Name: O uso da técnica de grampo de remendo para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprenda a técnica de grampo de remendo para medir vazamento de prótons na membrana mitocondrial interna. Este método permite caracterizar mecanismos moleculares da termogênese mitocondrial em tecidos como coração e gordura marrom.

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Yuriy Kirichok pela grande ciência da qual fiz parte do laboratório dele e dos membros do laboratório Kirichok pelas discussões úteis. Também agradeço ao Dr. Douglas C. Wallace por fornecer ratos aac1 . Financiamento: A.M.B foi apoiado por um American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.

Todos os procedimentos experimentais animais que foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em Los Angeles (IACUC).
NOTA: O procedimento de isolamento mitocondrial é baseado na centrifugação diferencial e varia ligeiramente de tecido para tecido. Por exemplo, uma vez que o tecido adiposo marrom é extremamente rico em lipídios, requer um passo adicional para separar detritos celulares e organelas da fase lipídica antes de colher as mitocôndrias. Para evitar confusão, os dois procedimentos de isolamento mitocondrial (um da gordura marrom e outro do coração) são detalhados abaixo.
1. Isolamento mitocondrial da gordura marrom interscapular do rato (modificado a partir de Bertholet et al. 2020)15
<ol><li>Euthanize C57BL/6 camundongo macho usando asfixia de CO2 e posterior luxação cervical, conforme recomendado pelo American Veterinary Medical Association Panel e pelo Comitê IACUC.</li>
	<li>Depois de posicionar o rato com a barriga de frente para a mesa, pulverize o álcool para limpar e molhar o cabelo (modificado de Mann et al., 2014)16.</li>
	<li>Faça uma incisão de 2 cm na parte superior das costas depois de agarrar a pele com pinças.</li>
	<li>Extrair a gordura interscapular marrom do rato que corresponde a um órgão de dois lobed com uma forma de borboleta16.</li>
	<li>Transfira a gordura marrom para uma placa de Petri de 35 mm cheia de 5 mL de tampão de isolamento frio (Tabela 1) previamente colocada no gelo.</li>
	<li>Limpe a gordura marrom da gordura branca sob um binóculo.</li>
	<li>Transfira a gordura marrom para um béquer de 10 mL com 5 mL de tampão de isolamento frio (Tabela 1) para cortá-la em pedaços finos. Transfira para o homogeneizador de vidro de 10 mL refrigerado ao gelo (material plástico politetrafluororetileno (PTFE).</li>
	<li>Use um agitador aéreo para homogeneizar o tecido pré-cortado no gelo com seis golpes suaves a uma velocidade controlada de 275 rotações/min.</li>
	<li>Centrifugar o homogeneizar a 8.500 x g por 10 min a 4 °C em um tubo cônico gelado de 15 mL. Descarte o supernatante contendo a fase lipídica.</li>
	<li>Resuspenda a pelota em 5 mL de tampão de isolamento gelado (Tabela 1) e homogeneize, uma segunda vez, a suspensão no gelo com seis golpes lentos a uma velocidade de 275 rotação/min.</li>
	<li>Transfira o homogene de homogeneização em um tubo cônico gelado de 15 mL e centrifuse-o a 700 x g por 10 min a 4 °C para pelotar todos os núcleos e células ininterruptas.</li>
	<li>Colete o supernatante em um tubo fresco de 15 mL e coloque-o no gelo.</li>
	<li>Centrifugar o supernante a 8.500 x g por 10 min a 4 °C para obter uma pelota contendo mitocôndrias.</li>
	<li>Pelota resuspend contendo mitocôndrias em 3,8 mL de tampão hipertônico-mannitol frio (Tabela 2) e incubar a suspensão mitocondrial no gelo por 10-15 min.</li>
</ol>2. Isolamento mitocondrial do coração do rato (modificado a partir de Garg et al. 2019)17
<ol><li>Euthanize C57BL/6 camundongo macho usando asfixia de CO2 e posterior luxação cervical, conforme recomendado pelo American Veterinary Medical Association Panel e pelo Comitê IACUC.</li>
	<li>Depois de posicionar o rato nas costas, pulverize o álcool para limpar e molhar o cabelo. Em seguida, faça uma incisão de 2 cm no tórax depois de agarrar a pele com pinças.</li>
