Name: Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda a realizar o ensaio automatizado de γ-H2AX foci em linfócitos de sangue periférico humano para dosimetria biológica. Este método utiliza microscopia de fluorescência automatizada para detectar quebras de dupla fita no DNA induzidas por radiação ionizante de forma rápida e sensível.

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Os autores gostariam de agradecer aos participantes do estudo por suas doações de sangue, bem como a enfermeira V. Prince pela coleta de amostras de sangue. A assistência financeira da Fundação Nacional de Pesquisa da África do Sul (NRF) para esta pesquisa é reconhecida. As opiniões expressas, e as conclusões que chegaram são dos autores e não são necessariamente atribuídas à NRF. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA), por meio de um Projeto de Cooperação Técnica (número: URU6042) para apoiar W. Martínez-López, bem como o Projeto de Pesquisa Coordenada E35010 (número do contrato: 22248).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Comitê de Ética da Universidade do Cabo Ocidental - Código BM18/6/12.
1. Preparação de Soluções48
<ol><li>Solução de fixação celular (3% PFA no PBS)<ol>
<li>Use os equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados e trabalhe em uma capa de fume, adicione 20 g de paraformaldeído a 200 mL de H2O. Aqueça a mistura a 60 °C para auxiliar na dissolução.</li>
		<li>Uma vez que o PFA é dissolvido, adicione 40 gotas de 5 N NaOH cuidadosamente ao longo de 30 minutos e para esfriar à temperatura ambiente. Ajuste ao pH 7 usando 1 M HCl e faça até um volume final de 250 mL com H2O destilado (alíquotas podem ser armazenadas a -20 °C por 1 ano). Adicione 25 mL desta solução a 41,7 mL PBS para pagar uma solução PFA de 3%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de 1% Bovine Serum Albumin (BSA): Adicione 10 g de BSA a 1000 mL de PBS e misture até dissolver. Armazenar a 4 °C até usar (máxima de 72 horas).</li>
	<li>Solução Triton-X em uma concentração de 1:500: Adicionar 1 μL de Triton-X a 500 μL de PBS, armazenar a 4 °C até o uso (máximo 24 horas).</li>
	<li>Soluções de anticorpos<ol>
<li>Anticorpo primário - Anti-γ-H2AX na concentração de 1:500: Adicionar 1 μL de anti-γ-H2AX a 500 μL de solução BSA de 1%, armazenar a 4 °C até o uso (máximo 24 horas).</li>
		<li>Anticorpo secundário - DAM-TRITC em concentração de 1:1000: Adicionar 1 μL de DAM-TRITC a 1000 μL de solução BSA de 1%, armazenar a 4 °C até o uso (máximo 24 horas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mídia completa do Roswell Park Memorial Institute (cRPMI)<ol>
<li>Adicione soro bovino fetal filtrado (FBS) e penicilina-estreptomicina à mídia RPMI 1640 em uma garrafa estéril para dar uma concentração final de 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de Amostras
NOTA: Para este protocolo, amostras de sangue integral periférica são coletadas por venipuntura em tubos de coleta de lítio-heparina de voluntários adultos saudáveis (com consentimento informado - BM18/6/12 Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica da Universidade do Cabo Ocidental). Antes de começar, certifique-se de que o sangue e o meio de densidade de 1,077 g/mL estejam aclimatados à temperatura ambiente.
<ol><li>Em um gabinete de biossegurança preparado, diluir o sangue periférico inteiro em um volume de 1:1 com PBS e camada suave do sangue diluído em um volume igual a dois volumes de médio com densidade de 1,077 g/mL. É importante colocar gradualmente o sangue no meio de densidade segurando o tubo inclinado a 45°, garantindo que o sangue e o meio de densidade não se misturem.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente a suspensão para uma centrífuga e gire a 900 x g por 20 minutos. A partir daí, pipete a camada 'nublada' apenas para um novo tubo cônico estéril e encha o tubo com PBS e centrífuga por 10 minutos a 1000 x g. Depois disso, aspire o supernatante com uma pipeta, sendo cauteloso para não perturbar a pelota, resuspensar a pelota PBMC cuidadosamente em 1 mL PBS e encher o tubo com PBS.</li>
	<li>Repita o passo de lavagem acima mais duas vezes para chegar a um total de três lavagens.</li>
	<li>Conte o número de PBMCs usando um hemótmetro, ciente de que cada mL de sangue periférico de um doador adulto resultará em uma média aproximada de 1 - 1,5 x 106 PBMCs49. Após a contagem, dilui a pelota PBMC a uma concentração de 8 x 105 linfócitos em 1 mL de cRPMI. Em seguida, adicione aproximadamente 2 x 106 PBMCs ou 2,5 mL da solução pbmc isolada em um tubo estéril e cônico para irradiações.</li>
</ol>3. Irradiações de amostras
ATENÇÃO: Manuseie a unidade de radiação de acordo com as diretrizes de Proteção contra Radiação e use um dosímetro físico o tempo todo. Certifique-se de que o sistema de irradiação utilizado esteja calibrado e configure de tal forma que as doses corretas esperadas sejam alcançadas.
<ol><li>Irradiar PBMCs à temperatura ambiente usando uma fonte de 60Co. Calibrar (protocolo TRS-398) com uma câmara Farmer 117 para a qual um fator de calibração da câmara obtido do Instituto Nacional de Metrologia da África do Sul (NMISA)50.<ol>
<li>Para este ensaio, coloque os tubos cônicos entre uma folha de acrílico de 5 mm (usada para o acúmulo de entrada do feixe) e o material de 50 mm backscatter com a taxa de dose de origem atual de 60Co de 0,57 Gy/min para um tamanho de campo de 300 mm × 300 mm homogêneo a 750 mm Fonte à Distância superficial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Irradie os PBMCs com doses classificadas de 0,125, 0,500, 1.000, 1.500 e 2.000 Gy, e mantenha as amostras de controle irradiadas falsas, na sala de controle, recebendo apenas exposição à radiação ambiente.</li>
	<li>Incubar as amostras irradiadas por 1 hora a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2, a fim de atingir o número máximo de focos γ-H2AX. NOTA: O tempo de incubação pode ser modificado de acordo com o design experimental.</li>
</ol>4. Preparação de slides
NOTA: Consulte a Figura 1 para a configuração do slide.
<ol><li>Prepare 3 slides (repetições técnicas) usando slides revestidos com uma superfície carregada positivamente para melhorar a adesão por condição de irradiação (ou por tubo cônico). Coloque o slide no suporte do clipe, adicione a placa de filtro em cima dele e, finalmente, o funil. Fixar os clipes de slides e colocar no citocentrifuuge.</li>
	<li>Adicione 250 μL da suspensão da célula ao funil (200.000 células/slide) e gire por 30 x g por 5 minutos usando um cytocentrifuge.</li>
	<li>Após a citocentrifugação, remova o slide do suporte do clipe e usando uma caneta hidrofóbica, desenhe um círculo ao redor do local com as células, a fim de reter a mancha imunofluorescente nas células ligadas durante o processo de coloração.</li>
</ol>5. Fixação e imunofluorescência γ-H2AX coloração
NOTA: Todas as soluções são cuidadosamente adicionadas diretamente na área celular que é marcada por um círculo hidrofóbico. As soluções de coloração são distribuídas ligeiramente acima do slide sem permitir que a ponta da pipeta interrompa as células. As soluções NÃO são adicionadas ao slide completo.
<ol><li>Corrija os slides em 3% pfa recém-preparados por 20 minutos. NOTA: Os slides podem ser armazenados em PBS contendo PFA de 0,5% a 4 °C durante um máximo de 2 dias antes da imunosstaining ser realizada. Depois disso, lave slides em um frasco de Coplin com PBS por 5 minutos e cubra as células com 100 μL da solução Triton-X fria por 10 minutos para permitir a permeabilização.</li>
