Name: Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a criar um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar metástases de câncer de mama. Este método permite testar rapidamente drogas e radiação em um ambiente fisiologicamente relevante, mantendo as interações tumor-cérebro-hospedeiro.

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Queremos agradecer julia Farnan, Kayla Green e Tiziana DeAngelis por sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Programa de Subvenção universal de pesquisa da Pensilvânia (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA2227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) e W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Este protocolo foi aprovado e segue as diretrizes de cuidados com animais pelo Comitê de Uso e Uso Institucional de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Drexel (IACUC). Camundongos fêmeas atímicas nu/nu (6-8 semanas de idade) foram utilizados neste estudo.
1. Injeção intracraniana de células tumorais
<ol><li>Esterilizar todos os equipamentos (pinças, tesouras, tesoura suturando, broca de mão) sob um ciclo seco de uma autoclave por até 45 minutos em bolsas de esterilização, incluindo um indicador de esterilização. Se realizar cirurgias em vários animais, esterilize ferramentas entre animais usando um esterilizador de contas aquecida (até 3x).</li>
	<li>Anestesiar os camundongos de acordo com o protocolo de cuidados com animais dos usuários (por exemplo, isoflurane (4% para indução, manutenção de 1-2%) e administrar analgesia (subcutânea, 0,1mL de 0,1mg/kg buprenorphine SR-LAB) antes do início da cirurgia. Certifique-se de profundidade de anestesia ideal com uma pitada de dedo do dedo do sol.</li>
	<li>Coloque os ratos em uma estrutura estereotaxa e imobilize a cabeça usando barras de ouvido padrão (Figura 1A). Aplique pomada oftálmica aos olhos.</li>
	<li>Esterilize a superfície da cabeça por aplicação repetida e alternada (3x) de cotonetes de iodo e 70% de etanol antes da incisão.</li>
	<li>Use um bisturi cirúrgico para fazer uma incisão de 1 cm através da pele em um ângulo ligeiramente diagonal para a linha imaginária que divide o cérebro do camundongo em duas metades simétricas para expor o crânio. Limpe qualquer sangue com um cotonete.</li>
	<li>Desvie a pele lateralmente para expor o local da injeção: 2 mm à direita, 1 mm para frente com referência ao bregma (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/caudal (+1RC).</li>
	<li>Use um bit de broca (0,73 mm) para penetrar o crânio +2ML, +1RC para a bregma e fazer um orifício usando leve pressão e movimento de torção.</li>
	<li>Use uma seringa de injeção cerebral para injetar 5 μL de uma solução de 100.000 MDA-MB-231BR (expressando firmemente gfp-luciferase) em 1x PBS estéril inserindo inicialmente a seringa 3,5 mm de profundidade no cérebro.</li>
	<li>Deixe a seringa se contentar por 2 minutos. Puxe-o para cima cerca de 1 mm, e depois de 2 min, injete lentamente a primeira metade do volume.</li>
	<li>Espere mais 2 minutos antes de injetar o resto, e, em seguida, puxe lentamente a seringa 3 minutos após a injeção final. NOTA: A injeção lenta é empírica ao permitir que o volume seja bem absorvido pelo tecido cerebral e não crie vazamentos depois de puxar a seringa, o que pode levar as células cancerígenas a crescer fora do local pretendido.</li>
	<li>Aplique cera óssea no local da injeção no crânio e, em seguida, use suturas de polipropileno para suturar o tecido. Os camundongos se recuperarão dentro de 5 minutos após a remoção da anestesia.</li>
	<li>Monitore seu comportamento logo após a cirurgia por cerca de 10 minutos, 3 h depois e no dia seguinte para determinar se tratamento especial, incluindo injeção salina, alimentos macios, etc., são necessários para ajudar na recuperação rápida.</li>
	<li>Monitore o crescimento do tumor através de imagens de bioluminescência no sistema de imagem.<ol>
<li>Para isso, primeiro, ligue o oxigênio e o isoflurane no sistema de imagem. Deixe que ambos sejam distribuídos para a câmara separada fora da caixa de imagem.</li>
		<li>Em seguida, ligue o software, inicialize o instrumento e escolha a opção apropriada para visualizar e capturar todo o corpo do mouse.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque os ratos na câmara separada com isoflurane e garanta a profundidade ideal da anestesia com uma pitada de dedo do dedo do dedo. Injete os camundongos intraperitonealmente com 200 μL de luciferina de 30 mg/mL.</li>
	<li>Transfira o estômago dos ratos para o nariz da câmara de imagem abastecido com oxigênio e isoflurano. Bloqueie a câmara e escolha 2 minutos de exposição para iniciar a imagem.</li>
	<li>Use a ferramenta ROI (região de interesse) do software para quantificar o sinal bioluminescente do tumor.</li>
	<li>Para analisar o tamanho do tumor, escolha a ferramenta de forma do círculo, encaixe-a em torno da forma e tamanho do tumor. Meça o ROI e informe as leituras totais.</li>
