 1 dyn / cm2</td></tr><tr><td>Conjunto de Perfusão AMARELO e VERDE</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>Tubos usados para 30 dyn / cm 2 </td></tr><tr><td>rabbit anti-phospho SMAD1 / 5 Antibody</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9516</td><td>Adequado para PLA</td></tr><tr><td>coelho anti- SMAD2 / 3 XP Antibody</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>8685</td><td>Adequado para as</td></tr><tr>tecnologias <td>9515</td><td>da sinalização de pilha</td> do<td>anticorpo do coelho do PLA anti- SMAD4</td><td>Não serido para o PLA em combinação com o BD 610843</td></tr><tr><td>o conector de série para &micro;-Slides</td><td>ibidi</td><td>10830</td><td>tubos de conexão serial</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>6683,1</td><td>Permeabilization</td></tr></tbody></table>

visualização e quantificação de tgfβ/bmp/smad sinalizando em diferentes condições de estresse da tesoura de fluidos usando o ensaio de proximidade-ligação-assay

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Transformando fator de crescimento β (TGFβ)/Proteína Morfogenética Óssea (BMP) a sinalização é fortemente regulada e equilibrada durante o desenvolvimento e homeostase do sistema de vasculatura Portanto, a desregulamentação nesta via de sinalização resulta em patologias vasculares graves, como hipertensão arterial pulmonar, hemorrha pneumética hereditária e atherosclerosis. As células endoteliais (CE), como a camada mais interna dos vasos sanguíneos, estão constantemente expostas ao estresse da tesoura de fluidos (SS). Padrões anormais de SS fluido têm sido mostrados para melhorar a sinalização TGFβ/BMP, que, juntamente com outros estímulos, induzem aterogenese. Em relação a isso, atheroprone, baixo laminar SS foi encontrado para melhorar a sinalização TGFβ/BMP enquanto atheroprotetonte, alto laminar SS, diminui essa sinalização. Para analisar eficientemente a ativação dessas vias, projetamos um fluxo de trabalho para investigar a formação de complexos de fatores de transcrição sob ss de baixo laminar e condições de SS de alta laminar usando um sistema de bomba pneumática comercialmente disponível e ensaio de ligadura de proximidade (PLA).
A sinalização ativa de TGFβ/BMP requer a formação de complexos SMAD trimericos constituídos por dois SMADs regulatórios (R-SMAD); SMAD2/3 e SMAD1/5/8 para sinalização TGFβ e BMP, respectivamente) com um mediador comum SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizando PLA visando diferentes subunidades do complexo trimerico SMAD, ou seja, R-SMAD/co-SMAD ou R-SMAD/R-SMAD, a formação de complexos ativos de fator de transcrição SMAD pode ser medida quantitativa e espacialmente usando microscopia de fluorescência.
O uso de slides de fluxo com 6 pequenos canais paralelos, que podem ser conectados em série, permite a investigação do fator de transcrição formação e inclusão dos controles necessários. 
O fluxo de trabalho aqui explicado pode ser facilmente adaptado para estudos que visam a proximidade de SMADs a outros fatores de transcrição ou para complexos de fator de transcrição que não sejam SMADs, em diferentes condições de SS fluidos. O fluxo de trabalho aqui apresentado mostra uma maneira rápida e eficaz de estudar a sinalização TGFβ/BMP induzida pelo fluido em CEs, tanto quantitativa quanto espacialmente.

Anteriormente, usamos o PLA para detectar interações de diferentes proteínas SMAD3 e analisamos alterações induzidas pelo estresse da tesoura na fosforilação SMAD28.
Aqui, ambos os métodos foram combinados com o protocolo descrito acima. Os HUVECs foram submetidos ao estresse de tesoura de 1 dyn/cm2 e 30 dyn/cm2 e analisados para interações de fatores de transcrição do SMAD. Mostramos que, quando comparado ao alto estresse d...

Aqui, estabelecemos um protocolo para visualizar e analisar simultaneamente múltiplos complexos de SMAD utilizando o ensaio de ligadura de proximidade (PLA) em células endoteliais expostas a condições patológicas e fisiológicas de estresse da tesoura de fluidos.