	<li>Coloque a solução Triton-X em papel de tecido e lave os slides três vezes em solução BSA de 1% por 10 minutos. Isso é feito para evitar o fundo indesejado bloqueando a ligação de anticorpos não específicos.</li>
	<li>Incubar lâminas à temperatura ambiente com 100 μL do anticorpo anti-γ-H2AX diluído de 1:500 diluído por 1 hora em uma câmara umidificante, facilmente realizado adicionando papel de tecido molhado na base de uma caixa de armazenamento de slides retangular.<ol>
<li>Coloque a solução de anticorpos em papel de tecido e realize três lavagens com solução BSA de 1% por 10 minutos em um frasco de Coplin para remover anticorpos primários não ligados e para evitar a ligação não específica do anticorpo secundário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar lâminas com 100 μL da solução de anticorpos secundárias DAM-TRITC diluídas de 1:1000 por 1 hora na câmara umidificante. Coloque a solução de anticorpos em papel de tecido e lave os slides em PBS por 10 minutos três vezes.</li>
	<li>Por fim, seque as lâminas fora do círculo hidrofóbico com papel de tecido macio e sem poeira e adicione 1-2 gotas de DAPI resolvidas em um meio de montagem aquoso e cubra suavemente o slide com um deslizamento de cobertura de 24 x 50 mm, garantindo que não haja bolhas de ar presas e coloque na geladeira a 4 °C durante a noite. Os slides podem ser armazenados a 4 °C durante um máximo de 2 semanas antes da digitalização.</li>
</ol>6. Digitalização automatizada e pontuação de slides
NOTA: O sistema de digitalização precisa ter um microscópio fluorescente, uma câmera CCD de alta resolução (dispositivo acoplado carregado) conectada a um agarrador de quadros para digitalização em tempo real de imagens de vídeo, um estágio de digitalização, trackball para movimentos manuais, mouse 3D, PC rápido e monitor e disco rígido para arquivamento(Figura 2).
<ol><li>Configuração do classificador NOTA: O classificador é um conjunto de parâmetros que define como o sistema detecta células. Resulta do treinamento baseado em campos de imagem pré-classificados. Um classificador é específico para uma ampliação do microscópio, tipo celular e laboratório. Os classificadores podem, portanto, exigir modificações nos seguintes parâmetros para adaptá-los às condições atuais. Recomenda-se testar as configurações com um slide de referência antes da avaliação.<ol>
<li>Aquisição de imagem: Use um objetivo seco de 40x para imagem. Para alcançar qualidade de imagem comparável em todas as células, defina o tempo de integração da câmera para o modo automático. Defina o tempo máximo de integração para pelo menos 1 segundo para ambos os canais coloridos (ganho de câmera 4.0). O canal de sinal é adquirido com 10 aviões de foco e 14/40 μm entre os aviões.</li>
		<li>Seleção celular: São detectados PBMCs dentro de uma faixa de 20,00 μm2 e 76,00 μm2. Ajuste a profundidade máxima de concavidade para 0,05 e a proporção máxima para 1,4. Defina o limiar relativo do nível cinza para 20%.</li>
		<li>Processamento de células: Processe o canal de contra-mancha da DAPI com um algoritmo máximo de histograma para reduzir o fundo. O canal de sinal é processado com um filtro TopHat (força 7, fator de alisamento 0) para reduzir o fundo e melhorar os sinais.</li>
		<li>Contagem de sinais: Conte os focos usando o recurso Contagem de objetos do dispositivo. Para evitar uma avaliação falso-positiva dos sinais de fundo restantes, apenas os sinais que mostram pelo menos 30% da intensidade quando comparados com o objeto mais brilhante da célula são contados.</li>
	</ol></li>
	<li>Inserir/Colocar slides na plataforma de varredura automatizada ou no estágio de slides, depois de cuidadosamente limpo com 70% de etanol, para remover qualquer poeira.</li>
	<li>Configuração de slides - Menu de diálogo de configuração de slides aberto(Figura 3)<ol>
<li>Selecione o caminho de dadoscorreto , isso especifica onde os arquivos de slides resultantes da pesquisa são armazenados.</li>
		<li>Dê um nome ao slide, cada slide deve receber um nome único. Se uma série de slides forem inseridos na forma de uma lista enumerada, o '?' pode ser usado como curinga para o número de slides.</li>
		<li>Selecione o classificador apropriado, conforme descrito na seção 1.1 - 1.4 (Figura 4).</li>
		<li>Selecione a janela de pesquisa e selecione Predefinido se houver uma definição de janela de pesquisa que corresponda ao círculo celular cytocentrifuge, selecione a respectiva definição na coluna Tamanho ou selecione Manual se não houver uma definição de janela de pesquisa pré-definida disponível. Neste caso, a coluna Tamanho não precisa ser definida.</li>
		<li>Selecione a contagem máxima de células e adicione o número máximo de células necessárias para serem digitalizadas. A pesquisa é encerrada mesmo que a janela de pesquisa selecionada ainda não tenha sido digitalizada completamente assim que a Contagem de Células Max for atingida. Para aplicações de biodosimetria, a pontuação automatizada de 1000 células por slide é suficiente, considerando que 3 slides por amostra de sangue são preparados. Clique em OK para confirmar as configurações.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração de varredura de slides<ol>
<li>Clique no botão Pesquisar na barra lateral. Se a configuração Janela de Pesquisa Manual for selecionada na configuração de slides, um diálogo será aberto permitindo a determinação da área de varredura(Figura 5). Usando o objetivo de 10x, selecione a área de pesquisa retangular no slide interativamente, fixando dois cantos do campo de pesquisa pelo clique esquerdo do mouse. Isso pode ser confirmado com o botão OK. Se a janela de pesquisa estiver se referindo a uma janela de pesquisa predefinida, esta etapa será omitida.</li>
		<li>O usuário é solicitado a ajustar uma posição de início de foco. Em seguida, um objeto de referência será selecionado automaticamente, o software solicitará ao usuário que concentre e centralizará um núcleo de referência (usando o objetivo de 40x) para cada slide e confirme as configurações com OK. O sistema se moverá automaticamente para todos os slides sequencialmente. Se necessário, ajuste a configuração de imagem ao vivo - Tempo de integração para esta etapa(Figura 5).</li>
		<li>Verifique todas as configurações do microscópio e confirme o prompt do sistema com OK. O sistema iniciará o procedimento automatizado de foco e digitalização. Uma vez concluída a varredura, os dados são salvos no computador para análises. O sistema de digitalização desliga-se automaticamente após a varredura ser concluída. NOTA: Certifique-se de que a alavanca do tubo de microscópio está em uma posição que desvia toda a luz para a câmera.</li>
		<li>Search End, a pesquisa é encerrada se toda a pesquisa tiver sido digitalizada, se a contagem máxima de células foi atingida ou se a pesquisa foi cancelada.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de slides NOTA: A varredura concluída está representada na Figura 6.<ol>
<li>Quando a varredura estiver concluída, clique no botão Galeria na barra lateral. Revise a galeria, que consiste em pequenas imagens de células detectadas. Nesta janela(Figura 7),especifique se as células armazenadas na galeria por um critério a ser escolhido a partir de um menu suspenso. As células são geralmente exibidas na ordem em que foram detectadas.</li>
		<li>Clique no Histograma/Diagrama de Valor de Característica de Qualidade ( Figura8) para dar a distribuição da medida de qualidade para as células detectadas, bem como os meios, e o desvio padrão dos focos pontuados.</li>
	</ol></li>
</ol>

