Modelo Biomimético Tridimensional In Vitro de Neuroblastoma Utilizando Arcabouços à Base de Colágeno

Este artigo lista as etapas necessárias para semear linhagens celulares de neuroblastoma em arcabouços tridimensionais à base de colágeno previamente descritos, manter o crescimento celular por um período de tempo pré-determinado e recuperar arcabouços para várias análises de crescimento e comportamento celular e aplicações a jusante, adaptáveis para satisfazer uma variedade de objetivos experimentais.

Nosso protocolo oferece um modelo de bioengenharia 3D que afeta de perto o tecido nativo. Isso pode ser potencialmente usado para descobrir novas terapêuticas e biomarcadores para o tratamento e diagnóstico do neuroblastoma. A principal vantagem é que cria condições experimentais fisiologicamente mais relevantes para estudar o microambiente tumoral usando uma técnica reprodutível que atinge a consistência lote a lote.

Nosso método de andaime pode ser utilizado, em primeiro lugar, para identificar novas terapêuticas para o neuroblastoma e, em segundo lugar, para incorporar células derivadas do paciente para melhor predição da resposta individual do paciente. Para começar, coloque o andaime armazenado em PBS na capela de fluxo laminar. Use pinças estéreis para levantar suavemente o andaime do canto e pressione contra a parede lateral para remover o excesso de PBS.

Em seguida, coloque o andaime com a camada brilhante voltada para baixo no centro do poço de uma placa de 24 poços não aderente. Rotule a placa com detalhes da linha celular, densidade de semeadura e pontos de tempo. Trabalhe com as células de uma densidade de semeadura de cada vez e mantenha as células restantes a 37 graus Celsius na incubadora, até que estejam prontas para uso.

Para a fixação da célula no andaime, use uma pipeta P20 com pontas estéreis para misturar completamente a suspensão celular e adicione 20 microlitros da suspensão celular relevante no centro de cada andaime, garantindo que a suspensão da célula permaneça no topo do andaime e não na parede lateral ou base do poço. Deixe as células se ligarem por três a cinco horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. No final da incubação, use uma pipeta P1000 para adicionar lentamente um mililitro de meio de crescimento pré-aquecido a cada poço, evitando o deslocamento dos andaimes, e incube a placa durante a noite.

Observe os scaffolds, inicialmente, a cada dois ou três dias para mudanças de cor do meio de crescimento à medida que as células proliferam dentro do scaffold. Use uma pistola de pipeta de 10 mililitros com modo lento para remover e descartar um mililitro do meio gasto do poço. Quando o meio condicionado for usado para o experimento, colete o meio gasto das réplicas biológicas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e espalhe os detritos celulares por centrifugação.

Transfira o sobrenadante para um tubo fresco e armazene o tubo a menos 80 graus Celsius. Depois de colocar a pistola de pipeta no modo de gotejamento, adicione suavemente dois mililitros de meio de crescimento pré-aquecido aos andaimes. Incubar a placa contendo o andaime e reabastecer o meio fresco durante o período de crescimento desejado, conforme demonstrado.

Na capela de fluxo laminar, esterilize o reagente apropriado do ensaio de viabilidade celular por filtração através de um filtro estéril de 0,2 micrômetro em um tubo de centrífuga. Pré-aqueça a solução estéril, o meio de crescimento completo e o PBS estéril em banho-maria, a 37 graus Celsius. Usando pinças estéreis, transfira os andaimes a serem analisados em uma placa fresca de 24 poços e rotule a placa com todos os detalhes relevantes.

Adicione 900 microlitros do meio de crescimento pré-aquecido a cada poço. Em seguida, adicione 100 microlitros do reagente de viabilidade celular estéril a cada poço. Para um controle negativo, adicionar 900 microlitros de meio e 100 microlitros do reagente de viabilidade celular estéril em um poço sem arcabouço.

Substitua a tampa da placa e agite suavemente a placa por aproximadamente três minutos para distribuir o reagente de viabilidade celular diluída por todo o poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Após retirar a placa da incubadora, agite-a suavemente por alguns segundos e gere as triplicatas, conforme demonstrado no manuscrito do texto.

Gere as triplicatas técnicas transferindo 100 microlitros do meio incubado e reagente de um poço da placa de 24 poços para um poço da placa translúcida de 96 poços, e execute esta etapa um total de três vezes para um poço. Cubra a placa de 96 poços com folha de alumínio para proteger o reagente de viabilidade celular da luz. Retire e descarte os 700 microlitros restantes de meio e reagente dos andaimes na placa de 24 poços.

Lave cada andaime duas vezes com um mililitro de PBS estéril. Use um leitor de microplacas para medir a absorbância em 570 e 600 nanômetros e calcular a redução percentual dos reagentes de viabilidade celular de acordo com as recomendações do fabricante. Analisar estatisticamente os resultados de viabilidade celular, utilizando software apropriado.

Insira os valores de triplicata biológica para produzir barras de erro e indicar a variabilidade do ensaio. Realizar um teste de análise de variância unidirecional para examinar as mudanças na viabilidade celular ao longo do período experimental usando software bioestatístico apropriado. Indicar diferenças significativas entre os pontos de tempo nos gráficos, conforme descrito no texto manuscrito.

A viabilidade de duas linhagens celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas nos scaffolds, foi avaliada. O aumento da densidade celular resultou em maior redução da viabilidade celular reagente com o tempo. O crescimento celular nos scaffolds foi medido indiretamente pela quantificação do DNA extraído dos scaffolds, e as células por amostra foram calculadas.

As células IMR32 apresentaram aumento do crescimento, depois as células KellyLuc, com o tempo. A morfologia de crescimento e a distribuição das células nos scaffolds foram avaliadas visualmente pela coloração de hematoxilina, eosina e imunohistoquímica. As células KellyCis83 cresceram mais rápido e infiltraram-se mais profundamente em ambas as composições do andaime do que a linhagem celular Kelly menos invasiva.

IMR32 cultivado em nano-hidroxiapatita demonstrou um padrão de crescimento contrastante com grandes aglomerados densamente compactados, ao longo de 14 dias. As características célula-específicas foram monitoradas por coloração imunoistoquímica, seguida de faloidina e DAPI, e a abundância de actina foi observada em células Kelly e KellyCis83 em scaffolds de colágeno-glicosaminoglicanos. Para a avaliação da atividade celular in vitro, os níveis secretados de cromogranina A foram medidos, e as células cultivadas em scaffolds de colágeno-glicosaminoglicano e nano-hidroxiapatita produziram mais cromogranina A em comparação com o crescimento em cultura 2D convencional.

A linhagem celular KellyCis83 quimio-resistente secretou mais cromogranina A do que a linhagem celular Kelly. Após a fixação celular, as células podem ser tratadas com várias terapêuticas. Isso forneceria resultados fisiologicamente mais relevantes para a resposta das células a drogas do que a cultura 2D convencional.

Essa técnica permite que os pesquisadores explorem melhor como as células cancerosas se comportam e reagem a um estímulo dentro do microambiente tumoral, variando de resposta a terapêutica ou interações com outros tipos celulares.