Name: Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprenda a usar imagem por bioluminescência para acompanhar infecções urinárias em camundongos em tempo real. Este método reduz o número de animais necessários e melhora a reprodutibilidade das pesquisas.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen; G0A6113N), o Conselho de Pesquisa de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. e W.E.) e o VIB (para T.V.). W.E. é um pesquisador clínico sênior da Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen). A cepaUTI89-lux foi um presente generoso do laboratório13do Prof. Seed.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Comunitário da União Europeia e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da KU Leuven (P158/2018).
1. Bactérias de cultivo (adaptadas a partir de7,13,14)
<ol><li>Preparação<ol>
<li>Escolha uma cepa UPEC luminescente que melhor se encaixe nas necessidades experimentais. NOTA: Aqui, o isolado da cistite clínica, UTI89 (E. coli), foi selecionado por causa de sua capacidade uropatogênica tanto em humanos quanto em roedores, e seu uso comum nos modelos murina UTI5,7,15. A cepa isogênica bioluminescente que carrega o lux operon completo (luxCDABE) é ainda referida como UTI89-lux. Este operon também carrega genes de resistência de sulfato de kanamicina (Km). Portanto, o Km pode ser usado para selecionar colônias bioluminescentes13.</li>
		<li>Faça uma curva de correlação para a UFC e densidade óptica a 600 nanômetros (OD 600 nm) para a cepa bacteriana escolhida7.<ol>
<li>Para isso, as bactérias da cultura (usando o protocolo abaixo) e fazem 8 diluições diferentes em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS). Meça o OD a 600 nm para todas essas diluições e emplaque-as em placas de Luria-Bertani (LB) para determinar a UFC.</li>
			<li>Plote os valores de 600 nm e os valores da UFC para determinar a correlação e obter uma curva padrão. NOTA: Para experimentos futuros, meça o OD em 600 nm e use esta curva padrão para obter uma estimativa instantânea da UFC em uma solução bacteriana. ATENÇÃO: UPEC são bactérias patogênicas, garantem que as salas estejam adequadamente equipadas e usem equipamentos de proteção individual.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Três dias antes da instilação<ol>
<li>Obtenha colônias únicas, espalhando o estoque de glicerol de bactérias, usando um laço de inoculação, em placas LB suplementadas com 50 μg/mL Km e cultura durante a noite a 37 °C. Sele essas placas com um filme de parafina para armazenar a 4 °C até 1 semana.</li>
	</ol></li>
	<li>Dois dias antes da instilação<ol>
<li>Encha um tubo inferior redondo de poliestireno de 14 mL estéril com tampas de encaixe de dupla posição com 5 mL de caldo LB complementado com 50 μg/mL Km. Escolha uma única colônia bacteriana com um laço de inoculação e adicione isso ao caldo LB. Vórtice para 10 s para garantir a mistura adequada.</li>
		<li>Cultura estaticamente com a tampa de estalo na posição aberta a 37 °C durante a noite. NOTA: O crescimento estático de E. coli promove a expressão do tipo 1-pili, que são fundamentais para a adesão e invasão de células epiteliais urinárias.</li>
		<li>Prepare um Erlenmeyer estéril ou um frasco de cultura.</li>
	</ol></li>
	<li>Um dia antes da instilação<ol>
<li>Após a incubação, vórtice do tubo para 10 s para garantir a homogeneização adequada da cultura bacteriana. Faça uma subcultura no Erlenmeyer adicionando 25 μL da suspensão bacteriana a 25 mL de meio LB fresco sem antibióticos.</li>
		<li>Feche o Erlenmeyer e a cultura estaticamente a 37 °C durante a noite.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia da instilação<ol>
<li>Vórtice o Erlenmeyer por 10 s para garantir a mistura adequada.</li>
		<li>Despeje a cultura do Erlenmeyer em um tubo de cultura de 50 mL e centrífuga a 3.000 x g e 4 °C por 5 min. Decante o supernatante e resuspenque a pelota bacteriana em 10 mL de PBS e vórtice e vórtice novamente por 10 s.</li>
		<li>Escolha a concentração experimental do inóculo (UFC) e utilize a curva padrão obtida na etapa 1.1.2 para determinar o OD correspondente de 600 nm.</li>
		<li>Adicione 1 mL da cultura bacteriana resuspended em 9 mL de PBS estéril e verifique o OD a 600 nm. Ajuste ainda mais adicionando PBS estéril ou solução bacteriana concentrada, até que o OD 600 nm desejado seja atingidopor 7. NOTA: Por exemplo, para UTI89-lux ajuste a cultura adicionando PBS até que o OD 600 nm atinja 0,45, correspondendo a 2 x 107 CFU/50 μL. Para verificar o número de CFUs viáveis, faça diluições seriais de 10 vezes e a placa 50 μL do quinto e sexto diluições de 10 vezes em placas LB em triplicado para obter menos de 300 colônias. Conte as colônias obtidas no dia seguinte após a incubação durante a noite a 37 °C. OD 600 nm dá uma leitura instantânea, mas usa CFU como controle de qualidade.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inoculação dos animais (adaptada a partir de7,16)
<ol><li>Preparação dos animais<ol>
<li>Escolha a cepa do mouse desejada dependendo da questão da pesquisa e disponibilidade de linhas de knock-out, detalhes experimentais e diferenças na suscetibilidade de UTI5,17. Tenha em mente que o cateterismo transuretral é mais fácil em camundongos fêmeas. Não use animais com menos de 8 semanas, pois são imunologicamente imaturos. Aqui, foram usados camundongos C57Bl/6J femininos de 12 semanas de idade.</li>
		<li>Peça os animais com bastante antecedência e deixe-os se aclimatar, idealmente por 7 dias. Animais domésticos em gaiolas ventiladas individualmente, sob condições padrão de luz/escuridão de 12 horas.</li>
		<li>Raspe a região abdominal dos animais para limitar a perda de sinal. Não use creme para depilação, pois pode queimar a pele dos animais rapidamente. Contenha o animal segurando firmemente os membros traseiros e desajeitados com a mão não dominante enquanto se barbeia com a mão dominante. Alternativamente, raspe sob anestesia isoflurane. NOTA: Os animais foram raspados 2 dias antes da imagem, considerando que os animais irão preparar ainda mais a área raspada.</li>
		<li>Forneça água e ad libitum alimentar padrão durante todo o experimento. No entanto, privar os animais da água 2h antes da instilação para minimizar o volume da bexiga durante a instilação.</li>
		<li>Monte uma ponta de angiocateter de 24 G estéril em uma seringa de 100 μL e encha a seringa com a solução bacteriana preparada na etapa 1.5.3. NOTA: Para determinar a luminescência de fundo, obtenha uma imagem de linha de base antes da instilação (ver passo 3, abaixo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instilação dos animais<ol>
<li>Coloque os animais em uma câmara de indução e anestesia-os usando inalação de isoflurane com oxigênio puro como gás transportador (indução a 3% e manutenção em 1,5%).</li>
		<li>Coloque um animal em uma superfície de trabalho na posição supina e mantenha uma anestesia isoflurane estável usando um cone de nariz durante a instilação. Aplique a pomada ocular.</li>