C. Schunck é um funcionário da MetaSystems Hard & Software GmbH, Altlussheim, Alemanha.

Este protocolo descreve um procedimento stepwise para a pontuação automatizada baseada em microscopia fluorescente do ensaio de focos γ-H2AX. Ilustra a utilidade do ensaio de focos como um método eficiente para analisar o número de DSB de DNA induzido por radiação em linfócitos sanguíneos periféricos para realizar uma avaliação de dose biológica em um cenário de acidente de radiação onde indivíduos podem ser expostos a níveis desconhecidos de IR.
Neste protocolo específico, os PBMCs foram irradiados in vitro para imitar uma exposição à radiação in vivo. Uma vez que a irradiação e o tempo de incubação de uma hora são concluídos, slides são feitos usando um citocentrifuuge para criar um ponto de concentração de células no slide. O uso de um cytocentrifuge é vital para alcançar condições padronizadas para pontuação automatizada. Quando concluída, uma caneta hidrofóbica é usada para fazer um círculo ao redor das células, para reduzir o desperdício de reagentes, permitindo que o usuário localize os reagentes de coloração. Este tipo de caneta pode ser usada em várias técnicas de imunossuagem, como em seções de parafina, seções congeladas e preparações de citologia. Além disso, é importante selecionar uma caneta hidrofóbica compatível com sistemas de detecção baseados em enzimas e fluorescentes. Após a preparação do slide, ocorreu a fixação e a imunofluorescência γ-H2AX. Neste protocolo, as células são fixadas usando 3% de PFA em uma solução PBS por 20 minutos. Para que a imunostenção tenha sucesso, é essencial que a morfologia das células seja retida e que os sítios antigênicos sejam acessíveis aos reagentes de detecção que estão sendo utilizados. PFA é um agente relativamente gentil para fixação e estabiliza as células, preservando estruturas proteicas51. Experimentos de otimização com maiores concentrações de PFA e tempos de fixação mais longos resultaram em um impacto negativo na qualidade do slide, mas o armazenamento adicional (durante a noite) em 0,5% de PFA até 24 horas rendeu bons resultados.
O anticorpo monoclonal primário 2F3 usado neste protocolo reage à variante histona H2AX quando fosforilado em Serine 139 após indução de DNA DSB. O anticorpo é capaz de se ligar ao resíduo fosforilado sem reatividade cruzada com outras histonas fosforiladas52. Por se trata de um anticorpo monoclonal de camundongos primário, um anticorpo secundário foi selecionado contra a espécie hospedeira do anticorpo primário enquanto era criado em um hospedeiro alternativo, ou seja, burro-anti-rato (DAM)-TRITC. Embora a coloração imunofluorescente seja baseada em ligação anticorpo-epitope específica, várias forças intermoleculares também podem resultar em coloração de fundo não específica. Para reduzir a vinculação não específica, é importante utilizar um reagente de bloqueio nos protocolos de coloração imunofluorescente53; usamos uma solução BSA. Além disso, deve-se alocar tempo suficiente para esta etapa de bloqueio, deixando os slides na solução por pelo menos 20 minutos antes da coloração de anticorpos primários e secundários. Além disso, a solução BSA também deve ser utilizada como diluente para os anticorpos primários e secundários. Dependendo do anti-γ-H2AX e do anticorpo secundário que é usado para a coloração, deve-se considerar testar diferentes diluições de anticorpos para determinar a concentração ideal. Para uma pontuação mais precisa, uma coloração dupla pode ser conduzida, adicionando anticorpos proteicos adicionais de reparação de DNA DSB.
Uma grande desvantagem desse tipo de análise é a necessidade de adquirir amostras de sangue o mais rápido possível após a exposição, já que o número máximo de focos é conhecido por diminuir de volta aos níveis normais dentro de 48 horas após a irradiação. Portanto, quando o tempo de acidente de radiação e amostragem subsequente de sangue é conhecido, pode ser útil trabalhar com diferentes curvas de calibração que foram estabelecidas em diferentes pontos de tempo após a irradiação in vitro (por exemplo, 4, 8, 12 e 24 horas). No entanto, como já mencionado na seção de introdução do manuscrito, a força do ensaio de focos γ-H2AX está em propósitos iniciais e rápidos de triagem e deve ser usada para priorizar a dosimetria biológica citogenética mais demorada. Um cenário combinado onde vários biomarcadores de biodosimetria são usados em paralelo, gerará a estimativa de dose mais confiável e vários laboratórios de biodosimetria em todo o mundo uniram forças para configurar redes nacionais que podem ser ativadas e usadas para permitir múltiplas avaliações de biodosimetria paralela por laboratórios com diferentes expertises37,54,55 . Além disso, estão em andamento desenvolvimentos para análises super-rápida, como um laboratório móvel no local do acidente56. Novos e promissores métodos de biodosimetria estão sendo constantemente desenvolvidos, o que, esperançosamente, resultará em um rendimento ainda mais rápido e confiável no futuro57.
Para o sistema automatizado de análise de imagens, os slides são inseridos ou colocados na plataforma de digitalização automatizada ou no estágio de slides. Depois disso, nomeie e salve os detalhes do slide na pasta apropriada no computador conectado. Para este experimento, a detecção automatizada de núcleos e focos baseia-se nas respectivas configurações do classificador. Ao criar um classificador, certifique-se de que as configurações do classificador selecionado correspondam ao tipo celular atual, condições de preparação e coloração imunofluorescente da amostra. Canais fluorescentes apropriados que correspondem ao espectro de excitação dos anticorpos primários e secundários são definidos no classificador. O classificador permite definir parâmetros adicionais de pontuação, se necessário (por exemplo, tamanho do núcleo, intensidade fluorescente, conforme descrito na Seção 6.1). Se duas ou mais proteínas de reparação de DNA (por exemplo, γ-H2AX e 53BP1) forem combinadas em um experimento, o sistema também é capaz de detectar co-localizações de sinais. Primeiro, o sistema adquire imagens DAPI, aplica o processamento de imagens e identifica núcleos usando critérios morfológicos definidos no classificador. Os sinais TRITC são adquiridos utilizando pilhas de 10 z com um tamanho de passo de 0,35 mm entre os planos focais47. O classificador usou a Contagem de Focos Diretos, onde o número de sinais TRITC distintos dentro do núcleo são pontuados. Aqui, é importante levar em consideração que, com o aumento da dose de radiação, os sinais de foco tendem a se fundir em objetos maiores, resultando em uma subestimação do número real de focos se os objetos forem contados diretamente. Não foi necessário para a análise aqui descrita, mas uma etapa adicional com a Contagem de Focos Corrigidos pode ser implementada para resolver este problema. Este último permite que o sistema obtenha os tamanhos dos sinais detectados e os pesa de acordo. O uso de ambos os métodos de contagem pode fornecer uma estimativa mais realista do número real de focos em doses mais altas.