	<li>Permitir o crescimento sólido do tumor por 12-14 dias (ou até que a luciferase atinja cerca de 7,0 x 106 unidades) (Figura 1B) antes de gerar fatias cerebrais. NOTA: O aumento do número de células a serem injetadas levará a um crescimento mais rápido do tumor; portanto, a geração de fatias cerebrais pode ocorrer antes de 12 dias. Por outro lado, um tumor maior levará a mais fatias de GFP+ se for permitido crescer por 14 dias. Após 14 dias, a saúde dos camundongos começa a se deteriorar rapidamente; portanto, o monitoramento da saúde animal deve ser aumentado para uma vez por dia após o ponto de tempo de 10 dias, e quaisquer camundongos que demonserem sinais de dor e/ou desconforto devem ser usados para gerar as fatias.</li>
</ol>2. Gerar fatias cerebrais
NOTA: Realize os passos após o isolamento cerebral em uma coifa de fluxo laminar estéril. Normalmente é possível gerar 35-40 fatias individuais contendo células tumorais (sinal de luciferase) de um rato injetado com células MDA-MB-231BR (Figura 1C).
<ol><li>Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas em uma autoclave. Coloque o cortador de tecido na capa de fluxo laminar estéril e limpe todas as ferramentas e instrumentos com 70% de etanol.</li>
	<li>Após 12-14 dias após a injeção intracraniana de células MDA-MB-231BR, anestesiar os camundongos de acordo com o protocolo de cuidados com animais dos usuários, conforme descrito em 1.2. Certifique-se de profundidade de anestesia ideal com uma pitada de dedo do dedo do sol.</li>
	<li>Remova e coloque seus cérebros rapidamente (dentro de 45 s) em sacarose gelada (4 °C) composta pela seguinte: sacarose de 280 mM, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM de glicose, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-ascorbate, 3 mM de tiorea, 2 mM Na+, 29 mM piruvato; pH=7,3.</li>
	<li>Usando um bisturi afiado, estéril ou lâmina de barbear, corte partes em excesso do cérebro que não contenham nenhum tumor de todos os lados, incluindo a parte inferior do cérebro.</li>
	<li>Leve a forma do cérebro para um cubo não perfeito para sentar-se no papel filtro molhado DA ACSF em uma tampa de prato de 60 mm para facilitar o corte. NOTA: Tecido extra do cérebro onde é improvável que o tumor tenha crescido é removido antes do corte para permitir a geração de fatias de GFP+ e criar uma forma do cérebro que é estável na superfície do instrumento e não será perturbado pelas vibrações causadas pelo corte.</li>
	<li>Coloque várias folhas de círculos de papel de filtro pré-molhado (com ACSF) sobre a plataforma de corte e coloque o tecido bloqueado em cima disso.</li>
	<li>Coloque o tamanho do corte no instrumento em 2 ou 2,5 unidades na régua fornecida para cortar o tecido em seções de 200-250 μm. NOTA: Fatias de até 350 μm ou tão finas quanto 100 μm são viáveis. Para fatias <200 μm, use vibratome ou compresstome.</li>
	<li>Use um pincel (sable) para transferir fatias cerebrais em um prato contendo sacarose ACSF e separe as fatias sob um microscópio leve usando agulhas de 27 G.</li>
	<li>Identifique as fatias positivas do GFP sob o microscópio fluorescente e transfira-as para um novo prato de 60 mm contendo 2-3 mL de mídia de fatia adulta (meio neurobásico A, 2% suplemento B12, 1% suplemento N2, 1% glutamina, 0,5% glicose, penicilina de 10 U/mL e 100 μg/mL streptomicina) usando uma pipeta quebrada de 1 mL estéril (abertura ampla). NOTA: As fatias cerebrais que contêm células tumorais crescendo sobre a superfície cerebral (talvez devido ao vazamento de células de injeção, etc.) são excluídas.</li>
	<li>Transfira 3-5 fatias para cada 30 mm, 0,4 μm de cultura de tecido de tamanho de poros inserindo em placas de 6 poços a uma distância que não permite crescer entre si.</li>
	<li>Remova o meio de excesso da superfície da inserção usando uma pipeta P1000, adicione 1 mL de meio de fatia de rato adulto por baixo de cada inserção e equilibre a mídia na incubadora antes do corte.</li>
	<li>Incubar os tecidos a 37 °C, 5% DE CO2 e 95% umidade por 24 h antes da imagem.</li>
</ol>3. IVIS imagem de fatias
NOTA: Realize passos de adição de luciferase e inibidor em uma coifa de fluxo laminar estéril.
<ol><li>Pipeta 5 μL de solução de luciferina de 30 mg/mL no meio abaixo das pastilhas, levantando a pastilha com fórceps e colocando-as de volta no poço após a adição de luciferina à mídia no poço.</li>
	<li>Coloque a placa de 6 poços com a tampa dentro da câmara de imagem do instrumento abaixo da câmera estacionária e tranque a porta da câmara.</li>
	<li>Abra o software e inicialize o instrumento.</li>
	<li>Escolha configurações de câmera que permitam visualização e captura de apenas um poço por imagem. Mova o palco para cima (FOV de 5 cm) e coloque o poço que deve ser imagedo diretamente sob a câmera.</li>
	<li>Defina o tempo de imagem para o mais adequado dependendo da intensidade da luciferase que o tumor emitirá, que pode variar de 10 s a 5 min. Comece com a configuração para 10 s e, em seguida, aumente se o sinal estiver baixo, mas mantenha-o consistente para todos os pontos e condições de tempo até o final do experimento (Figura 1D).</li>
	<li>Use a ferramenta ROI (ferramenta de forma de círculo), encaixe-a em torno da forma e tamanho do tumor, meça o ROI e informe as leituras totais para quantificar o sinal bioluminescente de cada tumor na fatia.</li>