		<li>Expulse a urina residual aplicando compressão suave e fazendo movimentos circulares na região suprapúbica. Limpe o abdômen inferior com 70% de etanol antes da instilação.</li>
		<li>Lubrifique a ponta do cateter com soro fisiológico normal. Coloque o dedo indicador da mão não dominante no abdômen e empurre-o suavemente para cima. Inicie o cateterismo da uretra em um ângulo de 90° (verticalmente) e uma vez que a resistência seja encontrada, incline-a horizontalmente antes de inseri-la ainda mais (0,5 cm). NOTA: Nunca empurre com força o cateter, pois isso causará danos à uretra. Movimentos de giro suaves podem ser úteis na inserção de cateter. Por outro lado, a falta de resistência geralmente indica inserção errônea na vagina.</li>
		<li>Realize uma instilação lenta (5 μL/s) de 50 μL do inóculo bacteriano (2 x 107 CFU). NOTA: Volumes mais altos ou instilação mais rápida podem causar refluxo aos rins. Durante a prática da técnica, a tinta azul pode ser usada para avaliar o refluxo.</li>
		<li>Após a instilação, mantenha a seringa e o cateter no lugar por mais alguns segundos e, em seguida, retraia lentamente para evitar vazamentos. Regissuas irregularidades, como uma alta quantidade de vazamento ou um meatus ensanguentado e exclua animais, se necessário.</li>
		<li>Posicione o animal em posição supina no cone do nariz da câmara de imagem e repita as etapas anteriores 2.1.1-2.1.6 para todos os animais restantes. Use um cateter por grupo experimental. Certifique-se de que a anestesia seja continuada e minimize o tempo entre o primeiro e o último animal.</li>
		<li>Se necessário, administre antibióticos ou medicamentos experimentais, antes ou depois da imagem (etapa 3). Por exemplo, para administrar enrofloxacina, adicione 40 μL da solução enrofloxacina (100 mg/mL) a 3,96 mL de soro fisiológico para obter uma diluição de 1/100. Injete 100 μL/10 g subcutâneamente às 9:00 e 17:00 para administrar 10 mg/kg de enrofloxacina duas vezes por dia durante 3 dias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Imagem de bioluminescência
<ol><li>Preparação e seleção de parâmetros de imagem<ol>
<li>Abra o software de aquisição da BLI (ver Tabela de Materiais) e clique em Initialize no dispositivo de imagem (ver Tabela de Materiais) para testar a câmera e o sistema de controlador de palco e resfriar a câmera CCD a -90 °C. NOTA: Durante esse processo, a porta está trancada, e o progresso da inicialização pode ser seguido no painel de controle. Uma luz verde indica que a temperatura de -90 °C é atingida. Um aviso aparecerá se a imagem for tentada antes da conclusão da inicialização.</li>
		<li>Certifique-se de que os dados são salvos automaticamente: Clique na aquisição de auto-salvamento e selecione a pasta correta.</li>
		<li>Selecione Luminescência e Fotografia. Verifique as configurações padrão de luminescência: Defina filtro de excitação para bloquear e filtro de emissão para abrir.</li>
		<li>Defina o tempo de exposição ao Auto ao tirar a primeira imagem, especialmente quando se espera um sinal fraco para garantir um número adequado de contagem de fótons. Para medições in vivo e sinais brilhantes, ajuste o Tempo de Exposição para ~30 s. Se a imagem estiver saturada, um aviso será exibido. Se isso acontecer, reduza o tempo de exposição.</li>
		<li>Selecione o binning médio, F/stop 1 e escolha o campo de visão correto(FOV) (D para 5 animais).</li>
		<li>Ajuste a altura do sujeito para 1 cm ao fotografar ratos.</li>
		<li>Clique em Adicionar três vezes no Painel de Controle de Aquisição para obter uma sequência de três imagens, como replicação técnica.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagiologia<ol>
<li>Coloque os camundongos na câmara de imagem na posição supina e use o cone do nariz múltiplo para manter a anestesia (isoflurane 1,5%) durante todo o experimento. Imagem de até 5 ratos simultaneamente e separe os animais usando o defletor de luz para evitar o reflexo.</li>
		<li>Feche a porta e clique em Adquirir para iniciar a sequência de imagens.</li>
		<li>Preencha informações detalhadas sobre o experimento (animais selvagens e animais de nocaute, tratamentos, dia de imagem, etc.). As configurações de imagem, como o tempo de exposição, são salvas automaticamente.</li>
		<li>Remova os ratos da câmara de imagem e devolva-os para a gaiola. Verifique se há recuperação completa após a anestesia. Em poucos minutos, os animais devem estar totalmente acordados e explorativos. Não forneça analgesia, pois isso pode interferir no cursoUTI 18.</li>
		<li>Devolva as gaiolas aos racks ventilados até o próximo ciclo de imagem. Após a conclusão do experimento, eutanize os animais por asfixia de CO2 ou luxação cervical. Faça isso antes da recuperação da anestesia isoflurane para minimizar a angústia.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise das imagens<ol>
<li>Inicie o software de imagem e carregue o arquivo experimental clicando em Procurar.</li>
		<li>Use a Paleta de ferramentas para ajustar a escala de cores da imagem. Padronize o aspecto visual dos resultados utilizando as mesmas configurações para todas as imagens, ou seja, use uma escala logarítmica com um mínimo de 104 a um máximo de 107 fótons. Esses ajustes não afetam os dados brutos, mas apenas a apresentação gráfica.</li>
		<li>Use as ferramentas do ROI para desenhar uma região de interesse (ROI) na imagem. Certifique-se de que o ROI é grande o suficiente para cobrir a área completa e usar as mesmas dimensões para todas as imagens. Aqui, um ROI quadrado de 3,5 cm x 4,5 cm foi colocado sobre o abdômen inferior.</li>
		<li>Clique na medição do ROI para quantificar a intensidade da luz (contagens ou fluxo total de fótons). Exporte esses dados e utilize a média das réplicas técnicas. NOTA: As contagens representam o número de fótons detectados pela câmera e só devem ser usados para o controle de qualidade da imagem. Para relatar dados, use fluxo total de fótons. O fluxo total de fótons é mais fisiologicamente relevante, pois representa a luz emitida da superfície e é uma unidade calibrada, que é corrigida para o tempo de exposição (por segundo).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+urinary+tract+infections%3A+incidence%2C+morbidity%2C+and+economic+costs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li>
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</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Vantagens da BLI em relação às contagens de UFC Dados longitudinais Uma grande desvantagem do método tradicional de contagem da UFC para quantificar a carga microbiana é a exigência de homogeneizações de órgãos post-mortem, fornecendo apenas um ponto de dados transversais por animal. Por outro lado, a BLI permite o acompanhamento longitudinal não invasivo de animais infectados. Os animais podem ser imagens de 2 a 3 vezes por dia, fornecendo uma visão detalhada da cinética da infecção. Além...