Para iniciar a digitalização automatizada, a área de digitalização é determinada usando o objetivo de 10x do microscópio para fazer uma área de busca retangular fixando dois cantos do campo de pesquisa pelo clique esquerdo do mouse (Figura 5), seguido de foco na posição inicial. O objeto de referência é selecionado automaticamente, e o software solicita ao usuário que concentre e centrale um núcleo de referência (usando o objetivo de 40x) para cada slide. Após o início da pesquisa, o sistema se moverá para o centro da janela de pesquisa do primeiro slide selecionado e solicitará centralizar e concentrar o objeto de referência. Este objeto será posteriormente usado como referência de posição para corrigir qualquer mudança nas posições da célula. O segundo objetivo do campo de referência é o ajuste automático da luz, no modo de luz transmitido a luz é ajustada até que o nível de luz ideal seja atingido. No modo fluorescência o nível de luz é fixo, mas o tempo de integração da câmera CCD pode ser aumentado até que o sinal necessário seja medido. Para permitir um ajuste correto da luz, a referência deve conter objetos com coloração típica. É importante não usar um campo que tenha artefatos com intensidade de coloração muito alta. Após o ajuste da luz, o sistema inicia o foco automático da grade na posição da grade mais próxima do campo de referência. Ele continua a concentrar os campos em uma grade regular, movendo-se em uma mesmã em direção à frente e na parte de trás da janela de busca. A varredura começa quando o foco automático da rede estiver concluído. O estágio é movido em um campo de padrão de meandro após campo para capturar dados. Quando uma célula é detectada, sua imagem de posição e galeria são armazenadas e exibidas na tela e a contagem de células é atualizada. Se ocorrer um erro de microscópio, estágio ou alimentador, a pesquisa será automaticamente cancelada. O único passo em que há uma intervenção manual do operador é durante a configuração de varredura de slides. Este também é o ponto onde ocorre uma rápida verificação de controle de qualidade (bolhas de ar, números de células baixas, desbotamento dos artefatos de coloração de sinal fluorescente) e onde pode ser decidido abortar a varredura de um slide de qualidade inferior. Uma pesquisa é encerrada se todo o slide tiver sido digitalizado, se a contagem máxima de células foi atingida ou se a pesquisa foi cancelada. Uma vez concluída a varredura, os dados são apresentados como visto em Figura 6. Para visualizar células digitalizadas, a janela Galeria é aberta e cada célula pode ser visualizada (Figura 7). Este é outro ponto onde o operador pode realizar um controle de qualidade verificando o foco das imagens da galeria e o número total de células que foram pontuadas. Se muitas células estão fora de foco ou pequenas células foram detectadas pelo sistema para fazer uma estimativa realista de dose (por exemplo, 100 células em vez das 1000 células pretendidas), então a decisão deve ser tomada para excluir o slide e a pontuação automática da avaliação final. Todos os dados são resumidos em histogramas (Figura 8), juntamente com informações sobre a distribuição, os meios e o desvio padrão de focos pontuados para cada célula. Os histogramas também podem ser usados para selecionar e exibir sub-populações de núcleos com base nos achados automatizados para revisão. As análises estatísticas sobre os resultados são realizadas após a distribuição, média, e o desvio padrão do número de focos por célula foram registrados manualmente. O gráfico pode ser usado como uma curva de calibração para fazer uma estimativa de dose de uma amostra de biodosimetria. Isso pode ser feito usando a equação da linha de tendência para fazer uma estimativa aproximada da dose recebida. Além disso Figura 9 ilustra que a varredura automatizada é sensível o suficiente para detectar focos induzidos em doses baixas. Além disso, os resultados mostram um claro aumento linear do número de focos por célula com dose. Deve-se notar que os resultados são apenas representativos para o classificador usado, os resultados diferem para diferentes parâmetros de classificação. Portanto, em caso de análise de biodosimetria, é importante que o mesmo classificador e a preparação de slides sejam utilizados para as amostras de biodosimetria como as que foram utilizadas para estabelecer a curva de calibração que é usada para realizar a estimativa da dose. Embora tenha saído do escopo deste estudo, é importante notar que o ensaio de focos γ-H2AX também pode ser usado para determinar irradiações parciais do corpo. A maioria das exposições de radiação acidental são exposições inhomogêneas ou parciais do corpo, onde apenas uma região localizada do corpo recebeu alta exposição de doses. Vários estudos ilustraram que é possível usar o ensaio de γ-H2AX para estimar a fração do corpo que foi irradiada e a dose para a fração irradiada42. Quando uma irradiação do corpo inteiro ocorrer, haverá indução aleatória de DNA DSB em todas as células e pode-se esperar encontrar uma distribuição de Poisson. Semelhante aos métodos citogênicos, onde a indução de aberrações cromossômicas tende a ser super dispersa em linfócitos sanguíneos periféricos onde há uma alta abundância de células com múltiplas aberrações e células com metafases normais, análise de dispersão de γ-H2AX focos usando um método de Poisson contaminado sugerido sobre distribuições dispersas de focos dispersos58. Este último também foi confirmado em in vivo experimentos com miniporcos e um macaque rhesus59.

