Aplicação de CRISPR Interference (CRISPRi) para Silenciamento genético em espécies patogênicas de Leptospira

Meu nome é Jarlath Nally, e faço parte da equipe de pesquisa aqui no Centro Nacional de Doenças Animais em Ames, Iowa, e trabalhamos em leptospirose. Leptospirose é uma doença negligenciada. É uma doença global.

E realmente, temos uma compreensão muito limitada de como esse grupo único de bactérias causa infecção. Portanto, a apresentação de hoje é sobre fornecer uma visão geral de uma nova ferramenta que está disponível para facilitar a avaliação de mecanismos patogênicos de leptospirose, silenciando especificamente genes específicos expressos por leptospira, usando uma técnica chamada interferência CRISPR. No entanto, a capacidade de selecionar colônias de newton é muito dependente de fornecer a melhor mídia de crescimento para esses leptospirais exigentes.

Então, em primeiro lugar, vamos apresentá-lo a Rick Hornsby, que foi muito brevemente introduzir uma nova mídia para propagar essas bactérias exigentes. E então vamos apresentá-lo a Louis Fernandez, que vai falar sobre a metodologia de interferência CRISPR para silenciar genes alvo dentro de leptospira. Oi, sou Rick Hornsby.

Desde sua identificação por Anada há mais de 100 anos, os leptospiras têm sido tipicamente isolados e propagados a 29 graus Celsius, uma temperatura que não reflete nem o ambiente nem a temperatura corporal hospedeira dos mamíferos. Há 10 anos, o USDA ERS começou a pesquisar melhorias na mídia leptospira e, a partir desta pesquisa, a mídia Hornsby-Alt-Nally foi desenvolvida. Usando essa mídia, médicos e pesquisadores têm sido capazes de isolar e propagar mais rapidamente leptospiras de casos de campo e em pesquisas in vitro a uma temperatura e em um ambiente que emula mais de perto o hospedeiro mamífero.

Continuamos a otimizar essa mídia, mas do jeito que está, a HAN demonstrou potencial para melhorar significativamente os isolamentos clínicos veterinários e humanos na pesquisa in vitro e o desenvolvimento de vacinas mais eficazes para a prevenção da leptospirose. Oi, sou Louis Fernandez. Até agora, a patogênese da leptospirose permaneceu sub-explorada, principalmente devido à falta de tubos genéticos eficazes e fáceis de realizar.

Aqui vamos descrever uma nova técnica chamada interferência CRISPR ou CRISPRi. E essa técnica é muito simples porque só precisamos expressar dois componentes, uma proteína de ligação de DNA chamada Cas9 morto, ou dCas9, e uma molécula quimrica de RNA chamada RNA de guia único. E o complexo dCas9 e guia RNA vão fazer emparelhamento base ao nosso gene alvo e, portanto, reduzir ou até mesmo bloquear a transcrição.

Também usando a mídia han recém-descrita, poderíamos reduzir drasticamente o tempo de formação de colônias para uma recuperação mutante. O primeiro passo é definir o protoespaço que estará contido no RNA guia. Esta sequência compreende 20 nucleotídeos que definirão o emparelhamento base aos alvos genéticos desejados.

Envie uma sequência de nucleotídeos para o servidor web CHOPCHOP, com parâmetros definidos para estreptococo pyogenes, Cas9 e protoespaçor motivo adjacente, NGG. Com base nos resultados, selecione protoespaços com as melhores pontuações dentro da tendência menos. O motivo NGG não será incluído na sequência final.

Temos usado o promotor lipL32 para expressar o RNA de guia único, que conterá a variável 20 nucleotídeos em cinco primes em um andaime dCas9 conservado. Depois de obter o ele será relegado para o PMaOri. dCas9 plasmid no site de restrição do Xma1.

Para conjugação, as células leptospiras são cultivadas a 29 ou 37 graus celsius na mídia HAN. Um dia antes da conjugação, as células equalizadas por doadores são cultivadas em mídia LB suplementadas com ácido diaminopimelico, DAP e espectinicina. Em seguida, no dia da conjugação grill as culturas Saturadas E.coli em LB mais DAP.