	<li>Disseque o coração do peito do animal e enxágue-o para remover todo o sangue em um béquer de 10 mL com 5 mL da solução de isolamento frio (Tabela 1).</li>
	<li>Uma vez que o coração tenha sido limpo de vestígios de sangue, transfira-o para outro béquer de 10 mL contendo 5 mL de tampão de isolamento frio (Tabela 1) para cortá-lo em pedaços finos. Em seguida, transfira para um homogeneizador de vidro de 10 mL refrigerado ao gelo (pilão PTFE).</li>
	<li>Use um agitador aéreo para homogeneizar o tecido pré-cortado no gelo com seis golpes suaves a uma velocidade controlada de 275 rotações/min.</li>
	<li>Transfira o homogene de homogeneização para um tubo cônico gelado de 15 mL e centrifuá-lo a 700 x g por 10 min a 4 °C para pelotas de núcleos e células ininterruptas.</li>
	<li>Colete o supernatante em um tubo fresco de 15 mL e coloque-o no gelo.</li>
	<li>Centrifugar o supernante a 8.500 x g por 10 min a 4 °C para obter uma pelota contendo mitocôndrias.</li>
	<li>Resuspend a pelota mitocondrial em 3,8 mL de tampão hipertônico-mannitol frio (Tabela 2) e incubar a suspensão mitocondrial no gelo por 10-15 min.</li>
</ol>3. Preparação de mitoplastos com uma Prensa Francesa para ruptura mecânica do OMM.
NOTA: O procedimento de imprensa francês permite que o IMM seja liberado do OMM com sua integridade preservada, incluindo a matriz e a crista (Figura 2)18. Mitocôndrias são pré-incubadas em um tampão hipertônico-mannitol (Tabela 2) e submetidas a uma pressão menor durante o procedimento de imprensa francês para evitar qualquer alongamento drástico do IMM quando o OMM é rompido.
<ol><li>Encha a suspensão mitocondrial-hipertônico-mannitol em uma mini célula de pressão refrigerada (diâmetro do pistão 3/8") da prensa francesa (Figura 3A).</li>
	<li>Selecione o modo médio da Imprensa Francesa e comprima a suspensão através da mini célula de pressão a 110 no mostrador da Imprensa Francesa para as mitocôndrias de gordura marrom e a 140 para as mitocôndrias cardíacas (~2.000 psi).  Certifique-se de que a suspensão saia da mini célula de pressão a uma taxa de cerca de 1 drop/s.</li>
	<li>Colete as gotas em um tubo cônico refrigerado a gelo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão a 10.500 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspenda a pelota de mitoplastos em 0,5-2 mL de tampão hipertônico-kcl frio (Tabela 3) e armazene a suspensão no gelo. NOTA: Gordura marrom e mitoplastos cardíacos estão prontos para gravações de grampos de remendo e devem permanecer utilizáveis por cerca de 3-6 h.</li>
</ol>4. Gravações eletrofisiológicas de H+ vazam através de UCP1 e AAC 5,7,15
NOTA: Utilize a seguinte configuração eletrofisiológica (Figura 3B): microscópio invertido com contraste de interferência diferencial (DIC), objetivo de imersão de água de 60x, mesa de isolamento de vibração e uma gaiola Faraday, um amplificador padrão que suporta gravações de baixo ruído, um digitalizador padrão usado para configuração eletrofisiológica, pClamp 10, um micromanipulador, eletrodo de referência de banho (ponte de sal de 3 M KCl-gar inserida dentro de um suporte de microeletríno contendo uma pelota de cloreto de prata/prata moldada no corpo do titular (descrito em Liu et al. 2021)19, câmara de perfusão com fundo de deslizamento de vidro de 0,13 mm, conectado a um sistema de perfusão alimentado pela gravidade.
<ol><li>Puxe os filamentos de vidro borossilicato no dia da gravação usando um puxador de micropipette. Coloque um programa no puxador usado para gerar pipetas com alto grau de reprodutibilidade20. NOTA: Este projeto do programa requer várias tentativas de obter pipetas otimizadas para o grampo de remendo IMM. Uma pipeta padrão tem pontas finas com uma forma cônica progressiva.</li>
	<li>Insira um filamento de vidro dentro do puxador e puxe para obter quase duas pipetas de remendo idênticas de um filamento borossilicato.</li>