Desde sua descoberta, a radiação ionizante (IR) tornou-se uma ferramenta indispensável nas práticas médicas e industriais atuais, bem como nas aplicações agrícolas e militares. No entanto, o amplo uso do IR também aumenta o risco de superexposição por radiação tanto para trabalhadores profissionais de radiação quanto para membros do público. O IR é um conhecido carcinógeno físico que pode induzir danos ao DNA de forma direta ou indireta, levando a riscos significativos à saúde 1,2. Por isso, é importante realizar uma avaliação da dose, uma vez que o grau de exposição forma um importante passo inicial no manejo do acidente de radiação 1.
No caso de emergências nucleares ou radiológicas em larga escala, o número de avaliações de doses que precisam ser realizadas pode variar de algumas a milhares de pessoas, dependendo do tamanho do acidente3. Nesses cenários, a dosimetria física também pode ser ambígua (por exemplo, se o dosímetro não for usado corretamente) ou indisponível, quando os membros do público estiverem envolvidos. Embora os sintomas clínicos possam ser usados para triagem, eles não são necessariamente específicos da radiação e podem resultar em um diagnóstico falso. Portanto, é aconselhável utilizar a dosimetria biológica ao lado da dosimetria física e avaliações clínicas. Este método permite a análise de alterações induzidas por radiação a nível celular e permite a identificação inequívoca de indivíduos expostos que necessitam de tratamento médico4. O médico pode, então, usar essa avaliação de dose biológica para complementar reconstruções de doses físicas e outros diagnósticos clínicos, a fim de prescrever os cuidados médicos adequados5. A necessidade de dosimetria biológica será especialmente elevada para triagem e gerenciamento médico de vítimas quando o cenário de exposição não é bem conhecido e quando as vítimas são membros do público. O principal objetivo da triagem é distinguir efetivamente pessoas "preocupadas bem", que poderiam ter sintomas prodromais, mas que não receberam alta dose, de pessoas expostas que necessitam de ajuda médica imediata e atendimento especializado. O nível limiar de dose de radiação que pode causar doenças de radiação é aproximadamente 0,75 - 1,00 Gy. Em seguida, aqueles indivíduos que recebem > 2 Gy de exposição têm maior risco de síndrome aguda de radiação e devem receber tratamento médico imediato6,7. Estimativas oportunas e precisas de doses biológicas para vítimas capturadas no fogo cruzado de tais desastres são críticas. Além disso, também pode confortar e tranquilizar as vítimas minimamente expostas8.
As autoridades de proteção contra radiação utilizam vários marcadores de biodosimetria, que são baseados principalmente na detecção de danos citogenéticos, como cromossomos ou micronucleos, em linfócitos humanos cultivados9. A detecção de danos citogenéticos também pode ser realizada pelo ensaio de translocação fluorescente in situ (FISH)10. No entanto, a maior desvantagem dos métodos citogenéticos convencionais é o longo tempo de reviravolta para obter os resultados em uma situação de emergência8.
Um dos primeiros passos no processo de reconhecimento do DNA DSB é a fosforilação da variante histona H2AX, levando à formação de γ-H2AX, e ao subsequente recrutamento de fatores de reparo. Na última década, a detecção de focos de γ-H2AX induzidos por radiação em linfócitos periféricos usando microscopia de imunofluorescência tem recebido cada vez mais atenção como uma ferramenta de dosimetria biológica confiável11,12,13,14,15. Dependendo da qualidade da radiação e do tipo celular, o rendimento máximo de γ-H2AX é detectado dentro de 0,5 - 1 hora após a irradiação16,17. Prevê-se que haja uma correlação estreita entre o número de focos de DNA DSB e γ-H2AX, bem como entre o desaparecimento de focos e reparos de DSB. Experimentos com uma tesoura laser com um micróbio laser pulsado demonstraram que γ-H2AX focos localizados aos locais de DNA DSB18. Embora continue sendo um tema de debate ativo, um dos primeiros estudos com 125sugeri uma correlação um-para-um entre o número calculado de desintegrações por célula (representável para o número de DSB de DNA induzido por radiação) e o número de γ-H2AX focos que foi pontuado19,20.
Na última década, a União Europeia financiou os projetos MULTIBIODOSE (ferramentas biodosimétricas multidisciplinares para gerenciar baixas radiológicas em larga escala) e reneb (realização da Rede Europeia de Biodosimetria) para criar uma rede sustentável em dosimetria biológica e retrospectiva21,22. Este projeto incluiu vários laboratórios em toda a Europa para avaliar as capacidades de resposta a emergências em caso de emergência radiológica14,21,22. O ensaio de focos γ-H2AX tem uma série de vantagens consideráveis, como um tempo de processamento rápido, o potencial de processamento em lote permitindo alta produtividade, bem como sua alta sensibilidade se usado dentro de poucas horas após a exposição13,23,24. A alta sensibilidade do ensaio na faixa de baixa dose resultou em uma série de estudos onde o ensaio de γ-H2AX foi utilizado como um indicador do efeito da exposição à radiação médica, tanto na radioterapia quanto em aplicações de diagnóstico por imagem25,26,27,28,29,30. Essas características fazem com que os focos γ-H2AX testem uma alternativa altamente competitiva a outros métodos de triagem precoce em grandes acidentes nucleares para separar os criticamente expostos de indivíduos de baixo risco. Vários experimentos de otimização ilustraram que é viável realizar o ensaio de focos γ-H2AX com pequenos volumes de sangue, como o estudo de Moquet et al. que relataram que é viável realizar o ensaio de γ-H2AX com apenas uma gota de sangue (picada de dedo)31. Uma abordagem semelhante foi usada no desenvolvimento do sistema RABIT (Rapid Automated Biodosimetry Tool) totalmente automatizado que foi otimizado para medir os rendimentos de γ-H2AX a partir de amostras de sangue derivadas de dedos32,33. No geral, os resultados dos estudos de intercoadia MULTIBIODOSE e RENEB sugerem que o ensaio de γ-H2AX pode ser uma ferramenta de triagem muito útil após uma recente (até 24 horas) exposição aguda à radiação12,13,14. Em um estudo inter-comparativo de baixa faixa de dose, uma dose tão baixa quanto 10 mGy poderia ser distinguida das amostras de controle irradiadas por vergonha, destacando a sensibilidade do ensaio na faixa de baixa dose34. É importante notar que a alta sensibilidade do ensaio é particularmente verdadeira para linfócitos, o que os torna um dos tipos celulares mais adequados para a avaliação de exposições de baixa dose. Os linfócitos são principalmente células não ciclistas e representam uma população síncronana. Este último evita a expressão de γ-H2AX está associada à replicação do DNA, o que reduz significativamente a sensibilidade do ensaio para detectar DSB induzido por radiação durante a fase G2 e S do ciclo celular35. Além de sua sensibilidade a doses baixas para linfócitos, o tempo de reviravolta do ensaio de focos γ-H2AX é significativamente mais rápido do que técnicas citogenéticas, como o ensaio dicêntrico e micronucleus, uma vez que não requer a estimulação de linfócitos. Portanto, os resultados podem ser obtidos em poucas horas em comparação com alguns dias para técnicas citogenéticas. Uma grande desvantagem do ensaio é o desaparecimento rápido do sinal de focos γ-H2AX, que normalmente será reduzido a níveis de linha de base dentro de dias após a exposição à radiação, dependendo da cinética de reparação de DNA36. Portanto, a aplicação mais adequada do ensaio em um contexto de biodosimetria é para fins iniciais de triagem e para priorizar o acompanhamento da dosimetria biológica citogenética mais demorado para determinadas vítimas. No entanto, para a biodosimetria retrospectiva precisa e efeitos a longo prazo, é preciso confiar em técnicas citogenéticas, como análises de PEIXEs de três cores para a detecção de aberrações cromossômicas estáveis no caso da exposição ter ocorrido há vários anos10.
Como parte de várias iniciativas de biodosimetria, vários ensaios foram avaliados para fins de triagem ao lado do ensaio de focos γ-H2AX para triagem de pessoas em emergências radiológicas em larga escala; como o ensaio dicentrics, o ensaio micronucleus de bloco de citocinas, ressonância paramagnética eletrônica (EPR), ensaio de proteína sérica (SPA), ensaio de manchas de pele (SSA), luminescência estimulada opticamente (OSL), bem como análise de expressão genética 37,38. O ensaio de γ-H2AX pode ser usado quantitativamente para avaliação da formação e reparação de DNA DSB39. No entanto, o ensaio é dependente do tempo, pois o nível de γ-H2AX tem variação de tempo após a irradiação devido à cinética de reparação do DNA DSB40. Um estudo comparativo ilustrou que a pontuação microscópica com capacidade de estágio z oferece os resultados mais precisos após 1 Giro de irradiação, enquanto a citometria de fluxo só dá resultados confiáveis em doses mais altas de IR41. Há muitos relatos do desenvolvimento de soluções de análise de imagem para uso na pontuação automatizada42,43,44,45,46. Neste protocolo, uma plataforma automatizada de microscopia fluorescente de alto rendimento é usada para analisar γ-H2AX em linfócitos sanguíneos periféricos. O uso de um sistema de pontuação automática evita tanto viés de pontuação inter-laboratorial quanto inter-observador, enquanto ainda permite sensibilidade suficiente para detectar doses abaixo de 1 Gy47. A principal vantagem deste sistema em comparação com o software de código aberto gratuito para pontuação de focos é o fato de que o processo completo desde a digitalização de slides até a captura e pontuação seja automatizado. O conceito de classificadores definível e armazenador de usuário garante a reprodutibilidade que adiciona um grau imparcial de qualidade aos resultados. Portanto, este trabalho ilustra como os resultados de focos γ-H2AX podem ser obtidos usando um método automatizado de digitalização e pontuação microscópica que pode ser usado quando amostras de sangue de indivíduos potencialmente super-expostos são recebidas por laboratórios de radiobiologia para fins de dosimetria biológica.