As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos. Quase metade de todas as mulheres experimentarão uma UTI sintomática durante sua vida1. Infecções limitadas à bexiga podem dar origem a sintomas urinários como aumento da frequência urinária, urgência, hematuria, incontinência e dor. Quando a infecção sobe para o trato urinário superior, os pacientes desenvolvem pyelonephritis, com mal-estar, febre, calafrios e dor nas costas. Além disso, até 20% dos pacientes com UTI sofrem de infecções recorrentes, resultando em uma redução drástica na sensibilidade a antibióticos2,3,4. Nos últimos anos, tem havido um crescente interesse por novas terapias para o tratamento e prevenção da UTI recorrente. Apesar de uma melhor compreensão da imunidade inata e adaptativa do trato urinário inferior e dos fatores de virulência bacteriana necessários para invasão e colonização, nenhuma mudança radical no regime de tratamento foi traduzida para a prática urológica diária2. Para estudar a patogênese e a suscetibilidade da UTI in vivo,é indispensável um ensaio reprodutível e não invasivo.
Vários modelos de UTI animal foram descritos variando de nematoides a primatas, mas o modelo murino é predominantemente usado5,6. Este modelo consiste em cateterismo transuretral de camundongos (femininos) e posterior instilação de suspensão bacteriana, mais comumente uropatogênica Escherichia coli (UPEC), diretamente no lúmen da bexiga7. Após a inoculação, a carga bacteriana tem sido tradicionalmente quantificada por determinação de unidades formadoras de colônias (UFC). Esta técnica requer sacrificar animais para obter homogeneizações de órgãos pós-morte e diluições seriais, limitando a produção de dados e a reprodutibilidade. Além disso, o acompanhamento longitudinal da carga bacteriana em animais individuais não é possível usando essa técnica.
Em 1995, Contag et al. sugeriram o uso de patógenos bioluminescentes marcados para monitorar processos de doenças em animais vivos8,9. Desde então, a bioluminescência (BLI) tem sido aplicada a inúmeros modelos de infecção, como meningite, endocardite, osteomielite, pele e infecções por tecidos moles, etc.10,11,12. No modelo murine UTI, pode ser utilizada uma cepa UPEC com o lux operon completo(luxCDABE)da Photorhabdus luminescens 13. Uma reação enzimática é catalisada pela luciferase bacteriana que depende da oxidação de aldeídos de cadeia longa reagindo com mononucleotídeo de flavin reduzido na presença de oxigênio, produzindo flavin oxidado, um ácido graxo de cadeia longa e luz12. Os códigos lux operon para a luciferase e outras enzimas necessárias para a síntese dos substratos. Portanto, todas as bactérias metabolicamente ativas emitirão luz verde azul (490 nm) sem a necessidade da injeção de um substrato exógeno12. Fótons emitidos por bactérias lux-taggedpodem ser capturados usando câmeras de dispositivo (CCD) altamente sensíveis e resfriadas.
O uso de bactérias bioluminescentes em um modelo para UTI permite a quantificação longitudinal e não invasiva da carga bacteriana, omitindo a necessidade de sacrificar animais em pontos de tempo fixos durante o acompanhamento para determinação da UFC. Apesar da ampla gama de possibilidades, acumulando evidências para a robustez desta técnica BLI em outros campos e suas vantagens sobre modelos clássicos de UTI, ela não foi amplamente implementada na pesquisa da UTI. O protocolo aqui apresentado fornece um guia passo a passo detalhado e destaca as vantagens da BLI para todas as futuras pesquisas da UTI.