	<li>Ajuste o programa quando as pipetas se tornarem inconsistentes entre os ciclos de puxar devido ao envelhecimento do filamento da caixa de aquecimento do puxador.</li>
	<li>Posicione a pipeta dentro do polidor de pipeta e coloque a ponta perto do filamento sob a ampliação de 100x para poli-la.</li>
	<li>Pressione o pedal do pé várias vezes para aquecer o filamento sem entupir ou danificar a curva da ponta.</li>
	<li>Polonês até que as pipetas com resistência entre 25 e 35 MΩ sejam obtidas quando preenchidas com solução de pipeta baseada em TMA (TMA para hidróxido de tetrametilamônio, Tabela 4).</li>
	<li>Tampas pré-incubadas (5 mm de diâmetro, 0,1 mm de espessura) com gelatina de 0,1% para reduzir a adesão mitoplasta e enxágüe-as com a solução de banho KCl (Tabela 5) antes de depositar a suspensão mitoplastia.</li>
	<li>Prepare uma diluição crua misturando ~35 μL da suspensão mitoplastia concentrada com 500 μL da solução de banho KCl (Tabela 5) e coloque-a em tampas previamente colocadas em um poço de uma placa de 4 poços.</li>
	<li>Incubar no gelo por 15 a 20 minutos para mitoplastos para sedimentos na mancha de cobertura.</li>
	<li>Encha completamente a câmara de banho com ~50 μL da solução de banho KCl (Tabela 5).</li>
	<li>Transfira um deslizamento com mitoplastos dentro da câmara usando pinças finas de microdisseção com uma ponta dobrada.</li>
	<li>Organize a tampa na parte inferior da câmara. Não perfunda a câmara para manter os mitoplastos estáveis na tampa.</li>
	<li>Escolha um mitoplasto não adesivo individual na forma de 8, escaneando o deslizamento sob o microscópio com um objetivo de 60x.</li>
	<li>Carregue a pipeta com a solução de pipeta (~50 μL) e coloque-a no porta-pipetas.</li>
	<li>Traga a pipeta para a solução de banho com um micromanipulador e aproxime-a logo acima do mitoplasto selecionado para chegar perto do IMM. O programa do amplificador dá a resistência da pipeta uma vez que está na solução de banho. Segure o potencial da membrana a 0 mV e aplique pulsos de 10 mV usando o comando de teste de membrana no programa do amplificador.</li>
	<li>Aplique uma leve pressão negativa para criar rapidamente um gigaseal com o IMM (Figura 2B).</li>
	<li>Levante a pipeta com o mitoplasto ligado para mantê-los longe da tampa para evitar a quebra da vedação devido à deriva da pipeta durante o experimento.</li>
	<li>Compense os transitórios de capacitância perdida com o comando "teste de membrana" no programa do amplificador antes de testar toda a configuração mitoplastia para obter uma medição correta de capacitância (Cm) para a membrana mitoplasta após a invasão.</li>
	<li>Aplique pulsos de tensão de curta duração (5-15 ms) (250-600 mV) com o programa do amplificador para romper o patch de membrana sob a pipeta de vidro e alcançar a configuração de mitoplasto inteiro (Figura 2C). A invasão bem sucedida é refletida pelo reaparecimento dos transitórios de capacitância.</li>
	<li>Após a invasão, encaixe os transitórios de capacitância com a opção de teste de membrana do programa do amplificador para avaliar a capacitância da membrana (refletindo o tamanho do mitoplasto) e sua resistência de acesso Ra (refletindo a qualidade da configuração de mitoplasto total). Após a invasão, Ra deve estar entre 40 e 80 MΩ. Mitoplastos (2-6 μm de tamanho) usados para experimentos com grampos de remendo normalmente têm capacitâncias de membrana de 0,5-1,1 pF.</li>
	<li>Imediatamente após o arrombamento, substitua a solução de banho KCl (Tabela 5) pela solução de banho HEPES (Tabela 6) iniciando a perfusão.</li>
	<li>Aplique um protocolo de rampa de 850 ms projetado com o programa do amplificador, de -160 mV a +100 mV com intervalo de 5 s, mantendo o mitoplast a 0 mV. Este protocolo funciona para os estudos UCP1 6,7,15 e AAC5 (Figura 4 e Figura 5). NOTA: Recomenda-se que as medições de corrente H+ dependentes de UCP1 e AAC adquiram todos os dados eletrofisiológicos a 10 kHz e filtram a 1 kHz usando software adequado que conduz o amplificador e o digitalizador.</li>
</ol>