Visualização e Quantificação de TGFβ/BMP/SMAD Sinalizando em diferentes condições de estresse da tesoura de fluidos usando o ensaio de proximidade-ligação-assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Este protocolo permite que os cientistas comparem quantitativamente o número de complexos de fatores de transcrição em diferentes condições de estresse de tesoura, e será benéfico para pesquisas em biologia vascular. A principal vantagem deste protocolo é o uso de canais de fluxo microfluido que permitem investigações de diversos pares de anticorpos, incluindo os respectivos controles simultaneamente. Para começar, cubra o slide de seis canais adicionando 0,1% de gelatina de pele suína preparada em PBS nos canais por 30 minutos a 37 graus Celsius.Esvazie os canais da solução de gelatina e dos Huvecs de sementes nos slides pré-codificados de seis canais a uma densidade de 2,5 vezes 10 para a sexta células por mililitro em 30 microlitrais de M199 meio completo. Permita que as células aderam por uma hora a 37 graus Celsius na incubadora umidificada. Adicione 60 microliters de M199 pré-avisados meio completo para cada um dos reservatórios.Cultuize as células a 37 graus Celsius por dois dias em uma incubadora umidificada com substituição média após 24 horas. Monte a tubulação de silício nas unidades fluidas, encha os reservatórios com um mínimo de 10 mililitros de meio completo M199 pré-avisado. Conecte as unidades fluidas com tubos ao sistema de bomba e realize o pré-funcionamento sem células para equilibrar o meio e remover qualquer ar restante.Conecte os canais únicos no slide de seis canais usando a tubulação de conexão serial. Conecte o primeiro e o último canal no slide aos tubos montados na unidade fluidica. Para exposição das células a altos níveis de estresse absoluto, aumente o passo de estresse com fases de adaptação, definindo os passos em incrementos de cinco dynes por centímetro quadrado por 30 minutos.Use os aglomerados na tubulação para separar os slides das bombas após a exposição ao estresse da cisalhamento do fluido, evitando derramamento médio na incubadora e transferir lâminas de fluxo no gelo. Ao retirar a tubulação dos reservatórios, use o dedo para fechar o outro lado do reservatório para evitar prender as bolhas de ar no canal. Mantendo o fluxo deslizando sobre o gelo, aspire o meio cuidadosamente dos reservatórios, mas não do canal onde as células residem.Lave as amostras com 90 microliters de PBS estéreis a frio adicionando PBS a um reservatório e aspirando cuidadosamente do outro reservatório, depois repita para todos os canais. Fixar as células adicionando 90 microliters de solução 4%PFA tamponadas ao mesmo reservatório onde o PBS foi adicionado e aspirar o líquido do outro reservatório como demonstrado. Depois de fixar as células em todos os seis canais, transfira as amostras do gelo para a temperatura ambiente, e incubar por 20 minutos.Lave as células três vezes com PBS adicionando PBS a um reservatório e aspirando-a cuidadosamente do outro reservatório em todos os canais, tomando cuidado para não secar os canais. Saciar o acesso pfa adicionando 90 microlitadores de cloreto de amônio ambiente de 15 mililamiliar preparado em PBS a um dos reservatórios. Aspire do outro reservatório e incuba as células por 10 minutos.Permeabilize as células adicionando 90 microlitrais de 0,3% Triton X 100 preparados em PBS no reservatório vazio. Aspire do outro reservatório para cada canal e incubar por 10 minutos, depois lavado três vezes com PBS como demonstrado anteriormente. A 90 microliters de solução de bloqueio PLA estéril para um reservatório.Aspire do outro lado para cada canal e incuba por uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada. Adicione anticorpos primários em anticorpos PLA diluentes e vórtices. Aspire cuidadosamente a solução de bloqueio dos reservatórios e canais.Adicione 30 microliters da solução de anticorpos primários imediatamente no canal vazio inclinando o slide enquanto adiciona a solução. Repita para todos os canais e incubar a quatro graus Celsius na câmara umidificada durante a noite ou a 37 graus Celsius por uma hora. Diluir menos coelho e mais sondas PLA de mouse de um a cinco no diluído de anticorpos PLA.Lave todos os canais duas vezes adicionando 90 microliters de tampão de lavagem A e aspirando como demonstrado. Após aspirar o tampão de lavagem, adicione 30 microliters da solução de sonda PLA e incubar na câmara umidificada. Diluir o tampão de ligadura de um a cinco em D água ionizada e diluir a enzima lygus de um a 40 no tampão de ligadura diluída.Depois de lavar e aspirar completamente o tampão de lavagem A, adicione 30 microliters de solução de ligadura aos canais vazios enquanto inclina o slide e incuba na câmara umidificada. Diluir o tampão de amplificação de um a cinco em água deionizada e, em seguida, diluir a enzima polimerase de um a 80 no tampão de amplificação diluída no gelo. Depois de lavar e aspirar completamente o tampão de lavagem A, adicione 30 microliters de solução de amplificação aos canais vazios enquanto inclina o slide e incuba-o na câmara umidificada.Diluir o DAPI de um a 500 no tampão de lavagem B e lavar todos os canais uma vez adicionando 90 microliters de DAPI contendo tampão de lavagem B, e aspirando como demonstrado para vaporizar os núcleos. Em seguida, lave todos os canais uma vez com o tampão de lavagem B sem DAPI. Diluir o tampão de lavagem B de 1 a 10 em água deionizada e lavar todos os canais uma vez com 90 microliters de tampão de lavagem diluído B.Após aspirar o tampão de lavagem B, adicione imediatamente duas a três gotas do meio de montagem líquida para um reservatório, e incline o slide para distribuir o meio de montagem em todos os canais.Armazene as amostras a quatro graus Celsius em um ambiente umidificado até a imagem. Huvecs foram expostos a alto e baixo estresse. O baixo estresse de cisalhamento aumentou as interações proteicas SMAD nos citos e núcleos.Controles de anticorpos únicos mostraram não a poucos sinais, provando o sucesso do experimento. O aumento da concentração de anticorpos resultou em um maior número de eventos de PLA por célula, mas a diferença nos sinais pla entre células expostas de alto e baixo estresse foi reduzida. Tampões auto-fabricados para bloqueio e diluição de anticorpos podem ser usados como uma alternativa para buffers comerciais.A quantificação de eventos PLA para soluções comerciais e auto-feitas diluientes e de bloqueio mostrou o mesmo padrão de sinais PLA nas áreas citosolicas e nucleares. No entanto, o número total de eventos pla por célula foi maior com soluções comerciais. Uma combinação de anticorpos SMAD Two/Three, SMAD Four foi usado onde o anticorpo SMAD Four não era adequado para experimentos de imunofluorescência.Não houve diferença nos eventos pla na condição experimental versus controle, indicando a importância de selecionar a combinação correta de anticorpos para detectar os eventos PLA. O protocolo descrito pode ser adaptado para detectar as interações de complexos de fatores de transcrição diferentes dos SMADs e, portanto, ajudar a entender a regulação genética em condições de proteção athero e athero.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui nós mostramos como usar Assay Proximidade Ligadura (PLA), com uma combinação de anticorpos para visualizar proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) de sinalização em células fixas. Esta técnica permitiu-nos a seguir o acúmulo nuclear de BMP activada endógena efetoras complexos e quantificar os seus níveis ao longo do tempo sob BMP4 estimulação.

Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

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Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus

Apresentamos um ensaio de força de tração de alta produtividade fabricado com borracha de silicone (PDMS). Este novo ensaio é adequado para o estudo de alterações físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos e biomédicos e doenças. Nós demonstramos a utilidade deste método medindo um aumento dependente TGF-β na contractilidade durante a transição epithelial-à-mesenchymal.

Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal

O objetivo deste protocolo é executar uma co-cultura dinâmica de macrófagos humanos e miofibroblasts em andaimes eletroscarados tubulares para investigar a regeneração de tecidos conduzidos por materiais, usando um bioreator que permite o desacoplamento do estresse da tesoura e do estiramento cíclico.

Um Bioreator multi-cue para avaliar a capacidade inflamatória e regenerativa de biomateriais sob fluxo e estiramento

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Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Um modelo in vitro do nicho vascular da medula óssea é estabelecido pela semeadura de células mesenquimais e endoteliais em hidrogéis pré-moldados de PEG 3D. As redes endoteliais, os componentes da MEC e a atividade da FA dos nichos variam dependendo do fator de crescimento utilizado. A plataforma pode ser usada para modelos avançados de câncer.

Estabelecimento simples de um nicho osteogênico vascularizado da medula óssea usando hidrogéis pré-moldados de poli(etilenoglicol) (PEG) em uma microplaca de imagem

Aprenda a visualizar e quantificar complexos SMAD em células endoteliais sob diferentes condições de estresse de cisalhamento usando ensaio de ligação de proximidade. Este método avança a pesquisa em biologia vascular.

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Visualização e Quantificação de TGFβ/BMP/SMAD Sinalizando em diferentes condições de estresse da tesoura de fluidos usando o ensaio de proximidade-ligação-assay

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