<table><tbody><tr><td>Placa de poliestireno de fundo plano preto de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3925</td><td>para imagem in vitro</td></tr><tr>Aparador de cabelo<td>Aesculap ISIS</td><td>Aesculap</td><td>GT421</td><td>, com tampa GT608</td></tr><tr><td>Vaporizador</td> de <td>anestesia Aparelho de Harvard limitado</td><td>N/A</td><td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td></tr><tr><td>Baytril 100 mg/mL</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td>Enrofloxacina</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td><td>BD</td><td>382912</td><td>Angiocateter amarelo, use ponta de plástico estéril para instilação</td></tr><tr><td>Camundongos C57Bl/6J</td><td>Janvier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628146</td><td></td></tr><tr><td>Dropsense 16</td><td>Unchained Labs</td><td>Trinean</td><td>para medir OD 600nm</td></tr><tr><td>Tamponamento de fosfato de Dulbecco Salino, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REF 14040-083</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70% desnaturado 5L</td><td>VWR international</td><td>85825360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14ml Tubo de Poliestireno de Fundo Redondo, Snap-Cap</td><td>Corning</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50ml seringa</td><td>Greiner</td><td>227285</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton GASTIGHT, trava luer PTFE, 100 &micro; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26203</td><td>para garantir a instilação bacteriana lenta de 50 &micro; L</td></tr><tr><td>Alça de inoculação</td><td>Roth</td><td>6174.1</td><td>suporte: Art. Nº 6189.1</td></tr><tr><td>Iso-Vet 1000mg/g</td><td>Dechra Produtos veterinários</td><td>N/A</td><td>Isoflurano</td></tr><tr><td>Espectro IVIS Sistema de imagem in vivo</td><td>PerkinElmer</td><td>REF 124262</td><td>dispositivo de imagem</td></tr><tr><td>Solução de canamicina 50 mg/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem viva</td><td>PerkinElmer</td><td>N/A</td><td>BLI software de aquisição, versão 4.7.3</td></tr><tr><td>Luria Caldo Bertani</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>REF L3022</td><td>alternativamente pode ser feito</td></tr><tr><td>Luria Caldo Bertani com ágar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>REF L2897</td><td>alternativamente pode ser feito</td></tr><tr><td>placa de Petri Sterilin 90mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>para encher com ágar LB suplementado com Km</td></tr><tr><td>Pyrex Frasco de cultura 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLW1141/08-20EA</td><td></td></tr><tr><td>Slide 200 Trinean</td><td>Unchained Labs</td><td>701-2007</td><td>para medir OD 600nm</td></tr><tr><td>UTI89-lux</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Generoso presente do Prof.</td></tr><tr><td>Seed Vortex</td><td>VWR international</td><td>444-1372</td><td></td></tr></tbody></table>

acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos e são tratadas rotineiramente com antibióticos empíricos. No entanto, devido ao aumento da resistência microbiana, a eficácia dos antibióticos mais usados diminuiu. Para encontrar opções alternativas de tratamento, há uma grande necessidade de uma melhor compreensão da patogênese DA UTI e dos mecanismos que determinam a suscetibilidade da UTI. Para investigar isso em um modelo animal, é indispensável um ensaio reprodutível e não invasivo para estudar o curso da UTI.
Durante anos, o padrão-ouro para a enumeração da carga bacteriana tem sido a determinação de Unidades de Formação de Colônias (UFC) para um determinado volume amostral. Esta técnica requer homogeneizações de órgãos pós-morte e diluições seriais, limitando a produção de dados e a reprodutibilidade. Como alternativa, a bioluminescência (BLI) está ganhando popularidade para determinar a carga bacteriana. A rotulagem de patógenos com um operon lux permite a detecção e quantificação sensíveis de forma não invasiva, permitindo assim o acompanhamento longitudinal. Até agora, a adoção da BLI na pesquisa da UTI permanece limitada.
Este manuscrito descreve a implementação prática de BLI em um modelo de infecção do trato urinário do rato. Aqui, é fornecido um guia passo-a-passo para a cultura de bactérias, instilação intravesical e imagem. A correlação in vivo com a UFC é examinada e uma prova de conceito é fornecida comparando a carga bacteriana de animais infectados não tratados com animais tratados com antibióticos. Além disso, são discutidas as vantagens, limitações e considerações específicas para a implementação da BLI em um modelo in vivo UTI. A implantação da BLI no campo de pesquisa da UTI facilitará muito a pesquisa sobre a patogênese da UTI e a descoberta de novas formas de prevenir e tratar a ITU.