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</ol>

O autor declara não interesses concorrentes.

Este artigo de método visa apresentar a técnica de grampo de remendo recentemente aplicada às mitocôndrias, uma nova abordagem para estudar diretamente o vazamento de H+ através do IMM responsável pela termogênese mitocondrial 5,6,7,15. Esta técnica não se limita aos tecidos e também pode ser usada para analisar vazamento de H+ e outras conduções do IMM em diferentes model...

Mitocôndrias são famosas por serem a potência da célula. Na verdade, eles são a principal fonte de energia química, ATP. O que é menos conhecido é que mitocôndrias também geram calor. De fato, cada mitocôndria constantemente gera os dois tipos de energias (ATP e calor) e um equilíbrio fino entre as duas formas de energia define homeostase de células metabólicas (Figura 1). Como as mitocôndrias distribuem energia entre ATP e calor é certamente a questão mais fundamental no campo da bioenergetics, embora ainda seja amplamente desconhecida. Sabemos que o aumento da produção de calor mitocondrial (chamada termogênese mitocondrial), e consequentemente reduzir a produção de ATP aumenta o gasto energético e esta é uma das melhores formas de combater a síndrome metabólica1.
A termogênese mitocondrial origina-se do vazamento de H+ através da membrana mitocondrial interna (IMM), levando ao desacoplamento da oxidação do substrato e da síntese de ATP com consequente produção de calor, daí o nome "desacoplamento mitocondrial"1 (Figura 1). Este vazamento H+ depende de transportadores mitocondriais chamados proteínas de desacoplamento (UCPs). A UCP1 foi a primeira UCP identificada. É expressa apenas em tecidos termogênicos, gordura marrom e gordura bege em que mitocôndrias são especializadas para produção de calor 2,3,4. A identidade da UCP em tecidos não adiposos, como músculo esquelético, coração e fígado, tem permanecido controversa. Mitocôndrias nesses tecidos podem ter cerca de 25% da energia mitocondrial total convertida em calor, o que pode impactar significativamente a fisiologia de todo o corpo1. Além de manter a temperatura corporal do núcleo, a termogênese mitocondrial também previne a obesidade induzida pela dieta, reduzindo as calorias. Além disso, reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por mitocôndrias para proteger as células de danos oxidativos1. Assim, a termogênese mitocondrial está envolvida no envelhecimento normal, distúrbios degenerativos relacionados à idade e outras condições que envolvem estresse oxidativo, como isquemia-reperfusão. Portanto, a termogênese mitocondrial é um poderoso regulador do metabolismo celular, e uma compreensão mecanicista desse processo fundamental promoverá o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial.
A respiração mitocondrial foi a primeira técnica a revelar o papel crucial da termogênese mitocondrial no metabolismo celular e ainda é a mais popular na comunidade1. Esta técnica é baseada na medição do consumo de oxigênio pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) que aumenta quando o vazamento mitocondrial H+ é ativado. Esta técnica, embora instrumental, não pode estudar diretamente o vazamento mitocondrial H+ através do IMM1, dificultando assim a identificação e caracterização precisas das proteínas responsáveis por isso, particularmente em tecidos não adiposos em que a produção de calor é secundária em comparação com a produção de ATP. Recentemente, o desenvolvimento da técnica de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias, forneceu o primeiro estudo direto do vazamento de H+ em todo o IMM em vários tecidos 5,6,7.
O grampo mitocondrial de toda a IMM foi estabelecido pela primeira vez de forma reprodutível por Kirichok et al.8. Eles descreveram a primeira medição direta das correntes mitocondriais de cálcio (MCU) em 2004 usando mitoplastos das linhas celulares COS-78. Mais tarde, o laboratório de Kirichok mostrou correntes de cálcio de IMMs de tecidos de camundongo9 e Drosophila 9. Outros laboratórios agora usam essa técnica rotineiramente para estudar as propriedades biofísicas da MCU 10,11,12,13,14. A análise completa do grampo de remendo do IMM da condutância de potássio e cloreto também é possível e foi mencionada em vários artigos, mas ainda não foi o tema principal de uma publicação 6,7,9. A primeira medição das correntes H+ em todo o IMM foi relatada em 2012 a partir de mitocôndrias de gorduramarrom-rato 6, e de mitocôndrias de gordura bege do rato em 20177. Esta corrente é devido à proteína de desacoplamento específica dos tecidos termogênicos, UCP1 6,7. Trabalho recente publicado em 2019 caracterizou a AAC como a principal proteína responsável pelo vazamento mitocondrial H+ em tecidos não adiposos, como o coração e o músculo esquelético5.
Esta abordagem única agora permite a análise funcional direta de alta resolução dos canais mitocondriais e transportadores responsáveis pela termogênese mitocondrial. Para facilitar a expansão do método e complementar outros estudos como a respiração mitocondrial, um protocolo detalhado é descrito abaixo para medir as correntes H+ transportadas pela UCP1 e AAC. Três passos importantes são descritos: 1) isolamento mitocondrial da gordura marrom do rato para analisar a corrente H+ dependente de UCP1 e o isolamento mitocondrial do coração para analisar a corrente H+ dependente de AAC, 2) preparação de mitoplastos com uma prensa francesa para ruptura mecânica da membrana mitocondrial externa (OMM), 3) gravações de grampos de remendo de UCP1 e correntes H+ dependentes de AAC em todo o IMM.