	<li>Leve a placa de volta para o capô de fluxo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeiramente a pastilha do poço.</li>
	<li>Aspire o meio, substitua-o por 1 mL de meio fresco e coloque a inserção de volta no poço.</li>
	<li>Para experimentos onde as fatias estão sendo tratadas com vários compostos, como inibidores, metabólitos, etc., prepare a concentração apropriada do reagente em 1,2 mL de mídia de fatia cerebral em um tubo de 1,5 mL e, em seguida, transfira 1 mL para o poço que contém a fatia.</li>
	<li>Repita este processo a cada 48 horas durante a duração do estudo.</li>
</ol>4. Imagem ao vivo do crescimento do tumor em fatias cerebrais ex vivo
NOTA: O fornecimento é inserido com meio suficiente (1,5 mL) para durar o comprimento do experimento, pois não é possível adicionar meio adicional durante a imagem ao vivo.
<ol><li>Coloque a placa de 6 poços no suporte automático da placa de microscópio dentro da incubadora (37 °C, 5% DE CO2 e 95% de umidade).</li>
	<li>Abra o software, ligue o campo brilhante no primeiro quadrante para ajustar a exposição necessária para visualizar as fatias. Para encontrar a posição (coordenadas "xy") da fatia, navegue com "xy" no segundo quadrante para controlar as coordenadas "xyz" do microscópio.</li>
	<li>Selecione placa de 6 poços como o labware usado para este experimento. Selecione o editor do mapa do ROI e registre essa posição selecionando um novo ROI, adicione e salve esse ROI.</li>
	<li>Repita os mesmos passos para todas as outras regiões de interesse em outros poços. Depois de ter adicionado todos os ROIs, salve todos os ROIs.</li>
	<li>Em Protocolo, selecione Limpar o Tempo-Lapso de Tempo sob Aquisição, seguido de selecionar os canais de interesse (neste caso GFP).</li>
	<li>Desligue o foco automático na configuração do foco e ajuste manualmente ao foco apropriado para todas as fatias. Finalmente, ajuste a intensidade de campo brilhante e o tempo de excitação e exposição do canal fluorescente ao nível apropriado.</li>
	<li>Defina o protocolo para adquirir imagens a cada 15 minutos por 48 h.</li>
	<li>Salve e execute o protocolo. No final do experimento, o arquivo salvo conterá as imagens brightfield e GFP capturadas para cada ROI.</li>
	<li>Para combinar as imagens em um vídeo, renomeie todas as imagens de interesse com o mesmo nome seguidas de um número binário para organizá-las na ordem em que foram capturadas (por exemplo, ROI1 (1), RO1 (2) ...)</li>
	<li>Abra o ImageJ e importe as imagens clicando em Arquivo > Importar > Sequência de Imagem. Selecione os nomes dos arquivos que aparecem em uma lista e escreva o conteúdo do nome dos arquivos na caixa 'Fatos de nome do arquivo ' que aparecerá para identificar os arquivos selecionados para o vídeo.</li>
	<li>Salve as imagens combinadas em Arquivo > Salve como > AVI.</li>
</ol>5. Ensaio MTS e imunohistoquímica de tecido cerebral ex vivo
<ol><li>ENSAIO MTS<ol>
<li>Extite as fatias cortando a membrana de cultura tecidual por baixo de cada fatia ao longo das bordas do tecido e transfira o tecido, ainda preso à membrana, em uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Adicione o reagente MTS misturado em uma proporção de 1:5 com mídia de cultura e triton de 0,01% (1x) para permitir a penetração da solução no tecido, em um volume total de 120 μL em cada poço.</li>
		<li>Use 4% de paraformaldeído (PFA) como agente para tornar as fatias cerebrais inviáveis e, portanto, um controle positivo para este experimento. Mergulhe a fatia de interesse cerebral em 4% de PFA por 1 h em RT (temperatura ambiente) ou durante a noite a 4 °C antes de prosseguir com o ensaio MTS.</li>
		<li>Deixe o reagente MTS reagir sobre as fatias por 4h, retire as fatias dos poços e meça a absorvância em 490 nm para todas as condições, incluindo um poço vazio sem fatia como referência.</li>
		<li>Relatar as leituras em função da área de fatia de tecido, medida com uma régua de pinça digital.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação imunohistoquímica<ol>
<li>Mergulhe as fatias cerebrais presas à superfície de inserção da membrana em 10% de formalina durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Realizar incorporação, processamento, bloqueio e gerar lâminas não manchadas do tecido. Use o protocolo padrão de coloração imunohistoquímica para coloração para H&E, Ki-67, gama-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Irradiação de tumor em fatias cerebrais ex vivo
<ol><li>Irradie o tumor com 6 Giros (raios-x de 310 kVp). NOTA: As unidades inseridas para obter a dose total de 6 Gy são 3522 unidades após considerar unidades R (medidas com eletrometro Victoreen) e correções para o dedal, densidade do ar e cGy/R como descrito anteriormente18. O tempo de exposição é de 130,9.</li>
	<li>Use 0,25 mm +1 mm Al de filtragem adicionada, 50 cm de SSD, 125 cGy por min.</li>
	<li>Realize a dosimetria por uma câmara de ionização no feixe calibrada contra um padrão primário.</li>
	<li>Faça correções diariamente para umidade, temperatura e pressão barométrica.</li>
</ol>