In vivo BLI correlaciona-se com a UFC do inóculo no momento da instilação. Para avaliar o limite de detecção do BLI in vivo e a correlação com a UFC do inóculo, os camundongos foram infectados com diferentes concentrações de UTI89-lux e PBS como controle negativo. Antes da instilação, animais não infectados eram escaneados para determinar a luminescência de fundo. As imagens subsequentes foram obtidas imediatamente após a instilação(Fig...

Este manuscrito descreve a administração intravesical de bactérias uropatômicas com um operon lux para induzir uma infecção do trato urinário em camundongos e posterior análise longitudinal in vivo da carga bacteriana usando imagens de bioluminescência.

Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

A enumeração das unidades formadoras de colônias limitava a reprodutibilidade da pesquisa no campo da UTI. A imagem de bioluminescência avançará na pesquisa vivo UTI sobre fisiologia da bexiga, patogênese UTI e suscetibilidade. A imagem de bioluminescência permite o acompanhamento longitudinal com visão em tempo real da evolução da infecção.Além disso, reduz drasticamente o número de animais necessários. A bioluminescência de imagens facilita a pesquisa sobre infecções recorrentes ou crônicas, que são frequentes em humanos. Além disso, os pesquisadores podem identificar infecções ascendentes ou disseminação no sangue usando imagens de bioluminescência.Obtenha colônias únicas, espalhando o estoque de glicerol de bactérias com um laço de inoculação em placas LB suplementadas com sulfato de kanamicina, e culminando durante a noite a 37 graus Celsius. Encha um tubo traseiro redondo de poliestireno de 14 mililitros, com tampas de encaixe de dupla posição com cinco mililitros de caldo LB complementados com sulfato de kanamycin. Escolha uma única colônia bacteriana com um laço de inoculação, e adicione isso ao caldo LB.Vórtice por 10 segundos para garantir a mistura adequada. Cultura esta

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo vai demonstrar os métodos para induzir transurethrally infecções do trato urinário do mouse e quantificar a extensão das infecções resultantes.