<table><tbody><tr><td>0,1% gelatina</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>60X objetiva de imersão em água, abertura numérica 1,20</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B amplificador</td><td>Molecular Dispositivos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>capilares de vidro de borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaiola Faraday</td><td>Homemade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>French Press</td><td>Glen Mills</td><td>5500-000011</td><td></td></tr><tr><td>IKA Eurostar PWR CV S1 agitador</td><td></td><td></td><td></td>aéreo de laboratório</tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Olympus</td><td>IX71 ou IX73</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td> <td>(Narishige)</td> <td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanupulator MPC-385</td><td>Sutter Instrumentos</td><td>FG-MPC325</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de microeletrodo para ponte de ágar</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3F4515</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td> <td>(Sutter Instruments)</td> Mini célula <td>P97</td><td></td></tr><tr><td>para prensa francesa</td><td>Glen Mills</td><td>5500-FA-004</td><td></td></tr><tr><td>MIXER IKA 6-2000RPM</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-50705-50</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva ampliação de 100X</td><td>Lente Nikon&nbsp;</td><td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td><td></td></tr><tr><td>pClamp 10</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de perfusão</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-24E</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem homogeneizador 10 ml</td><td>Wheaton</td><td>358039</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada SORVALL X4R PRO-MD</td><td>Thermo Scientific</td><td>75 009 521</td><td></td></tr><tr><td>Pequenas lamínulas de vidro redondas: 5 mm de diâmetro, 0,1 mm de espessura</td> Mesa de isolamento de vibração <td>Warner Instruments</td><td>640700</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Newport</td><td>VIS3036-SG2-325A</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucônico acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&</td><td>nbsp; Sigma Aldrich</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td> Sigma Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TMA</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>331635</td><td></td></tr><tr><td>TrisBase</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>TrisCl</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

o uso da técnica de grampo de remendo para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