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<li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastasis+cell+lines+panel%3A+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos financeiros para declarar.

Este estudo estabelece um novo método de cultura cerebral ex vivo para tumores cerebrais de xenoenxerto explantado. Mostramos que as células BCBM MDA-MB-231BR intracranianamente injetadas no cérebro de camundongos podem sobreviver e crescer em fatias cerebrais ex vivo . O estudo também testou células intracranianamente injetadas de glioblastoma U87MG (GBM) e também descobriu que essas células cancerígenas sobrevivem e crescem em fatias cerebrais (dados não mostrados). Acreditamos que esse modelo pode se...

As metástases cerebrais do câncer de mama (BCBM) se desenvolvem quando as células se espalham do tumor primário de mama para o cérebro. O câncer de mama é a segunda causa mais frequente de metástase cerebral após o câncer de pulmão, com metástases ocorrendo em 10-16% das pacientes1. Infelizmente, as metástases cerebrais permanecem incuráveis, pois >80% dos pacientes morrem dentro de um ano após o diagnóstico de metástase cerebral, e sua qualidade de vida é prejudicada devido a disfunções neurológicas2. É urgente identificar opções de tratamento mais eficazes. Modelos de cultura bidimensional ou tridimensional são os métodos mais utilizados para testar agentes terapêuticos em laboratório. No entanto, eles não imitam o complexo microambiente BCBM, um dos principais impulsionadores do fenótipo e crescimento tumoral. Embora esses modelos sejam úteis, eles não capturam as complexas interações tumorais-estromais, os requisitos metabólicos únicos e a heterogeneidade dos tumores3. Para recapitular mais fielmente as interações tumorais e a heterogeneidade do microambiente, nosso grupo e outros começaram a gerar culturas organotípicas de metástase cerebral "fatia" com células tumorais derivadas do paciente (primárias ou metastáticas) ou linhasde células cancerígenas 4,5,6. Comparado aos sistemas in vitro clássicos, este modelo ex vivo de curto prazo pode fornecer condições mais relevantes para a triagem de novas terapêuticas antes da avaliação pré-clínica em grandes coortes animais.
Modelos ex vivo foram construídos e utilizados com sucesso principalmente para a identificação de tratamentos bem-sucedidos de vários cânceres. Eles requerem poucos dias de avaliação e, além disso, podem ser adaptados para a triagem de medicamentos específico do paciente. Por exemplo, os tecidos ex vivo do câncer de bexiga e próstata têm mostrado uma resposta anti-tumor dependente de dose de docetaxel e gemcitabina7. Carcinoma colorretal ex vivo semelhantes foram desenvolvidos para tela quimioterapia oxaliplatina, Cetuximab e Pembrolizumab8. Esta aplicação tem sido amplamente utilizada no câncer de pâncreas, considerando a interação essencial entre o ambiente estromal e as características genotípicas e fenotípicas do adenocarcinoma ductal 9,10. Além disso, tais modelos organotípicos foram desenvolvidos para exames semelhantes em tumores de cabeça, pescoço, gástrico e mama11,12.
Aqui, um modelo de fatia cerebral ex vivo de células tumorais metastáticas do câncer de mama xenoenxerados em seu microambiente está sendo gerado. Camundongos foram intracranianamente injetados com câncer de mama cérebro tátático cérebro trófico células MDA-MB-231BR13 no lobo parietal córtex cerebral- um local comum de metástase TNBC 14,15 e permitido desenvolver tumores. Fatias cerebrais foram geradas a partir desses animais xenoengrafados e mantidas ex vivo como culturas organotípicas como descrito16,17. Este novo modelo ex vivo permite a análise do crescimento da célula BCBM dentro do parenchyma cerebral e pode ser usado para testar agentes terapêuticos e efeitos de radiação em células tumorais dentro do microambiente cerebral.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL, ponta deslizante</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 Agulhas G1/2 BD</td><td></td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 poços</td><td>Genessee</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio automatizado e software LUMAVIEW</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>B27 (GEM21)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>Béquer 50 mL</td><td>Fisher</td><td>10-210-685</td><td></td></tr><tr><td>Pincel de zibelina sem corte, Tamanho #5/0</td><td>Cera Óssea Médica Sciences</td><td>66100-50</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de Injeção</td><td></td> Cerebral DYNJBW25 <td></td> ModoMed Hamilton Company 80430 <td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-250</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Cleaved caspase 3 Antibody Cell Signaling 14220S <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina Sal de Potássio</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de dupla borda</td><td>VWR</td><td>55411-060(95-0043)</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro , círculos quantitativos, 4,25 cm</td><td>Fisher</td><td>09-805a (1001-042)</td><td></td></tr><tr><td>Pincel de zibelina fina #2/0</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>66100-20</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Gamma-H2AX anticorpo</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>GFAP anticorpo</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-0300</td><td></td></tr><tr><td>GFP anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9996</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina (200 mM)</td> <td>Corning cellgrow</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>H& E e KI-67</td><td>Jefferson Core Facility Patologia coloração Conjunto de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>brocas manuais com micro mini brocas helicoidais</td><td>Amazon</td><td>YCQ2851920086082DJ</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, ácido livre</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-1</td><td></td></tr><tr><td>Apenas para camundongos Quadro estereotáxico</td><td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, EUA).</td><td>72-6049, 72-6044</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica grande</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>Células MDA-MB-231BR</td><td>Gentilmente cedido pela Dra. Patricia Steeg</td><td>Ref 14</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de imagem de camundongos</td><td>Perkin Elmer</td><td>Sistema</td><td></td>IVIS 200</tr><tr><td>Software de imagem de camundongos</td><td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, EUA).</td><td>Leitor de microplacas de</td><td></td>software de imagem viva</tr><tr><td></td> Solução de montagem <td>de faísca</td><td></td><td></td>de teca</tr><tr><td></td><td>Reagente Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>MTS</td><td>Promega CellTiter 96 Solução aquosa única</td> <td>(Cat: G3582)</td><td></td></tr> <tr><td>Suplemento N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos atímicos Nu / Nu</td><td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, EUA)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Paraformaldeído</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>Caneta / Strep</td><td>Life Technologies</td><td>145140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de polipropileno</td><td>Medex fornecer</td><td>ETH-8556H</td><td></td></tr><tr><td>Bastões de cotonete de iodopovidona</td><td>DME Fornecimento EUA</td><td>Cat: 689286X</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi #11 (pk de 100)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Espátula/sonda</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-13</td><td></td></tr><tr><td>SS Lâminas de barbear de dupla borda não revestidas (American safety razor co (95-0043))VWR</td><td></td> <td>55411-060</td><td></td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Amresco</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Cirúrgico</td><td>Exelint International</td><td>D29702</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Chopper</td><td>Brinkman</td><td>(Tipo McIlwain)</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de cultura de tecidos</td> Máquina de raios-X <td>Millipore</td><td>PICMORG50 ou PICM03050</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Precisão 250 kVp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

