Usando Baseplating e um Miniscópio Pré-ancorado com uma Lente Objetiva para Pesquisa Transiente de Cálcio em Camundongos

Este miniscópio pode reduzir o problema de encolhimento com cimento dentário durante o procedimento de placa de base e aumentar a taxa de sucesso das gravações de miniscópio de sinais de fluorescência em configuração de dois comprimentos. Se o transiente de fluorescência não puder ser observado durante a baseplating, verifique a expressão do indicador de cálcio e a localização de uma lente de relé na fatia cerebral. Comece com a montagem da agulha interna de um cateter intravenoso de calibre 20 com um diâmetro de um milímetro no braço estereotáxico.

Abaixe o cateter para o ammonis de milho ventral 1 na região alvo. Em seguida, abaixe a agulha de microinjeção a uma velocidade de 100 a 200 micrômetros por minuto no cornu ammonis 1 ventral e infunda 200 nanolitros do vetor viral na região alvo a uma velocidade de 25 nanolitros por minuto. Depois de permitir que o vírus se difunda por 10 minutos, retire a agulha de microinjeção a uma velocidade de 100 a 200 micrômetros por minuto.

Depois de desinfetar a lente de relé, mergulhe a lente em solução salina fria livre de pirogênio até a implantação. Usando uma braçadeira de micro buldogue com tubulação de encolhimento térmico, segure a lente do relé e coloque-a em cima da região alvo a uma velocidade de 100 a 200 micrômetros por minuto. Em seguida, estabilize a lente com cimento dental.

Para definir um miniscópio, prenda a lente objetiva na parte inferior e monte a placa de base no miniscópio. Enrole 10 centímetros de filme de parafina ao redor do lado de fora da placa de base. Usando argila adesiva reutilizável, segure o miniscópio com a sonda de braço estereotáxica.

Alinhe a lente objetiva sobre a lente de relé com o mínimo de espaço possível entre as lentes. Use cimento dentário para garantir o posicionamento da placa de base, de modo que o cimento toque apenas o filme de parafina. Quando o cimento dentário tiver secado, remova o filme de parafina, a placa de base e o miniscópio, mantendo a base de cimento dentário oca.

Sele a lente do relé com borracha de silicone de moldagem e cubra a borracha de silicone com uma fina camada de cimento dental. Desligue o mouse dos instrumentos estereotáxicos e coloque-o em uma câmara de recuperação. Para baseplating, corte a fina camada do telhado de cimento dental cuidadosamente com um rongeur de osso e remova a borracha de silicone.

Limpe a superfície da lente do relé com álcool a 75%. Prenda o parafuso ajustado ao lado da placa de base para fixá-lo na parte inferior do miniscópio. Ajuste o deslizamento de foco para estar a aproximadamente 2,7 a 3 milímetros da caixa principal.

Quando a configuração estiver concluída, conecte o miniscópio à placa de aquisição de dados e conecte o miniscópio a uma porta USB 3.0 em um computador. Execute o software de aquisição de dados desenvolvido pela equipe da UCLA. Ajuste a exposição a 255, o ganho a 64x e o LED de excitação a 5%Para conectar o miniscópio ao software de aquisição de dados, clique no botão de conexão e assista à transmissão ao vivo do software de aquisição de dados considerando a margem da lente de relé como um marco.

Uma vez que a lente de relé é encontrada, alinhe a lente objetiva de miniscópio com a lente de relé manualmente. Ajustando os vários ângulos e distâncias do miniscópio, comece a procurar os sinais de fluorescência. Mantendo o miniscópio na posição ideal, mova o braço estereotáxico em direção ao miniescopo e adira o miniscópio ao braço estereotáxico com argila adesiva reutilizável.

Procure a melhor visualização ajustando ligeiramente os braços X, Y e Z. Ajuste o ângulo entre a superfície da lente objetiva e a lente do relé girando a barra auricular, a barra do dente ou a argila adesiva reutilizável no eixo Z. A expressão viral e o implante do cristalino são bem-sucedidos quando pelo menos uma célula deslocou transientes de fluorescência durante a baseplating.

Fixe a placa de base firmemente com a menor quantidade possível de cimento dentário enquanto monitora a região de interesse para garantir que a posição ideal não mude. No estudo representativo, o procedimento de baseplating fictício mostrou-se vantajoso, pois resultou em um desvio menor na localização da placa de base do que o procedimento original. O deslocamento da placa de base também foi influenciado pela altura do cimento dentário.

A placa de base que estava ancorada 0,5 centímetros acima do crânio se deslocou significativamente menos do que a placa de base que foi fixada um centímetro acima do crânio. Em um exemplo de imagem bem-sucedida durante o procedimento de revestimento de base, transientes de fluorescência juntamente com vasos sanguíneos foram observados no animal anestesiado. Transientes de fluorescência foram observados cinco dias após o baseplating, mesmo quando o camundongo estava se comportando livremente em sua gaiola doméstica com apenas uma ligeira mudança de posição.

Imagens subsequentes de cálcio de camundongos foram realizadas. Em alguns casos, ocorreram problemas durante o procedimento de baseplating, como a ausência de qualquer coisa, exceto um fundo uniforme ou visibilidade das margens dos glóbulos brancos. sem transientes de fluorescência.

É importante fixar a placa de base firmemente na região alvo com a menor quantidade possível de cimento dental. Com a técnica de ardósia, os pesquisadores podem observar longitudinalmente a atividade neural através disso. Com a licença adequada, esse procedimento também pode ser aplicado para observar a rede neural no campo de visão.