A termogênese mitocondrial (também conhecida como desacoplamento mitocondrial) é uma das metas mais promissoras para aumentar o gasto energético para combater a síndrome metabólica. Tecidos termogênicos como gorduras marrons e bege desenvolvem mitocôndrias altamente especializadas para produção de calor. Mitocôndrias de outros tecidos, que produzem principalmente ATP, também convertem até 25% da produção total de energia mitocondrial em calor e podem, portanto, ter um impacto considerável na fisiologia de todo o corpo. A termogênese mitocondrial não é apenas essencial para manter a temperatura corporal, mas também previne a obesidade induzida pela dieta e reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) para proteger as células contra danos oxidativos. Uma vez que a termogênese mitocondrial é um dos principais reguladores do metabolismo celular, uma compreensão mecanicista desse processo fundamental ajudará no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial. É importante ressaltar que os mecanismos moleculares precisos que controlam a ativação aguda da termogênese nas mitocôndrias são mal definidos. Essa falta de informação deve-se, em grande parte, à escassez de métodos para a medição direta de proteínas desacoplamento. O desenvolvimento recente da metodologia de patch-clamp aplicada às mitocôndrias possibilitou, pela primeira vez, o estudo direto do fenômeno na origem da termogênese mitocondrial, o vazamento de H+ através do IMM, e a primeira caracterização biofísica dos transportadores mitocondriais responsáveis por ele, a proteína desacoplamento 1 (UCP1), específica das gorduras marrom e bege, e o transporte ADP/ATP (AAC) para todos os outros tecidos. Esta abordagem única fornecerá novas percepções sobre os mecanismos que controlam o vazamento de H+ e a termogênese mitocondrial e como eles podem ser direcionados para combater a síndrome metabólica. Este artigo descreve a metodologia de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias para estudar sua capacidade termogênica medindo diretamente as correntes H+ através do IMM.

O desenvolvimento da metodologia de grampo de remendo aplicado às mitocôndrias proporcionou o primeiro estudo direto do vazamento de H+ através do IMM e dos transportadores mitocondriais, UCP1 e AAC, responsáveis por isso. A análise eletrofisiológica dos vazamentos H+ dependentes de UCP1 e AAC pode fornecer um primeiro olhar da capacidade termogênica das mitocôndrias. A seção de resultados descreve os procedimentos padrão para medir o vazamento de H+ via UCP1 e AAC.
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Este artigo de método detalha os principais passos na medição do vazamento de H+ através da membrana mitocondrial interna com a técnica de patch-clamp, uma nova abordagem para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias.