A metástase cerebral é uma consequência séria do câncer de mama para as mulheres, pois esses tumores são difíceis de tratar e estão associados a desfechos clínicos ruins. Modelos pré-clínicos de camundongos do câncer de mama câncer de mama o crescimento metastático cerebral (BCBM) são úteis, mas são caros, e é difícil rastrear células vivas e invasão de células tumorais dentro do parnchyma cerebral. Apresentado aqui é um protocolo para culturas de fatias cerebrais ex vivo de camundongos xenoenxerados contendo sublines clonais intracranianas injetadas no cérebro do câncer de mama. Células etiquetadas de luciferase MDA-MB-231BR foram injetadas intracranianamente no cérebro de camundongos fêmeas Nu/Nu, e após a formação de tumores, os cérebros foram isolados, fatiados e cultivados ex vivo. As fatias tumorais foram imagens para identificar células tumorais expressando luciferase e monitorar sua proliferação e invasão no parênquim cerebral por até 10 dias. Além disso, o protocolo descreve o uso de microscopia de lapso de tempo para visualizar o crescimento e o comportamento invasivo das células tumorais após o tratamento com radiação ionizante ou quimioterapia. A resposta das células tumorais aos tratamentos pode ser visualizada por microscopia de imagem viva, medindo a intensidade da bioluminescência e realizando histologia na fatia cerebral contendo células BCBM. Assim, este modelo de fatia ex vivo pode ser uma plataforma útil para testes rápidos de novos agentes terapêuticos sozinhos ou em combinação com radiação para identificar drogas personalizadas para direcionar o crescimento metastático do cérebro do câncer de mama de uma paciente individual dentro do microambiente cerebral.

As células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase foram intracranianamente injetadas no hemisfério direito de camundongos Nu/Nu de 4-6 semanas de idade, conforme explicado acima (Figura 1A) e foram autorizadas a crescer por 12-14 dias, período durante o qual o crescimento do tumor foi monitorado por imagens de bioluminescência (Figura 1B). Injetamos 100.000 células cancerígenas intracranianamente como relatado por outros grupos19, mas é possível inj...

Introduzimos um protocolo para medir a resposta de drogas e radiação em tempo real de células metastáticas cerebrais do câncer de mama em um modelo organotípico de fatia cerebral. Os métodos fornecem um ensaio quantitativo para investigar os efeitos terapêuticos de vários tratamentos em metástases cerebrais do câncer de mama de forma ex vivo dentro da interface de microambiente cerebral.

Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Este protocolo permite a formação de células tumorais metastáticas cerebrais e a geração de fatias cerebrais ex vivo que permitem testes rápidos de eficácia e radiação de drogas em um tumor pré-formado. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de testar rapidamente vários medicamentos ou tratamentos em um ambiente fisiologicamente relevante que mantém interações cérebro-tumor-hospedeiro. Este método pode ajudar a entender como as células metastáticas cerebrais crescem, sobrevivem e invadem o parênquim cerebral e entendem o papel do microambiente tumoral cerebral no crescimento e disseminação do câncer.Demonstrando o procedimento estarão Lorela Ciraku e Emily Esquea, ambas candidatas ao doutorado do meu laboratório. Para começar, coloque os ratos anestesiados em uma estrutura estereotaxica e imobilize a cabeça usando barras de ouvido padrão. Esterilize a superfície da cabeça três vezes por repetida aplicação alternada de cotonetes de iodo e 70% de etanol antes da incisão.Usando um bisturi cirúrgico, faça uma incisão de uma centimétrica de linha média em um ângulo diagonal para o eixo imaginário dividindo o cérebro do camundongo em duas metades simétricas para expor o crânio. Depois de limpar qualquer sangue com um cotonete, desvie a pele lateralmente para expor o local da injeção. Use uma broca de 0,73 milímetros para penetrar no crânio e fazer um furo usando leve pressão e movimento de torção.Para injetar cinco microliters de células expressando a luciferase GFP, insira uma seringa de alta precisão a 3,5 milímetros de profundidade no cérebro. Deixe-o se acomodar por dois minutos e, em seguida, puxe a seringa para cima cerca de um milímetro. Após dois minutos, injete lentamente o primeiro volume e espere por mais dois minutos antes de injetar o resto do volume.Depois de três minutos, puxe lentamente a seringa. Aplique cera óssea no local da injeção no crânio e sutura o tecido com suturas de polipropileno. Monitore o comportamento do camundongo logo após a cirurgia periodicamente para determinar se o tratamento especial, incluindo injeção salina e alimentos macios, são necessários para ajudar na recuperação rápida.Para monitorar o crescimento do tumor através de imagens de bioluminescência, primeiro ligue o oxigênio e o isoflurane no sistema de imagem e permita que ambos sejam distribuídos para a câmara separada fora da caixa de imagem. Em seguida, depois de ligar o software e inicializar o instrumento, escolha a opção apropriada para visualizar e capturar todo o corpo do mouse. Em seguida, transfira os ratos para a câmara fora da caixa de imagens fornecida com oxigênio e isoflurano.Uma vez que os camundongos estejam sob o efeito anestésico, injete os ratos intraperitonealmente com 200 microlitros de 30 miligramas por mililitro de luciferina. Coloque os ratos na câmara de imagem com o estômago voltado para o lábio do nariz das câmaras de imagem. Bloqueie a câmara, escolha dois minutos de exposição para iniciar a imagem e, em seguida, complete a imagem.Depois de colocar o cortador de tecido em uma capa de fluxo laminar estéril, limpe todas as ferramentas e instrumentos com 70% de etanol. Depois de eutanásia do camundongo, remova e coloque o cérebro rapidamente na solução de sacarose-ACSF gelada. Usando uma espátula, transfira o cérebro em um papel filtro molhado pela ACSF em uma tampa de prato de 60 milímetros.Usando uma lâmina afiada e estéril, corte o excesso de partes do cérebro que não contenham nenhum tumor, incluindo a parte inferior do cérebro, para trazer a forma do cérebro para um cubo não perfeito. Depois de colocar várias folhas de papel filtro molhado pela ACSF na plataforma de corte, coloque o tecido bloqueado sobre o papel do filtro. Para cortar o tecido em seções de 200 a 250 micrômetros de espessura, ajuste o tamanho do corte para 2 ou 2,5 unidades na régua do provedor e comece a cortar.Use um pincel para transferir fatias cerebrais em um prato contendo sacarose-ACSF e separe as fatias sob um microscópio leve usando agulhas de calibre 