Indução transuretral de rato infecção urinária

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Este artigo descreve a administração...

Imagem bacteriana Bioluminescent<em&gt; Em Vivo</em

Fonte: Valentine, M. E., et al. Geração de mutantes de deleção de genes em Pseudomonas aeruginosa e teste de atenuação de virulência em um modelo simples de infecção em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o uso da bioluminescência para visualizar e comparar o comportamento in vivo de cepas bacterianas virulentas e atenuadas em camundongos. Ele descreve a preparação de suspensões bacterianas bioluminescentes e sua injeção intraperitoneal em camundongos. A cepa virulenta exibe...

Rastreando a dinâmica da infecção bacteriana em um camundongo usando bioluminescência

Fonte: de Vries, C. R., et al., Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de feridas por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra uma técnica de imagem bioluminescente para monitorar a progressão da infecção bacteriana em um modelo de camundongos vivo. Bactérias patogênicas modificadas com o sistema repórter luxABCDE emitem luz no local da infecção, permitindo a visualização de bactérias metabolicamente ativas. Ao imagear o camundongo ao longo do tempo, os...

Imagem por Bioluminescência de Infecções Bacterianas em Camundongos

Fonte: Valentine, M. E., et al., Geração de mutantes de deleção gênica em quadro em Pseudomonas aeruginosa e Teste para Atenuação de Virulência em um Modelo Simples de Infecção em Camundongo. J. Vis. Experiência (2020)Este vídeo demonstra o uso de uma abordagem de imagem baseada em bioluminescência para monitorar infecção bacteriana em um modelo de camundongo vivo. Imagens bioluminescentes e por raios X sequenciais permitem visualização em tempo real e localização anatômica da infecção...

Imagem em tempo real de infecção bacteriana em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Fonte: Luyts, N., et al. Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando imagem por bioluminescência. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra a indução e o rastreamento da infecção do trato urinário em um modelo camundongo usando E. coli bioluminescente injetada na bexiga, onde ocorrem adesão, invasão bacteriana e replicação intracelular. A luz emitida pelo operon bioluminescente serve como marcador em tempo real da carga bacteriana durante a...

Visualização da Infecção do Trato Urinário em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

Neste vídeo, descrevemos a técnica de administração intravesical de bactérias uropatogênicas para gerar um modelo de infecção do trato urinário em camundongos. Este modelo pode ser usado para entender a disseminação da infecção bacteriana uropatogênica no sistema urinário e os mecanismos que determinam a suscetibilidade à ITU.

Modelo de Geração de Infecção do Trato Urinário: Uma Técnica para Administrar Bactérias Uropatogênicas em Camundongos para Desenvolver Modelo de Infecção do Trato Urinário

De imagem multi-modalidade é uma abordagem útil para estudar a colonização bacteriana em modelos de animais pequenos. Este protocolo descreve a infecção de camundongos com...

4D Multimodalidade de imagens de<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecções em Ratos

O modelo estabelecido de transuretral cateterismo de ratos permite o estudo das patologias de bexiga, incluindo a infecção do trato urinário, mas só pode ser realizado nas fêmeas. Um novo modelo de instilação transuretral masculino, apresentado aqui, permitirá a pesquisa em uma área marcada por fortes diferenças clínicas e epidemiológicas entre os sexos.

Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

Aprenda a usar imagem por bioluminescência para acompanhar infecções urinárias em camundongos em tempo real. Este método reduz o número de animais necessários e melhora a reprodutibilidade das pesquisas.

Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem

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