O uso da técnica de grampo de remendo para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Este protocolo descreve como a técnica de grampo de remendo pode ser usada para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias medindo diretamente o vazamento de prótons mitocondriais através da membrana mitocondrial interna. A medição direta da corrente de próton através da membrana mitocondrial interna ajuda a identificar e caracterizar precisamente os mecanismos moleculares responsáveis pela termogênese mitocondrial. Esta técnica permite não apenas medir a corrente de prótons através da membrana mitocondrial interna, mas também estudar outras condutas importantes para a função mitocondrial, como cálcio ou metabólitos como nucleotídeos de adenina.Posicione o rato eutanizado nas costas e pulverize o álcool para limpar e molhar o cabelo. Então, faça uma incisão de dois centímetros no tórax. Depois de agarrar a pele com pinças, disseque o coração do peito do animal e enxágue-o para remover todo o sangue em um béquer de 10 mililitros com cinco mililitros de solução de isolamento frio.Uma vez que o coração tenha sido limpo de vestígios de sangue, transfira-o para outro béquer de 10 mililitros contendo cinco mililitros de tampão de isolamento frio e corte-o em pedaços finos. Em seguida, transfira para um homogeneizador de vidro de 10 mililitros refrigerados no gelo. Use um agitador aéreo para homogeneizar o tecido pré-cortado no gelo com seis golpes suaves a uma velocidade controlada de 275 rotações por minuto.Transfira o homogene de homogeneização para um tubo cônico gelado de 15 mililitros e centrifuá-lo a 700 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para pelotar os núcleos e células ininterruptas. Colete o supernatante em um tubo fresco de 15 mililitros e coloque-o no gelo. Centrifugar o supernante a 8.500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para obter uma pelota contendo as mitocôndrias.Resuspend a pelota mitocondrial em 3,8 mililitros de tampão de mannitol hipertônico frio e incubar a suspensão mitocondrial no gelo por 10 a 15 minutos. Preencha a suspensão de manitol hipertônico mitocondrial em uma célula de mini-pressão refrigerada da imprensa francesa. Então, coloque a célula na imprensa francesa.Em seguida, selecione o modo baixo da prensa francesa e comprima a suspensão através da célula de mini-pressão a 110 no mostrador para as mitocôndrias de gordura marrom, e a 140 para as mitocôndrias cardíacas, garantindo que a suspensão saia da célula de mini-pressão a uma taxa de cerca de uma gota por segundo. Colete as gotas em um tubo cônico refrigerado por gelo de 15 mililitros. Centrifugar a suspensão a 10,500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.Resuspenda a pelota mitoplasta em 0,5 a 2 mililitros de tampão de cloreto de potássio hipertônico frio e armazene a suspensão no gelo. Puxe os filamentos de vidro borossilicato no dia da gravação usando um puxador de micropipette, definindo um programa no puxador usado para gerar pipetas com alto grau de reprodutibilidade. Insira um filamento de vidro dentro do puxador e puxe para obter quase duas pipetas de remendo idênticas de um filamento borossilicato.Ajuste o programa quando as pipetas se tornarem inconsistentes entre os ciclos de puxar devido ao envelhecimento do filamento da caixa de aquecimento do puxador. Posicione a pipeta dentro do polidor de pipeta e coloque a ponta perto do filamento sob a ampliação de 100X para acioná-la. Pressione o pedal do pé várias vezes para aquecer o filamento sem entupir ou danificar a curva da ponta.Polonês até que as pipetas tenham uma resistência entre 25 e 35 megaohms são obtidos quando preenchidos com solução de pipeta baseada em TMA. A cobertura pré-incubada desliza com 0,1% de gelatina para reduzir a adesão mitoplastia e enxágüá-las com a solução de banho de cloreto de potássio antes de depositar a suspensão mitoplasta. Prepare uma diluição bruta misturando aproximadamente 35 microliters da suspensão mitoplastia concentrada com 500 microliters da solução de banho de cloreto de potássio e coloque-o nos deslizamentos de cobertura previamente colocados em um poço de uma placa de quatro poços.Incubar no gelo por 15 a 20 minutos para mitoplastos sedimentarem o deslizamento da tampa. Encha completamente a câmara de banho com aproximadamente 50 microlitres da solução de banho de cloreto de potássio e transfira um deslizamento de cobertura com mitoplastos dentro da câmara usando pinças finas de microdisseção com uma ponta dobrada. Disponha o deslizamento de cobertura na parte inferior da câmara sem perfumar a câmara para manter os mitoplastos estáveis no deslizamento de cobertura.Escolha um mitoplastia não adesiva individual escaneando o deslizamento da tampa sob o microscópio com um objetivo de 60X. Carregue a pipeta com a solução de pipeta e coloque-a no porta-pipetas. Leve a pipeta para a solução de banho com um micromanipulador e mova-a logo acima do mitoplasto selecionado para chegar perto do IMM.Segure o potencial da membrana em zero milvolts e aplique 10 pulsos de milívola usando o comando de teste de membrana no programa do amplificador. Aplique uma leve pressão negativa para criar rapidamente um gigaseal com o IMM. Levante a pipeta com o mitoplasto anexado para mantê-los longe do deslizamento da tampa para evitar a quebra da vedação devido à deriva da pipeta durante o experimento.Compense os transitórios de capacitância desviada com o comando de teste de membrana no programa do amplificador antes de testar a configuração de mitoplasto completo para obter uma medição correta de capacitância para a membrana mitoplasta após a invasão. Aplique pulsos de tensão de curta duração com o programa do amplificador para romper o patch de membrana sob a pipeta de vidro e alcançar a configuração de mitoplasto inteiro. Após a invasão, encaixe os transitórios de capacitância com a opção de teste de membrana do programa do amplificador para avaliar a capacitância da membrana e sua resistência ao acesso.Imediatamente após a invasão, substitua a solução de banho de cloreto de potássio por uma solução de banho HEPES por perfusão. Aplique um protocolo de rampa de 850 milissegundos com o programa do amplificador. A aplicação do protocolo de rampa de tensão induz uma corrente de próton de grande amplitude em toda a IMM de gordura marrom sem a adição de ácidos graxos exógenos, os ativadores necessários de UCPs.Após a perfusão pelo inibidor ucp1 difosfato de guanosina ou ciclodextrina beta de 10 milimolar para a extração de ácido graxo de membrana endógena, a corrente residual é usada para determinar a amplitude das correntes UCP1, que desaparece completamente no IMM de camundongos deficientes ucp1. Ao contrário da gordura marrom, o IMM de tecidos não adiposos, como músculo esquelético e coração, não desenvolve uma corrente de próton mensurável imediatamente após a invasão. Para induzir uma corrente de próton mensurável através da AAC, é essencial aplicar a solução de banho HEPES contendo um a dois micromolar de ácidos graxos exógenos.Para confirmar que a corrente de próton medido é transportada pela AAC, é importante aplicar inibidores específicos, carboxyatractyloside, que quase inibem completamente a corrente de prótons mostrada no IMM de camundongos deficientes AAC1. Uma inibição constante, mas nunca completa do vazamento de prótons, só é alcançada quando a ADP está presente em ambos os lados da membrana para gerar uma troca ativa de nucleotídeos via AAC. A qualidade da preparação do mitoplast influenciará a taxa de sucesso na obtenção da configuração de mitoplasto.É essencial otimizá-lo. Uma vez que o mecanismo molecular da termogênese mitocondrial é dissecado com a técnica de grampo de remendo, a medição do consumo mitocondrial de oxigênio demonstrará a importância da corrente de prótons e da termogênese em mitocôndrias intactas. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores explorarem todos os tipos de condutâncias, íons e metabólitos importantes para o funcionamento das mitocôndrias.