27. Identifique as fatias positivas do GFP sob o microscópio fluorescente. Em seguida, usando uma pipeta quebrada de um mililitro estéril com uma abertura ampla, transfira fatias identificadas para um novo prato de 60 milímetros contendo dois a três mililitros de mídia de fatia adulta.Em seguida, transfira de três a cinco fatias para cada inserção de cultura de tecido em cada poço de uma placa de seis poços a uma distância segura. Depois de remover o meio de excesso da superfície da pastilha, adicione um mililitro de meio de fatia de rato adulto equilibrado por baixo de cada inserção. Incubar os tecidos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por 24 horas antes da imagem.Pipeta cinco microlitres de 30 miligramas por solução de luciferina mililitro no meio sob as pastilhas dentro de um capô estéril. Coloque a placa de seis poços com a tampa dentro da câmara de imagem do instrumento abaixo da câmera estacionária e tranque a porta da câmara. Abra o software e inicialize o instrumento.Depois de escolher as configurações da câmera permitindo visualização e captura de apenas um poço por imagem, coloque o poço para ser filmado diretamente sob a câmera. Use a ferramenta ROI, encaixe-a em torno da forma e tamanho do tumor, meça o ROI e informe as leituras totais para quantificar o sinal bioluminescente de cada tumor na fatia. Depois de trazer a placa de volta para o capô de fluxo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeiramente a pastilha do poço.Depois de aspirar o meio, substitua o meio por um mililitro de meio fresco e coloque o inset de volta no poço. Para os experimentos onde as fatias são tratadas com vários compostos, como inibidores e metabólitos, prepare a concentração de reagente apropriada em 1,2 mililitros de mídia de fatia cerebral em um tubo de 1,5 mililitro, e, em seguida, transfira um mililitro de reagente para o poço que contém a fatia. As células luciferase MDA-MB-231 BR-GFP foram injetadas em camundongos nus, tumores foram autorizados a crescer, cérebros com tumores foram dissecados, fatiados, ex vivo crescidos e o crescimento do tumor foi monitorado por imagens de bioluminescência.A coloração de H&E e a fluorescência GFP-positiva confirmaram a presença de um tumor na fatia cerebral. O aumento da coloração ki-67 confirmou a presença de células cancerígenas altamente proliferativas. Os tumores em fatias cerebrais que não foram expostos à irradiação continuaram a crescer ex vivo, enquanto tumores expostos à irradiação mostraram um crescimento paralisado.As fatias cerebrais contendo tumores também foram monitoradas através de imagens ao vivo para visualizar o crescimento do tumor após o tratamento de irradiação. Consistente com a imagem bioluminescente, o controle das células cancerígenas cresceu rapidamente à medida que a intensidade do GFP aumentava e as células começaram a invadir o parênquim cerebral. Em contraste, as células cancerígenas em fatias cerebrais tratadas com irradiação eram citostáticas e a intensidade do GFP foi mantida.Grandes células cancerígenas multinucleadas e um aumento na coloração do marcador de dano de DNA em células cancerígenas tratadas pelo IR foram detectadas. Além disso, foi detectado um aumento nos astrócitos reativos. A apoptose induzida pelo tratamento de RI não foi detectada nas fatias cerebrais do camundongo sem tumor.As fatias cerebrais contendo tumores foram tratadas com diferentes concentrações de paclitaxel, uma droga quimioterápica. O tratamento diminuiu significativamente o tamanho do tumor após o 10º dia de tratamento. Foi detectado um aumento da apoptose nas células tumorais tratadas com paclitaxel.O tratamento inibidor não alterou a viabilidade do tecido cerebral. Nenhum aumento na apoptose foi medido pela coloração de caspase-3 em fatia cerebral de camundongo livre de tumores tratada com paclitaxel. Quando o tratamento com os medicamentos de interesse terminou, as fatias podem ser analisadas para expressão proteica através de imunocytoquímica, estudos omicos ou alcançar suspensão unicelular adequada para citometria de fluxo.