<table><tbody><tr><td>Albumina de soro bovino - BSA</td><td>Merck</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Sigma</td><td>S6016</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips (Tamanho 24 x 50 mm)</td><td>Lasec</td><td>Glass2C29M2450Rec</td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogênicos (1,2 mL)</td><td>WhiteSci</td><td>607101</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>Healthcare Technologies</td><td>JC370-12-L</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin Clips</td><td>Healthcare Tecnologias</td><td>JC302</td><td></td></tr><tr><td>Cartões de filtro Cytospin</td><td>Healthcare Technologies</td><td>JC307</td><td></td></tr><tr><td>Funis Cytospin Healthcare</td><td>Technologies</td><td>JC372</td><td></td></tr><tr><td>DAM-TRITC</td><td>Invitrogen</td><td>A16022</td><td></td></tr><tr><td>DAPI-Fluroshield</td><td>Sigma / Merck</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Kimix</td><td>ETD901</td><td></td></tr><tr><td>Filtro dicas</td><td>WhiteSci</td><td>&nbsp; 200ul (312012) e 1000ul (313012)</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico- HCl</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma/Merck</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>lítio&ndash; Tubos de coleta de heparina</td><td>O Grupo Científico</td><td>367526</td><td></td></tr><tr><td>MetaSystems - Metafer</td><td>Metasystems</td><td>Azio Imager Z2: 195-041848</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NovoPen</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-PEN</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma/Merck</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos</td> <td>salinos tamponados com fosfatoSeparações</td><td>SH30028,02</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>WhiteSci</td><td>P11037 e P1033</td><td>X-tra Clipped Corner Slides são cortadas em ângulos de 45&deg; para ajudar a reduzir a quebra do vidro.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-H2A.X Phospho (Ser139) purificado</td><td>Biolegend</td><td>613402 / 100 &mu; g</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>WhiteSci</td><td>BE12-702F</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Sigma/Merck</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Tubes (15ml)</td><td>WhiteSci</td><td>601002</td><td></td></tr><tr><td>X-Tra lâminas adesivas - SMM</td><td>Technologies</td><td>3800200E</td><td></td> com recorte de canto</tr></tbody></table>

um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-h2ax foci em linfócitos de sangue periféricos humanos

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

A radiação ionizante é um potente indutor de dano de DNA e um carcinógeno bem documentado. A dosimetria biológica compreende a detecção de efeitos biológicos induzidos pela exposição à radiação ionizante para fazer uma avaliação individual da dose. Isso é pertinente no quadro de emergências por radiação, onde avaliações de saúde e planejamento do tratamento clínico para vítimas expostas são críticos. Uma vez que as quebras de fios duplos de DNA (DSB) são consideradas a forma mais letal de dano de DNA induzido por radiação, este protocolo apresenta um método para detectar DNA DSB em amostras de sangue. A metodologia baseia-se na detecção de uma proteína fluorescente de reparação de DNA fosfoilado, ou seja, γ-H2AX. O uso de uma plataforma automatizada de microscopia para pontuar o número de focos γ-H2AX por célula permite uma análise padronizada com uma diminuição significativa no tempo de retorno. Portanto, o ensaio γ-H2AX tem o potencial de ser um dos ensaios mais rápidos e sensíveis para a dosimetria biológica. Neste protocolo, amostras de sangue inteiros de voluntários adultos saudáveis serão processadas e irradiadas in vitro, a fim de ilustrar o uso do ensaio automatizado e sensível γ-H2AX para aplicações de biodosimetria. É utilizado um sistema automatizado de varredura de slides e uma plataforma de análise com um microscópio integrado de fluorescência, que permite a pontuação rápida e automática do DNA DSB com um grau reduzido de viés.