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Research

JoVE Journal

Biology

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Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos...

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Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Um método para isolar vesículas submitocondriais enriquecidas em F1FO ATP sintase a partir de complexos de cérebro de rato é descrito. Essas vesículas permite o estudo da actividade de F1FO complexo ATPase ea sua modulação por meio da técnica de gravação de patch clamp.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; Ó</sub&gt; ATPase Vesicle Preparação e Técnica para Execução de Remendo Recordings Grampo de membranas de vesículas submitocondriais

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Aqui, apresentamos dois protocolos para a medição de mitocondrial Ca2 + afluxo em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Por mitocôndrias isoladas, detalhamos uma placa baseada no leitor Ca2 + importação ensaio usando o Ca2 + sensível tingir cálcio verde-5N. Para culturas de células, nós descrevemos um método de microscopia confocal, usar a tintura de Ca2 + Rhod-2h.

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Este método explora a contribuição do poro de transição de permeabilidade mitocondrial para o vazamento de prótons de baixa condução para determinar o limiar de tensão para abertura de poros em camundongos neonatais frágeis da síndrome X com aumento do teor de coenzyme mitocondrial de cardiomiocrata Q em comparação com o controle do tipo selvagem.

Avaliação da Probabilidade Aberta do Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial na Configuração do Coenzyme Q Excesso

Camundongos e ratos são implantados cirurgicamente com transponders de temperatura remotos e, em seguida, habituados ao ambiente de teste e procedimento. As mudanças na temperatura muscular são medidas em resposta a estímulos farmacológicos ou contextuais na gaiola doméstica ou durante a atividade física prescrita (ou seja, caminhada em esteira a uma velocidade constante).

Medindo a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar o significado fisiológico do impacto da atividade do tecido adiposo marrom (BAT) no metabolismo humano. Isto é conseguido combinando carga de carboidratos e calorimetria indireta com medidas de mudanças supraclaviculares de temperatura. Esta nova abordagem pode ajudar a desenvolver um alvo farmacológico para a termogênese BAT em humanos.

Usando uma combinação de calorimetria indireta, termografia infravermelha e níveis de glicose no sangue para medir a termogênese do tecido adiposo marrom em humanos

Este protocolo detalha um método para medir diretamente a atividade do canal iônico em vesículas intracelulares usando um sistema manual de patch-clamp endolisossomal. Ilustramos o método que envolve o aumento dos endolisossomos e o isolamento manual dessas vesículas. Essa abordagem garante que os pesquisadores possam replicar e aplicar o procedimento com precisão.

Técnicas de Patch-Clamp para Análise de Vesícula Endolisossômica Única

Teste de sensibilidade visual em lagartos usando um paradigma de condicionamento operante, que emprega a reprodução de vídeo de random-dot kinematograms e computer-generated invertebrados.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Aprenda a técnica de grampo de remendo para medir vazamento de prótons na membrana mitocondrial interna. Este método permite caracterizar mecanismos moleculares da termogênese mitocondrial em tecidos como coração e gordura marrom.

O uso da técnica de grampo de remendo para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias

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