an-ex-vivo-brain-slice-model-to-study-target-breast-cancer-brain

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Fonte: Ciraku, L., et. al. Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático cerebral do câncer de mama. J. Vis. Exp. (2021). Este vídeo demonstra a imagem de células tumorais que expressam luciferase em uma fatia de cérebro de camundongo organotípica. A luciferina é adicionada ao meio e a placa é colocada dentro da câmara do sistema de imagem in vivo. Os parâmetros para captura de imagem são ajustados e a forma e o tamanho do tumor são definidos.

Imagem de bioluminescência para avaliar o crescimento do tumor em uma fatia de cérebro de camundongo organotípica

Um modelo do rato de mama câncer no cérebro metástase é estabelecida com ultra-som guiada por imagem injeção intracardíaca de células MDA-MB231/Br-GFP. Desenvolvimento de metástases intracranianas multifocais tem sido monitorada longitudinalmente usando alta resolução de 9.4 T MRI.

Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

Muitos tipos de tumores cerebrais humanos estão localizados em regiões específicas do cérebro e são difíceis de cultivar em cultura. Este protocolo aborda o papel do microambiente tumoral e investiga novos tratamentos medicamentosos analisando células tumorais cerebrais primárias fluorescentes que crescem em uma fatia de cérebro de camundongo organotípica.

Um tumor cerebral / Slice organotípicas Co-cultura Sistema de Estudos de Tumor Microenvironment e alvejado droga Terapias

Metástases cerebrais tornou-se uma necessidade médica não atendida urgente como a sua incidência tem aumentado enquanto as opções terapêuticas têm permanecido paliativos. Criando modelos animais experimentais de metástase cerebral através de injecção arterial intracarotídeo de células cancerosas facilita estudos sobre os mecanismos da biologia da doença e avaliação de novos regimes de intervenção.

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

A modelagem da metástase cerebral intracraniana é complicada pela incapacidade de monitorar o tamanho do tumor e a resposta ao tratamento com métodos precisos e oportunos. A metodologia apresentada casais injeção de tumor intracraniano com análise de ressonância magnética, que, quando combinada, cultiva injeções precisas e consistentes, monitoramento animal aprimorado e medições precisas de volume de tumor.

Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e esculpir uma barreira cerebral sanguínea microambienta tumoral metastático e, em seguida, quantificar seu estado usando imagens confocal e inteligência artificial (machine learning).

Quantificando o microambique do tumor metastático cerebral usando um modelo 3D de chip de órgão, aprendizado de máquina e tomografia confocal

Descrevemos um modelo de metástase cerebral de câncer de mama em camundongos xenoenxerto gerada por injeção na veia caudal de uma linhagem de células inflamatórias de câncer de mama amplificadas endogenamente por HER2.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Embriões de pintinhos são usados para estudar tumores cerebrais de glioblastoma humano (GBM) em co-culturas de ovo e de fatias cerebrais ex vivo . O comportamento das células GBM pode ser registrado por microscopia de lapso de tempo em co-culturas ex vivo , e ambas as preparações podem ser analisadas no desfecho experimental por análise confocal 3D detalhada.

Uso do Cérebro de Embriões de Pintinhos como Modelo para Análises In Vivo e Ex Vivo do Comportamento Celular de Glioblastoma Humano

A técnica de injeção intracraniana estereotáxica permite a implantação precisa e localizada de células tumorais no córtex do camundongo, tornando-se um modelo poderoso para estudar a colonização metastática do cérebro.

Modelagem da Metástase Cerebral: Análise Padronizada da Colonização Metastática e Padrões de Crescimento Histológico por Injeção Intracortical Estereotáxica

Aprenda a criar um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar metástases de câncer de mama. Este método permite testar rapidamente drogas e radiação em um ambiente fisiologicamente relevante, mantendo as interações tumor-cérebro-hospedeiro.

Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

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