Dentro de uma capa de bio segurança, montou o aparelho de filtragem colocando o filtro de membrana em cima da base de vidro, seguido por um funil de vidro de 15 ML. Ambas as peças são mantidas juntas por este grampo de mola. Em seguida, conecte o vidro a uma bomba de vácuo, adicione cinco ML de culturas leptospira ao funil.

Em seguida, adicione a cepa E.Coli beta 2163 contendo o plasmid de interesse. O volume vai variar de acordo com a densidade óptica da cultura. Estamos mirando a pipersão de células um-para-um.

Gire a bomba de vácuo, agora os líquidos vamos passar pela membrana e as células estarão concentradas em cima dela. Pegue o filtro e coloque-o na placa EMJH mais DAP, lado bicurier para cima. Incubar as placas a 29 graus celsius por 24 horas.

Em seguida, recupere os filtros das placas e coloque-os em tubo cônico de 50 ML. Use um ML de mídia HAN líquida para recuperar as células do filtro por pipetação. Visualize as células recuperadas por microscopia de campo escuro.

Nesta fase, podem ser vistos números equivalentes de E.coli e leptospiras. 100 a 200 microliters são usados para espalhar as bactérias em placas HAN contendo espectincina. Nesta fase, o DAP é omitido e e.coli não crescerá.

As placas são incubadas a 37 graus celsius e 3%de CO2. Colônias devem ser aparentes entre oito a dez dias. Colônias interrogadas leptospira são um pouco complicadas de visualizar.

Aqui estamos mostrando colônias crescidas para facilitar a sua opinião. Adicione 100 microliters de HAN líquido, a tubos de 1,5 ML para recuperar os mutantes. Recomenda-se tirar pelo menos três colônias de cada prato.

Usando uma ponta de pipeta, colônias individuais serão recuperadas das placas. Espera-se que Agger seja levado sozinho. As colônias devem ser retiradas das placas de controle contendo MTP PMaOri.

dCas9 plasmid. E placas com leptospiras contendo plasmídeos com dCas9 e guia RNA projetado para o gene alvo. As células recuperadas agora podem ser visualizadas sob microscopia de campo escuro para confirmar a presença de leptospiras viáveis.

Após a visualização de leave leptospiras, transfira células para mídia han líquida contendo espectincina. Após o crescimento da cultura, as células podem ser recuperadas para silenciar a confirmação e a avaliação do fenótipo. Se anticorpos contra as proteínas alvo estiverem disponíveis, o imunoblot é uma metodologia direta para avaliar o silenciamento.

Leptospiras contendo pMAOri. dCas9 sozinho, ou com o guia RNA Cas são avaliados por PCR, primers de flanqueamento de madeira. O plasmídeo DMT resultará em uma banda de aproximadamente 300 pares de base e um único tipo de cerca de 700 é atingido quando o guia RNA está presente.

Os imunoblots usando extratos celulares inteiros são realizados para a confirmação de silenciamento, a expressão proteica lipL32 é abolida em células contendo plasmídeos expressos em dCas9 e guiar o RNA visando este gene. E ambos os elos a e link B estão ausentes em células que contêm o RNA guia, é específico para ambos os genes. O lipL41 de controle pode ser visto em todas as pistas.

Então usamos interferência crispr em interrogadores leptospira, nós também usamos em várias espécies patogênicas adicionais de leptospira. Nós o usamos para silenciar genes específicos, bem como silenciar a expressão de pequenas RNAs não codificadas. Nosso interesse de pesquisa é entender mecanismos patogênicos de infecção, por isso normalmente procuramos identificar fatores de variância, mas obviamente você pode silenciar seu próprio gene de escolha e de acordo com sua própria área de pesquisa.

E, por exemplo, isso pode ser motilidade ou compreensão de como os leptospiras persistem no ambiente, ou metabolismo. De qualquer forma, você deve ser capaz de gerar um mutante específico que lhe permitirá realizar genômica funcional e entender o significado biológico do gene em questão. Então, de todos nós aqui no Centro Nacional de Doenças Animais, desejamos a vocês muita sorte com sua pesquisa.