Para este protocolo, as células mononucleares de sangue periféricos humanos (PMBCs) foram isoladas de sangue inteiro de quatro voluntários adultos saudáveis e foram expostas a doses de radiação de 0,125, 0,250, 0,500, 1.000 e 2.000 Gy. Depois disso, as amostras foram incubadas por 1 hora a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2. Após a fixação e a coloração da imunofluorescência, os slides são automaticamente digitalizados e pontuados. As figuras 6,7 e 8 dão uma representação do que o software produz para o usuário. Uma janela de análise aparece assim que a varredura é concluída, dando uma visão geral dos focos pontuados. A galeria dá todos os focos pontuados com um menu interativo que pode excluir outliers e finalmente um histograma com um resumo de dados detalhado é dado.
O rendimento de focos γ-H2AX após a exposição a raios-γ são apresentados na Figura 9. Houve um aumento gradual no número de focos γ-H2AX com dose crescente. Este gráfico não apenas ilustra a dependência da dose e sensibilidade do ensaio, mas o ajuste também pode ser usado para realizar uma estimativa de dose quando uma amostra é recebida de um indivíduo que foi exposto a uma dose desconhecida. É importante notar que não se terá controle irradiado ou níveis de focos de fundo para este indivíduo. Portanto, a Figura 9 inclui o valor 0 Gy das amostras de controle irradiadas falsas, que foi de 0,57 ± 0,23 Gy para os quatro doadores adultos neste estudo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig01.jpg"> Figura 1: Preparação de slides paracentrifugação de cito. Coloque o slide no suporte do clipe, adicione a placa de filtro em cima dele e, finalmente, o funil. Fixar os clipes de slides e colocar no citocentrifuuge. Após a citocentrifugação, remova o slide do suporte do clipe e desenhe um círculo ao redor do local com as células usando uma caneta hidrofóbica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig02.jpg"> Figura 2: A plataforma de digitalização automatizada que foi usada neste protocolo, contendo um scanner automatizado conectado a um microscópio fluorescente. Por <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig02large.jpg" target="_blank">favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig03.jpg"> Figura 3: Menu para configuração de slides. Abra o diálogo clicando no botão CONFIGURAÇÃO na barra lateral. Selecione ou insira o diretório de destino para os arquivos de resultado <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para exibir uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig04.jpg"> Figura 4: Menu de configuração do classificador. Certifique-se de que as configurações do classificador selecionados correspondam ao tipo de célula atual, às condições de preparação e aos padrões de coloração da amostra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig05.jpg"> Figura 5: Menu de configuração para janela de pesquisa manual. A janela foi selecionada na configuração de slides; um diálogo será aberto permitindo a determinação da área de varredura. Usando o objetivo de 10x, a área de pesquisa retangular no slide é selecionada interativamente fixando dois cantos do campo de pesquisa pelo clique esquerdo do mouse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig06.jpg"> Figura 6: Janela de análise, uma vez concluída a varredura, a janela de análise mostra os resultados da varredura. Por <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig06large.jpg" target="_blank">favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig07.jpg"> Figura 7: Exibição da galeria para o slide selecionado. A guia Galeria é encontrada na barra lateral. A galeria de imagens consiste em pequenas imagens das células detectadas, exibidas como uma imagem COMBINADA DAPI-TRITC. No canto inferior esquerdo e direito de cada imagem, os focos diretos contam e as contagens de focos corrigidos são exibidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig08.jpg"> Figura 8: Imagens de histograma para o slide selecionado. Esta janela é aberta clicando com o botão direito do mouse no histograma. Ao clicar no histograma, a guia histograma fornece um resumo de dados que lista a média, desvio padrão, coeficiente de variação, valores mínimos, máximos e medianos das células analisadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig09.jpg"> Figura 9: O número de γ-H2AX em função da dose para linfócitos expostos a 60raios co γ. As barras de erro são os desvios padrão que representam a variação interindividual entre os doadores. Os dados representam o número médio de focos γ-H2AX ± desvio padrão de quatro voluntários saudáveis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo apresenta a preparação do slide e a pontuação automatizada do ensaio de focos γ-H2AX em linfócitos sanguíneos periféricos. Para ilustrar o método e a sensibilidade do ensaio, linfócitos isolados foram irradiados in vitro. Este método automatizado de detecção de DSB de DNA é útil para aplicações de dosimetria biológica rápida e de alto rendimento.

Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Meu nome é Dr. Shankari Nair, e sou pós-doutorando na Divisão de Biofísica de Radiação no Departamento de Medicina Nuclear da NRF, iThemba LABS. Neste vídeo, demonstraremos o uso de um ensaio automatizado de focos Gamma H2AX em linfócitos de sangue periféricos humanos para seu uso em aplicações de simetria em lote. Os riscos de radiação para o pessoal são estritamente controlados.A radiação ionizante afeta diretamente a estrutura do DNA induzindo quebras de DNA. Particularmente quebras de dois fios. Um dos primeiros passos no processo de reconhecimento de quebra de dupla vertente de DNA é a fospohorilização da variante histona, H2AX, e o recrutamento de proteínas de reparo.Este vídeo descreverá o uso de microscopia para marcar o número de focos Gamma-H2AX ren-nucleus usando um sistema automatizado de varredura de slides e plataforma de análise, integrando o microscópio fluorescente. Linfócitos estão isolados de sangue inteiro. Diluir o sangue inteiro com PBS em uma proporção de um para um, em seguida, suavemente colocar o sangue diluído em um volume de gradiente de densidade médio.Gradualmente camada o sangue segurando o tubo inclinado a 45 graus. Transfira a suspensão para uma centrífuga e gire à temperatura ambiente por 20 minutos a 900 G.Após a centrificação quatro camadas se formarem. Transfira cuidadosamente a camada nublada contendo os linfócitos em um novo tubo cônico estéril.Lave os linfócitos com PBS e conte usando um hemócito. Uma vez determinado o número total de linfócitos, diluir o linfócito e a suspensão a uma concentração de aproximadamente 800.000 linfócitos em um mililitro de RPMI completo. As amostras estão prontas para nossa radiação.Os linfócitos são irradiados com raios gama de uma fonte de cobalto 60, e posteriormente incubados por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada de 5%. Para cada condição de irradiação ou tubo, três lâminas são preparadas. Coloque deslize no suporte do clipe, seguido pela placa de filtro e, finalmente, no funil.Fixar clipes de slides e colocar na cito-centrífuga. Adicione 250 microliters da suspensão da célula em cada funil e gire por 30 G por cinco minutos. O uso da cito-centrífuga é essencial para obter condições padronizadas na automação de slides.Uma vez girado, remova os slides do clipe e, em seguida, usando a caneta hidrofóbica, desenhe um círculo ao redor do local onde as células estão. Agora que os slides foram feitos, as células precisam ser fixadas no slide para que a coloração imunofluorescente possa ocorrer. As células são fixadas usando um paraformaldeído de 3%, ou PFA, e uma solução PBS por 20 minutos.Após a fixação, a lavagem desliza em um frasco de Coplin com PBS por cinco minutos. Em seguida, cubra as células com Triton X para permitir a permeabilização. A etapa de permeabilização remove mais lipídios de membrana celular para permitir que anticorpos entrem no núcleo celular.A partir de agora, utilizamos uma solução de bloqueio feita de 1%BSA no PBS, para lavar slides a fim de reduzir potenciais vinculações não específicas. Após três etapas de lavagem de 10 minutos com 1%BSA e PBS, os slides são incubados à temperatura ambiente com um a 500 anticorpos anti-gama primário h2AX por uma hora na câmara umidificante, facilmente realizado adicionando papel de tecido molhado na base da caixa de armazenamento de slides retangular. Após a incubação com um anticorpo primário, desmaia o líquido e lave novamente em uma solução de 1%BSA.Incubar slides com um anticorpo antitc de burro secundário diluído por uma hora na câmara umidificante. Remova o anticorpo antes de realizar três lavagens de 10 minutos em PBS. Cubra o frasco de Coplin em papel alumínio para evitar a exposição à luz durante a duração das etapas de lavagem.Remova as lâminas e limpe o excesso de PBS fora do círculo hidrofóbico com papel de tecido livre de poeira. Finalmente, adicionar uma a duas gotas de DAPI resultou em meio de montagem aquiesce e cobrir suavemente os slides com o deslizamento de tampa. Certifique-se de que não há bolhas de ar presas e, em seguida, armazene amostras em um lugar escuro a quatro graus centígrados durante a noite.Limpe suavemente slides com um etanol de 70% e coloque slides na plataforma de varredura automatizada, ou slide stage, anexado ao microscópio zite axial ZED-2. Selecione a configuração de classificação na guia MetaCyte para editar o classificador. O classificador selecionado será usado pelo sistema para digitalizar e marcar os slides, e é baseado em um conjunto de parâmetros pré-definidos, que determinará como o sistema seleciona células e escores de focos.O classificador pode ser otimizado e treinado com base em uma série de campos de imagem pré-classificados. Dependendo da ampliação do microscópio, do tipo de anticorpos que são usados para a coloração, um classificador diferente pode ser otimizado. Portanto, os classificadores geralmente variam de laboratório para laboratório, mas daremos uma visão geral das etapas mais básicas tomadas em consideração quando uma configuração de classificador tem que ser ajustada.Na guia Capture', pode-se encontrar o filtro que será usado, aqui DAPI e TRITC, com um tempo máximo de integração de 1,04 segundos. Este último é baseado no classificador original fornecido pela empresa e posteriormente ajustado para a intensidade do anticorpo e fundo gama H2AX, ou sinal TRITC, neste tipo de célula específica, ou seja, linfócitos. Na guia Exposição, o tempo mínimo de integração é definido.O classificador permanecerá sempre dentro do tempo mínimo e máximo de integração, o que impede a exposição excessiva ou inferior do slide. Na guia Seleção celular, as áreas mínimas e máximas do objeto foram definidas com base no tamanho e forma das células que são analisadas. Por exemplo, o valor de concavidade pré-determinado e a proporção são específicos para linfócitos, que geralmente têm formas redondas.Na guia Recursos, você pode alterar a visualização da galeria e do histograma, bem como determinar o que o microscópio precisa para marcar. O sistema pode marcar inúmeros itens, dependendo dos recursos selecionados pelo usuário. Um exemplo é o limiar de como o software pontua objetos individuais.Uma vez identificado um classificador adequado, selecione a configuração na barra lateral e dê a cada slide um nome único, seguido pela seleção do classificador apropriado. Selecione contagem máxima de células e adicione o número máximo de células necessárias para serem digitalizadas. A pesquisa é encerrada mesmo que a janela de pesquisa selecionada ainda não tenha sido digitalizada completamente, assim que a contagem de células máximas for atingida.Para aplicações de biossimetria, a pontuação automatizada de 1000 células por slide é suficiente, considerando que três slides por amostra de sangue são preparados. Clique em OK'para confirmar as configurações. Para digitalizar slides, selecione Pesquisar na barra lateral.Se a configuração Janela de pesquisa manual for selecionada na configuração de slides, uma caixa de diálogo abrirá uma linha para determinar a área de digitalização. Ao usar o objetivo de 10 vezes, a área de pesquisa retangular no slide é selecionada interativamente fixando dois cantos do campo de pesquisa pelo clique esquerdo do mouse. Isso pode ser confirmado com o botão OK'.Ajuste uma posição de partida de foco. O software solicitará um foco e centralizará um núcleo de referência usando o objetivo de 40 vezes para cada slide e confirmará as configurações com OK. O sistema se moverá automaticamente para todos os lados sequencialmente. Se necessário, ajuste o tempo de configuração de imagem ao vivo e o tempo de integração para esta etapa.Verifique todas as configurações do microscópio. Certifique-se de que a alavanca do tubo de microscópio está em uma posição que desvia toda a luz para a câmera e confirme o prompt do sistema com OK. O sistema inicia o foco automático da grade na posição da grade mais próxima do campo de referência. Ele continua a se concentrar na grade regular, movendo-se em uma mesmã em direção à frente e na parte de trás da janela de busca.A varredura começa quando o foco automático da rede é concluído. O estágio é movido em um campo de padrão de meandro após campo para capturar dados. Quando uma célula é detectada, ela é posicionada e a imagem da galeria é armazenada e exibida na tela e a contagem de células é atualizada.A pesquisa é encerrada se toda a pesquisa tiver sido digitalizada, se a contagem máxima de células foi atingida ou se a pesquisa foi cancelada. Quando a varredura estiver concluída, clique com o botão direito do mouse na barra na parte inferior e abra uma amostra. Revise a galeria, que consiste em pequenas imagens de células detectadas.Nesta janela você pode especificar as células armazenadas na galeria por critério a ser escolhido no menu suspenso. As células são geralmente exibidas na ordem das quais foram detectadas. Clique em Quality Histogram'or Feature Value Diagram'para dar a distribuição das células detectadas, bem como os meios, e o desvio padrão de focos pontuados.Aqui comparamos o cinza zero versus 1,5 amostras cinza. Este é tipicamente um slide de controle, com um valor médio de 0,124 focos por célula, onde a célula não foi irradiada. Em um contexto de biossimetria, isso indicaria que uma pessoa não foi exposta a uma radiação de alta dose.No gráfico, podemos ver que a maioria das células tem quase zero de focos por célula, e não há lado da distribuição normal. Quando comparamos isso com uma dose de 1,5 cinza, pode-se ver claramente que esta é uma amostra irradiada. Em um contexto de bio-dissimetria, essa distribuição normal é um sinal claro de que a amostra foi exposta à radiação.A varredura automatizada é sensível o suficiente para detectar focos induzidos em doses baixas. Os resultados mostram um claro aumento linear do número de focos por célula com dose. O método automatizado de detecção de quebra dupla de fios de DNA é útil para aplicações de dissimetria biológica de rendimento rápido e alto.Obrigado por assistir.

an-automated-microscopic-scoring-method-for-h2ax-foci-assay-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

Análise microscópica de γH2AX focos, que formam após a fosforilação de H2AX em Ser-139 em resposta ao DNA dupla fita-breaks, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui usamos um anticorpo mono-metilado histona H3 em lisina 4 como um marcador epigenético ativamente de eucromatina transcrever, para avaliar a distribuição espacial da radiação induzida por formação γH2AX dentro do núcleo.

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de imunofluorescência para detectar proteínas específicas de resposta a danos no DNA localizadas nos locais de quebras de fita dupla de DNA em células mononucleares humanas. As proteínas são reconhecidas por anticorpos primários específicos, que por sua vez se ligam a anticorpos secundários marcados com fluoróforo que fluorescem durante a visualização microscópica, permitindo a visualização das proteínas como focos fluorescentes distintos dentro...

Microscopia de imunofluorescência para análise de quebras de fita dupla de DNA

Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

O ensaio de micronúcleos in vitro é um método bem estabelecido para avaliar a genotoxicidade e a citotoxicidade, mas marcar o ensaio utilizando a microscopia manual é trabalhoso e sofre de subjetividade e variabilidade interscorer. Este papel descreve o protocolo desenvolvido para executar uma versão inteiramente automatizada do ensaio usando a citometria do fluxo da imagem latente Multispectral.

Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente estabelecida. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.

Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos

Aprenda a realizar o ensaio automatizado de γ-H2AX foci em linfócitos de sangue periférico humano para dosimetria biológica. Este método utiliza microscopia de fluorescência automatizada para detectar quebras de dupla fita no DNA induzidas por radiação ionizante de forma rápida e sensível.

Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos

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